第3章 第2节 第1课时 目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建-【优化探究】2025-2026学年新教材高中生物学选择性必修3同步导学案配套PPT课件（人教版）单选

基因工程 第3章　 第2节　基因工程的基本操作程序 第1课时　目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建     [目标导学]　1.简述PCR的原理、条件及过程。2.简述基因表达载体的组成及构建过程。 内容索引 NEIRONGSUOYIN 学习任务二　基因表达载体的构建 学习任务一　目的基因的筛选与获取 课时作业 巩固提升 备选题库 教师独具 目的基因的筛选与获取 学习任务一 1．筛选合适的目的基因 (1)目的基因 ①概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期____________等的基因就是目的基因。 ②作用：根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指______________的基因。 ③类型：与______________、__________、____________和工业用酶等相关的基因，如培育转基因抗虫棉用到的____________________，即Bt基因。 梳理 归纳教材知识 表达产物 编码蛋白质　 生物抗逆性 生产药物 毒物降解 Bt抗虫蛋白基因 (2)筛选目的基因的方法：从________________________________的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 相关的已知结构和功能清晰 2．获取目的基因的方法 (1)____________目的基因。 (2)常用PCR特异性地快速扩增目的基因。 (3)通过构建基因文库来获取目的基因。 人工合成 3．利用PCR获取和扩增目的基因 (1)含义：PCR是____________________的缩写。它是一项在体外提供参与DNA复制的____________与__________________，对目的基因的______________进行大量复制的技术。 (2)原理：________________。 聚合酶链式反应　 各种组分　 反应条件　 核苷酸序列 DNA半保留复制 (3)基本条件 ①场所：在一定的________液中进行，其中一般要添加Mg2+。 ②模板：DNA母链。 ③原料：4种______________。 ④酶：____________的DNA聚合酶。 ⑤引物：使DNA聚合酶能够从引物的_____端开始连接脱氧核苷酸。 缓冲　 脱氧核苷酸 　耐高温　 3′　 (4)过程   (5)鉴定：常采用____________________来鉴定PCR的产物。 受热变性　 引物　 耐高温的 DNA聚合酶 琼脂糖凝胶电泳 [正误辨析] (1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。 (　　) (2)PCR技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚。(　　) (3)PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温。(　　) (4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解聚的温度就越高。(　　) × × √ √ 1．思考并回答下列有关引物的问题。 (1)引物的本质是什么？ 提示：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，既可以是DNA单链，也可以是RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般是RNA片段。 探究 要点合作突破 (2)用于PCR的引物的长度通常为多少个核苷酸？ 提示：用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。 (3)细胞内DNA复制时是否需要引物？为什么？ 提示：需要。因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA单链，只能将游离的脱氧核苷酸连接在一条DNA单链的3′端，所以在延伸子链前，需要提前合成一小段RNA或DNA作为引物。 (4)利用PCR扩增目的基因时，为什么要用2种不同的引物？ 提示：DNA是两条反向平行的双链结构，而复制时只能从固定的方向(模板链的3′端)开始，所以引物的碱基序列是不同的。 (5)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？ 提示：根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。 2．如图为PCR扩增技术相关过程，请思考并回答下列问题。 (1)PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？说明理由。 提示：不是。PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。 (2)要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？ 提示：要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。 (3)利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？ 提示：第3轮。1/4。 (4)如果循环n次，则共需消耗多少对引物？ 提示：共需消耗(2n－1)对引物。 [归纳总结] 1．PCR扩增过程中的循环图示与规律 循环次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物A(或B)的DNA分子数 1 3 7 2n－1 同时含引物A、B的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗的引物数量 2＝21+1－2 6＝22+1－2 14＝23+1－2 2n+1－2 2．生物体内DNA复制与PCR技术的比较 1．下列关于PCR技术的说法，不正确的是(　　) A．PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 B．PCR过程中只需要两个引物分子 C．PCR的主要过程包括变性、复性、延伸，其中延伸阶段需要耐高温的DNA聚合酶 D．PCR过程中DNA合成方向是5′到3′ 强化 题点对应训练 B 解析：PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，用于延伸子链，A正确；PCR过程中只需要两种引物分子，每条新的子链延伸都需要一个引物，B错误；PCR的主要过程包括变性、复性、延伸，其中延伸阶段需要耐高温的DNA聚合酶，C正确；PCR过程中DNA合成方向是5′到3′，D正确。 2．利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，下列说法正确的是(　　) A．延伸的温度必须小于复性温度，且小于变性温度 B．PCR反应过程中需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶 C.共需2n+1－2个引物参与子代DNA分子的合成 D．理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占15/16 C 解析：高温变性、低温复性、中温延伸，延伸的温度必须大于复性温度，而小于变性温度，A错误；PCR反应过程中不需要解旋酶，直接利用高温进行解旋，B错误；PCR技术的原理是DNA复制，根据DNA分子半保留复制特点可知，共有2n－1对引物参与子代DNA分子的合成，即共需2×(2n－1)＝2n+1－2个引物，C正确；第4轮循环产物共得到24＝16个DNA片段，其中亲本的2个模板链不含引物，故含两种引物的DNA片段占14/16＝7/8，D错误。 基因表达载体的构建 学习任务二 1．构建基因表达载体的目的 (1)让目的基因在受体细胞中____________，并且________给下一代。 (2)使目的基因能够________和发挥作用。 梳理 归纳教材知识 稳定存在　 遗传　 表达 2．基因表达载体的组成 启动子　 上游　 RNA聚合酶　 终止子　 下游　 转录 标记 3．基因表达载体的构建过程 (1)首先用一定的____________切割载体。 (2)然后用________限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 (3)再利用____________将目的基因片段拼接到载体的切口处(如图所示)。 限制酶 同种 DNA连接酶 [正误辨析] (1)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取。