第三章 第一节 第2课时 PCR技术和利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定-【优化探究】2025-2026学年新教材高中生物学选择性必修3同步导学案配套PPT课件（苏教版）

基因工程 第三章　 第一节　基因工程及其技术 第2课时　PCR技术和利用PCR技术扩增DNA片 段并完成电泳鉴定 [目标导学]　1.简述PCR的原理、步骤及应用。2.尝试进行PCR的基本操作并电泳鉴定PCR的产物。 内容索引 NEIRONGSUOYIN 学习任务二　利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定 学习任务一　聚合酶链式反应(PCR)技术 课时作业 素养达标 备选题库 教师独具 聚合酶链式反应(PCR)技术 学习任务一 梳理 归纳教材知识 1.含义:聚合酶链式反应简称 ,是目的DNA片段(目的基因)的体外扩增技术。 2.原理:DNA分子半保留复制。 3.操作步骤:在向PCR管中加入一定量的 、引物对、4种 、缓冲液和热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)、 等后,设置好反应程序,启动PCR仪,它会自动完成反应步骤。 PCR 模板DNA dNTP Mg2+ 4.反应步骤 步骤 说明 图解 变性 在约94 ℃高温下,作为模板的双链DNA (变性)为两条单链DNA 退火 反应体系的温度降至约55 ℃,2条 分别与对应单链DNA上的特定部位配对 解旋 引物 步骤 说明 图解 延伸 反应体系的温度回升到约72 ℃(Taq酶催化作用的最适反应温度),4种脱氧核苷三磷酸根据碱基互补配对原则,在 的作用下连接到引物 端之后,使引物链延伸,并形成互补的DNA双链 Taq酶 3' 完成上述第一次循环后,PCR仪会按设定接着进行第二次、第三次……循环。 5.PCR技术的应用 (1)广泛应用于医学及分子生物学领域,如:病原体鉴定、 、免疫学研究、癌基因探索及某些疾病治疗等。 (2)在古生物学、法医学等方面也有广泛的应用。 遗传病诊断 [正误辨析] (1)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。 ( ) (2)PCR技术中,DNA模板链上碱基G和C的比例越高,DNA变性解链的温度就越高。 ( ) (3)PCR需要热稳定的DNA聚合酶、解旋酶、4种dNTP和DNA模板之外,还需要引物等基本条件。 ( ) (4)PCR的引物为DNA片段并保留在子链中,细胞核内DNA复制所需引物为RNA片段,并且不保留在子链中。( ) √ √ √ × 探究 要点合作突破 图1、图2分别表示PCR扩增技术相关过程,请思考并回答下列问题。 (1)请完善图1中的信息。 变性　 退火　 延伸 (2)高温变性的目的是使　 　　　　　　　。  (3)PCR所需引物是依据　　 　　的一段已知序列设计而成的,图1中引物A与引物B　　　(填“相同”或“不同”),其在PCR过程中　　　(填“能”或“不能”)重复利用。  (4)DNA复制时为什么需要引物? 提示:在DNA扩增时,DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3'端延伸DNA链,因此DNA复制时应加入两种引物。 双链DNA解旋为单链 目的基因 不同 不能 (5)图1所示利用PCR技术扩增目的基因,从第几轮循环才会产生完整的目的基因(可以用相关图解解释)? 提示:第3轮,如图所示。 (6)图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，它们都不合理,请分别说明理由。 提示:第1组:引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对导致失效。第2组:引物Ⅰ'自身折叠后会出现局部碱基互补配对导致失效。 (7)若要保证目的基因与载体相连接,还要对引物进行什么操作? 提示:要在两种引物的5'端分别添加上特定的限制酶的识别序列。 (8)如果循环n次,则共需消耗多少对引物? 提示:共需消耗(2n-1)对引物。 [核心知识] PCR中的数量关系 循环次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物的DNA分子数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1 同时含两种引物的DNA分子数 0=21-2 2=22-2 6=23-2 2n-2 循环次数 1 2 3 n 共消耗引物的对数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1 含等长脱氧核苷酸链的DNA分子数 0=21-2 0=22-4 2=23-6 2n-2n 强化 题点对应训练 1.PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术,下列叙述错误的是(　　) A.PCR需要在一定的缓冲溶液中才能进行 B.PCR所用的解旋酶和DNA聚合酶都具有耐高温的特性 C.PCR一般要经历三十多次循环,每次循环可以分为变性、退火和延伸三步 D.若以某一DNA片段作为模板,5次循环后理论上反应物中应有32个这样的DNA片段 B 解析:PCR需要在一定的缓冲溶液中才能进行,加入缓冲液，主要是为酶提供需要的相关Mg2+以及其他辅助因子,以模仿其最适的扩增条件,A正确;PCR技术中通过高温解旋,不需要采用解旋酶,B错误;PCR一般要经历三十多次循环,每次循环可以分为变性、退火和延伸三步,C正确;若以某一DNA片段作为模板,5次循环后理论上反应物中应有25=32个这样的DNA片段,D正确。 2.(多选)荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量,其原理是在PCR体系中每加入1对引物的同时加入1个与某条模板链互补的荧光探针,当Taq酶催化子链延伸至探针处会水解探针,使荧光监测系统接收到荧光信号,即每扩增1条链,就有1个荧光分子生成。下列相关叙述错误的是 (　　) A.图示引物与探针均具有特异性,与模板结合时遵循碱基互补配对原则 B.Taq酶催化子链从3'端向5'端延伸,需要dNTP作为原料 C.若用上述技术检测某基因的转录水平,则需要用到逆转录酶 D.原料充足时,反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈负相关 答案:BD 解析:图示引物与探针均为根据某条模板链设计的单链DNA,因而具有特异性,与模板结合时遵循碱基互补配对原则,A正确;根据图示中引物延伸的方向可以确定Taq酶可以催化子链由5'端向3'端延伸,需要dNTP作为原料,B错误;若要用上述技术检测某基因的转录水平,需要以某基因转录形成的mRNA为模板逆转录形成DNA再进行PCR的扩增,因此要用到逆转录酶,C正确;由题干信息“每加入1对引物的同时加入1个与某条模板链互补的荧光探针”“每扩增1条链,就有1个荧光分子生成”可知,原料充足时,反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关,D错误。 利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定 学习任务二 梳理 归纳教材知识 1.实验目的 (1)尝试运用PCR仪扩增DNA片段。 (2)关注PCR技术的应用。 (3)学习 检测DNA片段的方法和技术。 琼脂糖凝胶电泳 2.实验原理 (1)PCR类似于DNA的天然复制。扩增DNA片段的过程包括__________ 等步骤的多次循环。理论上,每经过一个循环,样本中DNA片段的数量增加 ,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过n个循环后,DNA片段数量可扩增至原先的 倍。 (2)典型的PCR反应体系包括:DNA模板、 、dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、人工合成的DNA引物对、 等。 变性、 退火和延伸 一倍 反应缓冲液 2n Taq酶 (3)本实验是以大肠杆菌K12DNA为模板,运用PCR仪扩增碱性磷酸酶基因(AKP)。 (4)在不同阶段,还需要控制PCR仪反应系统的 温度。 不同 (5)PCR和体内DNA复制的差异 比较项目 PCR 细胞核内DNA复制 场所 试管中 细胞内 方式 半保留全连续局部区域复制 半保留 全链复制 起始位点 引物 端 复制起始位点 酶 仅一种DNA聚合酶( 酶) 多种酶 半不连续 3' Taq 比较项目 PCR 细胞核内DNA复制 反应条件 温度变幅大 温和 解旋 高温解旋 解旋 引物 片段,保留在复制的子链中 片段,不保留在复制的子链中 产物 引物界定的片段 核基因组 循环次数 人为设置 与细胞分裂同步 解旋酶 DNA RNA 3.实验器材和试剂 (1)引物:大肠杆菌K12AKP的正向引物和反向引物序列交由生物公司合成相应的引物对: 正向引物为5' GTCGCGGATCCATGTCACGGCCGAGAC 3' (BamH Ⅰ); 反向引物为5' GCGACAAGCTTTATTTCAGCCCCAGAG 3' (Hind Ⅲ); 引物溶液的物质的量浓度:10 μmol·mL-1。 (2)仪器:PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或 、微孔加热器(微量恒温仪)。 (3)试剂:DNA模板、dNTP混合物、Taq酶、双蒸水、10×PCR缓冲液。 紫外透射仪 4.实验步骤 (1)PCR扩增目的基因AKP ①在0.2 mL PCR管内配置50 μL反应体系。 所加试剂 体积 dNTP混合物(2.5 mmol·mL-1) 4 μL 10×PCR缓冲液 5 μL 正向引物(10 μmol·mL-1) 2 μL 反向引物(10 μmol·mL-1) 2 μL 模板DNA 1 μL Taq酶 1 μL(1U) 双蒸水 35 μL ②设置程序进行扩增。 步骤 温度 作用 时间 ① 94 ℃ 预变形 5 min ② 94 ℃ 变性 1 min ③ 55 ℃ 退火 1 min ④ 72 ℃ 延伸 2 min ⑤ 重复步骤②~④,30个循环 ⑥ 72 ℃ 延伸 7~10 min (2)电泳分析 ①电泳鉴定实验原理 a.DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。 b.在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。电泳时,DNA分子的相对分子质量越大,受到的阻力越大,迁移速率越慢;反之,越快。 c.采用 观察和记录电泳结果。 凝胶成像仪或紫外透射仪 ②结果分析 a.大肠杆菌K12AKP长1 482 bp,电泳结果显示长度正确。 b.DNA相对分子质量标准(2 000、1 000、750、500、250、100 bp)。 c.图中1为DNA Marker DL2 000, 2~3为大肠杆菌K12碱性磷酸酶基 因AKP。 d.缺点:只能作定性分析,不能准确 定量。易造成污染出现假阳性,使 其应用受到限制。 [正误辨析] (1)DNA分子的大小影响其在凝胶中的迁移速率。 ( ) (2)PCR循环之前,常要进行一次预变性,预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率。 ( ) (3)利用PCR扩增DNA片段时,在每一次循环的变性之前,通常要用94 ℃的高温处理反应液5 min进行预变性。( ) √ √ × 1.在电泳鉴定中,如何判断DNA片段扩增成功。 提示:可以通过凝胶成像仪或紫外透射仪直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。 2.试分析PCR反应中变性时温度低、时间短和退火时的温度过低对实验结果分别产生什么影响。 提示:变性时温度低、时间短可能导致未出现扩增条带;退火时的温度过低可能导致出现非特异性扩增条带。 探究 要点合作突破 [核心知识] 1.未出现扩增条带的主要原因 (1)Taq酶失活。 (2)引物出现质量问题。 (3)Mg2+浓度过低。 (4)变性时的温度低,变性时间短。 2.出现非特异性扩增条带的主要原因 (1)模板DNA出现污染。 (2)引物特异性不强或形成引物二聚体。 (3)Mg2+浓度过高。 (4)退火时的温度过低等。 1.(多选)下列关于核酸片段的扩增及电泳鉴定的相关叙述,正确的是(　　) A.PCR反应缓冲液中一般要添加ATP,以激活热稳定的DNA聚合酶 B.mRNA也是核酸,因此可以直接用PCR扩增仪扩增 C.PCR产物常通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定 D.电泳结果可采用凝胶成像仪或紫外透射仪观察和记录 强化 题点对应训练 CD 解析:热稳定的DNA聚合酶不需要添加ATP激活,A错误;mRNA是核酸,但不能直接用PCR扩增仪扩增,需要先反转录为cDNA再用PCR扩增仪扩增,B错误;PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定,C正确;电泳结果可采用凝胶成像仪或紫外透射仪观察和记录,D正确。 2.在基因工程操作中,科研人员利用两种限制酶(R1和R2)处理基因载体,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,结果如图所示。下列相关叙述错误的是(　　) A.DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象等有关 B.该载体最可能为环状DNA分子 C.限制酶R1与R2的切点最短相距约400 bp D.两种限制酶在载体上识别的序列不相同 C 解析:凝胶的浓度越大,DNA分子越大,DNA分子的迁移速率越慢,同时DNA构象也影响迁移速率,A正确;由题图可知,当仅用一种限制酶切割载体时,仅产生一种长度的DNA片段,因此该载体最有可能为环状DNA分子,B正确;两种限制酶同时切割时产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段,所以两种限制酶的酶切位点至少相距200 bp,C错误;当仅用一种限制酶切割载体时,两种限制酶切割产生的DNA片段等长,而两种限制酶同时切割时则产生两种不同长度的DNA片段,所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点,识别的序列不相同,D正确。 备选题库 教师独具 1.下列关于PCR的叙述,正确的是 (　　) A.PCR是体外复制DNA技术,关键酶是解旋酶和DNA聚合酶 B.DNA聚合酶从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸 C.第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段 D.延伸过程需要酶、ATP和4种核糖核苷酸 C 解析:PCR体外复制DNA不需要解旋酶,需要耐高温的DNA聚合酶,A错误;DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,B错误;第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段,这段固定长度的序列的数量呈指数扩增,C正确;PCR是在较高温度条件下进行的,该过程需要耐高温的DNA聚合酶,且PCR反应的产物是DNA,原料是4种dNTP,不是核糖核苷酸,也不需要ATP,D错误。 2.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段,若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”,需在PCR反应中加入两种引物,两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子,如图2所示,其中第⑤种DNA分子有几个 (　　) A.2　　　　 B.4 C.6 D.8 D 解析:该DNA复制4次共形成16个DNA,其中①②分别有1个,③④分别有3个,⑤有8个,D正确。 3.(多选)一种双链DNA分子被三种不同的限制酶切割,切割产物通过电泳分离,用大小已知的DNA片段的电泳结果作为分子量标记(图中左边第一列)。关于该双链DNA,下列说法正确的是 (　　) A.呈线性结构 B.该DNA长度为10 kb C.有1个NotⅠ和2个EcoRⅠ酶切位点 D.其NotⅠ与EcoRⅠ酶切位点的最短距离为2 kb BC 解析:用EcoRⅠ酶切和EcoRⅠ+NotⅠ双酶切时产生的结果不同,说明DNA含有NotⅠ酶切位点,用NotⅠ酶切只产生了一个10 kb的条带,所以该DNA分子是环状的,且长度一定是10 kb,A错误,B正确;用NotⅠ酶切只产生了一个10 kb的条带,说明该环状DNA上只含有一个NotⅠ酶切位点,单用EcoRⅠ酶切后产生了4 kb和6 kb两个条带,说明该环状DNA上含有2个EcoRⅠ酶切位点,C正确;用EcoRⅠ酶切后产生的4 kb的片段,进一步被NotⅠ酶切为3 kb和1 kb的片段,可以得知NotⅠ切点与EcoRⅠ切点的最短距离为1 kb,D错误。 4.PCR已成为分子生物学实验室里的一种常规技术,其原理是利用DNA的半保留复制,在试管中进行DNA的人工复制(如图)。该技术可在很短的时间内,将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍,使实验所需要的遗传物质可从生物体外获得。 (1)加热至94 ℃可使DNA双链打开,这一步是打开　　键,这一过程称为　　　　。  (2)当温度降低时,引物与模板的　　端结合,在耐高温的DNA聚合酶的作用下,引物沿模板延伸,最终合成两个DNA分子,此过程中原料是 　　　　　,遵循的原则是　 　　　　　。  (3)PCR技术的必要条件,除了模板、引物、原料、酶,至少还需要三个条件,即液体环境、适宜的　 　和　 　,前者由PCR仪自动调控,后者则靠　　　　来维持。  (4)在PCR反应过程中,DNA的复制需要引物,其主要原因是____________ 　　　 　　。  氢 变性 3' 四种dNTP 碱基互补配对原则 温度 酸碱度(pH) 缓冲液 酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3'端延伸DNA链 DNA聚合 解析:(1)DNA双链是通过碱基对之间的氢键连接的,加热使DNA双链打开,就是打开碱基对之间的氢键,这一过程称为变性。 (2)当温度降低时,两种引物均与相应模板的3'端结合,在耐高温的DNA聚合酶的作用下,引物沿模板延伸,最终合成两个DNA分子,此过程中原料是四种dNTP,遵循的原则是碱基互补配对原则。 (3)PCR扩增DNA的过程与细胞内DNA的复制过程类似,除了模板、引物、原料、酶,至少还需要三个条件,即液体环境、适宜的温度和酸碱度(pH),温度由PCR仪自动调控,酸碱度(pH)则靠缓冲液来维持。 (4)引物是一小段能与母链的一段碱基序列互补的DNA或RNA,DNA的复制需要引物,其主要原因是DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3'端延伸DNA链。 课时作业 素养达标 [基础巩固练] 1.PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。下列有关PCR过程的叙述,正确的是(　　) A.待扩增的DNA两条链的解旋过程需要酶的催化 B.所用引物的长度越短,与模板链结合的特异性越强 C.在子链的形成过程中,dNTP可以提供原料和能量 D.与细胞内DNA复制相比,PCR所需要的酶对高温比较敏感 C 解析:PCR扩增DNA时,DNA两条链的解旋过程是通过高温来实现的,A错误;合理范围内引物越长,能够配对的概率越低,与模板链结合的特异性越强,B错误;dNTP包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP,在子链的形成过程中,可以提供原料和能量,C正确;PCR所需要的酶为热稳定的DNA聚合酶,能耐高温,D错误。 2.在PCR反应体系中,加入过量的只与双链而不与单链DNA结合的荧光染料可用来鉴定扩增结果,该染料在游离状态不发出荧光,只有在DNA复制过程中掺入DNA双链中才发出荧光。下列分析错误的是 (　　) A.PCR体系中需要加入Mg2+来激活Taq酶 B.若要扩增一个DNA上的某基因,应加入DNA的两种引物和该基因的两种引物 C.荧光染料在每个循环的延伸阶段掺入双链DNA中 D.荧光信号强度与产物的数量呈正相关 B 解析:在PCR体系中需要加入Mg2+来激活耐高温的DNA聚合酶,用于合成DNA子链,A正确;若要扩增一个DNA上的某基因,应加入该基因的两种引物,B错误;荧光染料只有在DNA复制过程中掺入DNA双链中才发出荧光,在PCR反应的延伸阶段形成DNA双链,C正确;荧光染料可用来鉴定扩增结果,扩增的产物越多,则荧光信号强度越强,D正确。 3.如图为数字PCR技术的原理示意图,下列相关叙述错误的是(　　) A.PCR每一循环包括变性、退火和延伸三步 B.每个反应单位中都含有热稳定的RNA聚合酶 C.每个反应单位有无荧光取决于是否含有靶分子 D.数字PCR技术有利于提高病原体检测的灵敏度 B 解析:PCR技术中的每次循环包括变性、退火、延伸三步,A正确;每个反应单位中都含有热稳定的DNA聚合酶,催化子链的延伸过程,B错误;荧光的出现是荧光探针水解导致的,荧光探针首先与模板DNA的相应区段结合(靶分子),随着DNA复制延伸至荧光探针部位,导致荧光探针的水解进而产生荧光,显然,每个反应单位有无荧光取决于是否含有靶分子,C正确;根据荧光是否出现能检测目标DNA的存在,因此数字PCR技术更有利于提高病原体检测的灵敏度,D正确。 4.在表达融合蛋白时可以利用融合PCR技术把两个不同的基因片段连接起来,其原理如图所示,下列分析正确的是 (　　) A.该过程使用的引物P2和P3的碱基完全互补配对,所以不能放在一个系统中工作 B.融合PCR的第一步需要加入耐高温的DNA聚合酶、DNA连接酶等 C.融合PCR的第一步是不需要引物的,可能是因为两条链重叠的部位互为另一条链的引物 D.若融合PCR的第二步获得了64个融合基因,则该过程消耗了128个引物 答案:C 解析:该过程使用的引物P1和引物P2与基因甲的两端碱基序列进行碱基互补配对,引物P3和引物P4与基因乙的两端碱基序列进行碱基互补配对,引物P2和P3的碱基不会完全互补配对,A错误;分析题图可知,融合PCR的第一步是让两个DNA分子进行碱基互补配对,需要加入耐高温的DNA聚合酶,B错误;若融合PCR的第二步获得了64个融合基因,引物数目和新合成的子链数目相同,即该过程消耗了64×2-2=126(个)引物,D错误。 5.在核酸分子杂交技术中,常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)。为了获得B链作探针,可应用PCR技术进行扩增,应选择的引物种类是 (　　) A.引物1与引物2　　　　 B.引物3与引物4 C.引物2与引物3 D.引物1与引物4 C 解析:要获得B链,根据PCR中子链延伸方向为5'到3',则需选择引物2与引物3进行扩增,故选C。 6.对禽流感的确诊,先用PCR技术将标本基因大量扩增,然后利用基因探针,测知待测标本与探针核酸的碱基异同。图中P表示禽流感病毒探针基因在凝胶电泳后的电泳标记位置,甲、乙、丙、丁是四份送检样品在测定后的电泳标记位置,哪份标本最有可能被确诊为禽流感 (　　) A.甲 B.乙 C.丙 D.丁 C 解析:据题图分析,图中P表示禽流感病毒探针基因在凝胶电泳后的电泳标记位置,甲、乙、丙、丁是四份送检样品在测定后的电泳标记位置,其中丙的电泳位置与P的最接近,因此最有可能被确诊为禽流感。 7.PCR技术应用非常广泛,可用于扩增目的基因、制作探针、引入定点突变、定量检测DNA等。完成下列有关PCR技术和相关应用的问题。 (1)在利用PCR技术扩增某DNA中的某一目的基因时，依据的原理是 　 　　　　　 ,需要用到的酶是 。  (2)PCR反应后期,由于　　　　　　　　　　　　　　　　　(至少写出2点)等原因,反应速率会降低。  (3)PCR过程中,温度的控制至关重要,变性温度过低会因为_____________ 　　　　　　　　　　　　　　,最终导致反应效率降低。退火温度过高则会因　 　　　　　　　　　　导致目标产物的量　　　　　。  DNA分子半保留复制 热稳定的DNA聚合酶(Taq酶) 反应物的浓度降低、生成物增多等 不能充分解开,导致模板减少 DNA双链 引物不能与模板充分配对(模板与引物结合效率低) 减少 解析:(3)PCR扩增需要dNTP等物质,但在反应后期,随着反应进行,由于反应物的浓度降低、生成物增多等原因,反应变慢。 (4)若变性温度过低,则DNA双链不能充分解开,模板减少,导致反应效率降低。若退火温度过高,则会导致引物不能与模板充分配对(模板与引物结合效率低),导致目标产物的量减少。 [素能培优练] 8.PCR技术是对体内DNA复制过程的模仿,在 基因诊断等许多方面发挥重要作用。其机理 模式如图所示,①②③表示DNA上的相关区段, a、b、c、d分别为引物的两端。现利用该技术扩增片段②,下列描述正确的是(　　) A.图中b、d端为5'端,a、c端为3'端 B.设计相互容易发生互补配对的甲乙两种引物,可以提高扩增效率 C.区段②中GC碱基对的比例大小会影响到退火过程,对变性和延伸影响不大 D.若扩增得到m个含有区段②的DNA分子,需要消耗m-1个引物甲 D 解析:DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA链,根据题意,a、b、c、d分别为引物的两端,现利用该技术扩增片段②,根据子链的延伸方向可知模板上的a、d端为3'端,b、c端为5'端,A错误;两种引物之间不能发生碱基互补配对,以防止引物之间结合形成双链,影响引物与DNA模板链的结合,B错误;区段②中GC碱基对的比例越大,热稳定性越高,对变性和延伸都有影响,C错误;每扩增一个DNA分子需要一对引物(即一个甲和一个乙),除去模板DNA分子,需要消耗m-1个引物甲,D正确。 9.SRY⁃PCR是对移植前的胚胎进行性别鉴定的有效方法,利用的是Y染色体上特有的性别决定基因(即SRY基因)设计引物,进行PCR扩增,最后用SRY特异性探针对扩增产物进行检测即可确定性别。下列说法错误的是(　　) A.为了定向扩增SRY基因,PCR过程中仅可加入一种引物 B.DNA聚合酶是从引物的3'端延伸DNA链的 C.PCR结束后进行DNA分子杂交技术检测,阳性结果代表胚胎为雄性 D.由于该技术有PCR过程,环境DNA的进入可能导致假阳性结果 A 解析:定向扩增SRY基因,PCR扩增时需要加入两种引物,A错误;DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,延伸DNA链的,B正确;用SRY特异性探针对扩增产物进行检测,若形成杂交带,即呈阳性,说明其含有SRY基因,则胚胎的性别为雄性,C正确;若环境中的DNA进入,SRY特异性探针可能会与其形成杂交带,出现假阳性,D正确。 10.用Xho Ⅰ和Sal Ⅰ两种限制性内切核酸酶分 别处理同一DNA片段(限制酶在对应切割位 点一定能切开),酶切位点及酶切产物分离结果如图。 下列叙述错误的是(　　) A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同 B.图1中被酶切的DNA片段是双链DNA C.图2中泳道②可能是用Xho Ⅰ处理得到的酶切产物 D.用Xho Ⅰ和Sal Ⅰ同时处理该DNA,电泳后得到7种产物 D 解析:酶具有专一性,且由图2可知,这两种限制酶识别并切割的核苷酸序列不同,A正确;限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,作用的部位是磷酸二酯键,故图1中被酶切的DNA片段是双链DNA,B正确;分析图1可知,限制酶XhoⅠ有两处切割位点,切割后产生3个DNA片段,泳道②中是用XhoⅠ处理得到的酶切产物,C正确;由题干信息“限制酶在对应切割位点一定能切开”,可知用XhoⅠ和Sal Ⅰ同时处理该DNA得到6个DNA片段,电泳后得到6种产物,D错误。 11.(多选)PCR技术可用于遗传多样性的研究。如图是对跳虫A和跳虫B的DNA分析实验过程,下列有关叙述正确的是 (　　) A.蛋白酶可以分解组织中的蛋白质,在提取DNA时,加入蛋白酶有助于释放出DNA B.Taq酶能够耐高温,常在PCR中用于DNA链的合成 C.将已知长度的DNA片段装到凝胶上作参照,可用于估测样本DNA片段的大小 D.阴性对照是加入DNA模板和PCR扩增过程中所需的其他混合物,以检测是否有“污染” 答案:ABC 解析:蛋白酶可以分解组织中的蛋白质,真核生物的DNA与蛋白质结合在一起,因此,在提取DNA时加入蛋白酶有助于释放出DNA,A正确;Taq酶能够耐高温,高温下不会变性,常在PCR中用于DNA链的合成,B正确;阴性对照是未加入DNA模板但加入PCR扩增过程中所需的其他混合物,目的是检测试剂是否污染,D错误。 12.(多选)RNA经逆转录后再进行PCR扩增的技术称为RT⁃PCR,过程如图所示。下列相关叙述正确的是 (　 　) A.过程①需要RNA、逆转录酶、引物、核糖 核苷酸等条件 B.真核细胞的mRNA经过程①②获得的DNA 无内含子片段 C.过程③PCR扩增时引物中的CG含量会影响退火温度 D.RT⁃PCR技术可应用于RNA病毒的核酸检测 BCD 解析:过程①是由RNA形成单链DNA的过程,表示逆转录,需要RNA、逆转录酶、引物、脱氧核苷酸等条件,A错误;真核细胞中DNA的外显子部分转录的RNA拼接形成mRNA,因此真核细胞的mRNA经过程①②逆转录过程获得的DNA无内含子片段,B正确;CG含量越高,氢键越多,结构越稳定,因此过程③PCR扩增时引物中的CG含量会影响退火温度,C正确;RNA病毒遗传物质是RNA,RT⁃PCR技术可应用于RNA病毒的核酸检测,D正确。 13.PCR是利用体内DNA复制的原理,进行生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。RT⁃PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术,具体过程如图所示。 (1)PCR反应的基本步骤是　 　　　　　　,过程中主要借助对 　　　控制,使得化学反应有序高效地进行。  (2)科学家研究发现DNA聚合酶只能催化　　　　方向的聚合反应。细胞内染色体DNA的复制过程,有一条子链是先合成短的DNA片段(称为冈崎片段),再形成较长的分子,在PCR过程中无冈崎片段形成的原因是　   　。 (3)过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、　 　　　　　　　和引物A等。 变性、退火、延伸 温度 5'→3' 不同于体内DNA复制的边解旋边复制,PCR过程是先解旋后复制 RNA提取物、逆转录酶 (4)过程Ⅱ首先要将反应体系的温度升高到94 ℃,其目的是 　 。  (5)过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增,理论上至少需要_______　　　　个引物B。  (6)利用RT⁃PCR技术获取的目的基因　　 (填“能”或“不能”)在物种之间交流;该技术还可用于对某些微量RNA病毒的检测,可提高检测的灵敏度,原因是__________________________________________________________ 　  　。  让逆转录酶变性失活、使mRNA⁃cDNA杂合双链解开 2n-1 能 增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度),便 于检测 解析:(1)PCR的基本步骤包括变性、退火和延伸,PCR过程中主要借助对温度的控制,影响酶的活性,从而使得化学反应有序高效地进行。 (2)DNA聚合酶只能识别引物的3'端,因此催化5'→3'方向的聚合反应。细胞内染色体DNA是边解旋边复制,PCR复制过程是先完全解旋再复制,因此在PCR过程中无冈崎片段形成。 (3)过程Ⅰ是由mRNA形成cDNA的过程,表示逆转录,需要加入缓冲液、原料、RNA提取物、逆转录酶和引物A等。 (4)过程Ⅱ首先要将反应体系的温度升高到94 ℃,其目的是让逆转录酶变性失活、使mRNA⁃cDNA杂合双链解开,该反应体系中所用的Taq 酶至少应能耐受95 ℃高温。 (5)过程Ⅱ拟对单链cDNA进行循环的扩增,由图示可知,如果扩增n次,则可以形成2n个DNA单链,因此需要2n-1个引物B。 (6)不同生物体内DNA分子的基本结构相同,且所有的生物共用一套密码子,因此利用RT⁃PCR技术获取的目的基因能在物种之间交流;该技术还可用于对某些微量RNA病毒的检测,可提高检测的灵敏度,原因是增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度),便于检测。 14.我国研发出一种可高效特异地扩增超长DNA的抑制热交错PCR(STIPCR)。STIPCR通过在正/反向引物的5'端引入一段相同的短序列,抑制了较短产物链的扩增,增强了超长DNA的特异性扩增,在延伸阶段使用不同幅度(60~72 ℃)变温的嵌套热交错方法,解决了某一温度下,因超长DNA不同区域G—C碱基对含量不同而难以高效延伸的问题。回答下列问题。 (1)利用STIPCR从复杂基因组中特异地扩增超长DNA需要根据 　　　　　 　　　来合成引物,并对引物加工处理,STIPCR扩增过程与DNA在细胞中复制过程的相同之处为 _______________________________________________________________________　　　　　　　　　　　　 　　　 　(答出3点)。  (2)在正/反向引物的5'端引入一段相同的短序列,容易使较短的产物链首尾连接形成茎环结构,原因是_________________________________________ 　　　　　　　　　　　　 　　　　,该结构不能与引物结合,从而使较短产物链停留在PCR过程的　　　　　　　　阶段,抑制了非特异性产物的扩增。  一段已知目的基因的核苷酸序列 以DNA双链为模板、以脱氧核糖核苷酸为原料、需要DNA聚合 酶、复制方式为半保留复制等 DNA片段的两个末端形成反向互补序 列且较短的DNA片段两末端容易相互配对 低温退火/退火 (3)为提高超长DNA中G—C碱基对含量低的区域链的延伸效率,可适当 　　　(填“降低”或“升高”)温度,依据是_______________________________ 　　　　　　　 　　　　　　　　。  (4)为保证经STIPCR获得的某超长DNA与细胞内的该DNA遗传信息相同,需用限制酶处理所得DNA,其目的是去除　 　 　　　　　　。若要使获得的超长DNA在大肠杆菌中表达,需要_______________________ 　　　　　　　　　　,才能将超长DNA导入细胞。  降低 G—C碱基对间有3个氢键, G—C碱基对含量低的DNA片段中氢键少,热稳定性差 插入在引物5'端的短序列 将超长DNA与载体结 合构建基因表达载体 解析:(1)PCR扩增DNA需要根据一段已知目的基因的核苷酸序列来合成引物。由题干可知,STIPCR是一种PCR技术,因此STIPCR扩增过程与DNA在细胞中复制过程的相同之处为以DNA双链为模板、以脱氧核糖核苷酸为原料、需要DNA聚合酶、复制方式为半保留复制等,不同之处为前者不需要解旋酶,而后者需要解旋酶等。 (2)在正/反向引物的5'端引入一段相同的短序列,则DNA片段的两个末端形成反向互补序列且较短的DNA片段两末端容易相互配对,进而容易使较短的产物链首尾连接形成茎环结构。引物与2条单链模板DNA发生结合是在PCR过程的低温退火阶段,因此该结构不能与引物结合,从而使较短产物链停留在PCR过程的低温退火阶段。 (3)碱基对间以氢键相连,其中A—T碱基对间有2个氢键,G—C碱基对间有3个氢键。G—C碱基对含量低的DNA片段中氢键少,热稳定性就差,因此为提高超长DNA中G—C碱基对含量低的区域链的延伸效率,可适当降低温度。 (4)由题干可知,经STIPCR获得的某超长DNA比细胞内的该DNA多了一段插入在引物5'端的短序列,为保证经STIPCR获得的某超长DNA与细胞内的该DNA遗传信息相同,需要用限制酶去除插入在引物5'端的短序列。若要使获得的超长DNA在大肠杆菌中表达,不能直接将该DNA导入大肠杆菌中,需要将超长DNA与载体结合构建基因表达载体,才能将超长DNA导入细胞。 $$