(　　) (2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子。(　　) (3)标记基因不一定是抗生素抗性基因。(　　) × × √ 1．获取Bt基因后能直接将它导入受体细胞吗？为什么？ 提示：不能。因为游离的DNA进入受体细胞，一般会直接被分解，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。 探究 要点合作突破 2．请结合图示回答下列问题。 (1)构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ酶切割质粒？为什么？ 提示：不能。因为SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因。该基因是标记基因，用于重组DNA分子的筛选，若被破坏，则无法进一步筛选。 (2)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？ 提示：可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。 [归纳总结] 1．区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子 启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。 2．图解限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶或能产生相同平末端的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ 和EcoR Ⅰ 两种限制酶。 3．干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白， 目前主要用于治疗慢性乙型、丙型肝炎等。我国科学 家用基因工程的方法从大肠杆菌中获得了人干扰素， 如图为科学家构建的人干扰素基因表达载体。 下列叙述正确的是(　　) A．基因表达载体上的启动子是 DNA 聚合酶识别和结合的部位 B．图中未标出终止子，其作用是使翻译过程在需要的地方停下来 C．用同种限制酶切割干扰素基因和载体的目的是产生相同的末端 D．构建基因表达载体时，T4 DNA 连接酶可恢复被限制酶切开的氢键 强化 题点对应训练 C 解析：基因表达载体上的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于驱动基因的转录，A错误；图中未标出终止子，其作用是使转录过程在需要的地方停下来，B错误；用同种限制酶切割干扰素基因和载体的目的是产生相同的末端，便于基因表达载体的构建，C正确；构建基因表达载体时，T4 DNA 连接酶可恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，D错误。 4．某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析不正确的是(　　) A．用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段 B．不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因 C．构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA D．导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长 答案：C 解析：限制酶HindⅢ和PstⅠ在质粒上各有一个识别切割位点，用HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段，A正确；AluⅠ的切割位点位于目的基因中，用AluⅠ酶切割外源DNA会破坏目的基因，B正确；不宜选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，因为质粒中的两个标记基因均会被破坏，且目的基因会反向连接至载体上，C错误；构建重组DNA时，选择限制酶HindⅢ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA，会破坏质粒中的氯霉素抗性基因，保留四环素抗性基因，所以导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长，D正确。 [知识拓展] 真、原核细胞基因的结构 课堂小结 备选题库 教师独具 1．下列有关获取目的基因的叙述，错误的是(　　) A．目的基因就是编码蛋白质的基因 B．获取目的基因是基因工程的第一步 C．来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因 D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会 解析：目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子，A错误。 2 3 1 4 A 5 2．下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是(　　) A．二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端 B．二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋 C．体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量 D．二者遵循的碱基互补配对原则相同 2 3 1 4 B 5 解析：DNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA时，子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端，A正确；PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，氢键在高温条件下断裂，B错误；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量，但两者所需能量来源不同，C正确；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互补配对原则相同，D正确。 2 3 1 4 5 3．下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是(　　) A．启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，组成它的基本单位是脱氧核苷酸 B．基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因等组件 C．人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达 D．由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别 2 3 1 4 B 5 解析：启动子在基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，组成它的基本单位是脱氧核苷酸，A正确；基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点等，B错误；人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达，C正确；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，D正确。 2 3 1 4 5 4．某人利用如图所示的载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组表达载体。有关叙述不正确的是(　　) A．这三种重组表达载体中，不能在宿主细 胞中表达目的基因产物的是甲、丙 B．启动子是DNA片段，是RNA连接酶识别 和结合的部位 C．抗生素抗性基因便于重组DNA分子的筛选 D．复制原点可以让重组表达载体拥有自我复制的能力，从而可以遗传给下一代 2 3 1 4 B 5 解析：在基因表达载体中，启动子位于目的基因 的上游，终止子位于目的基因的下游，这样的基 因才能表达，图中甲和丙均不符合，所以甲、丙 均不能在宿主细胞中表达目的基因产物，A正确； 启动子是一段有特殊结构的DNA片段，是RNA聚 合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，B错误；载体上的标记基因便于重组DNA分子的筛选，常用的标记基因是抗生素抗性基因，C正确；复制原点可以让重组表达载体拥有自我复制的能力，并且可以遗传给下一代，D正确。 2 3 1 4 5 5．如图1表示限制酶EcoR Ⅰ的识别序列，图2表示目的基因及限制酶切点，图3表示目的基因上的DNA片段，图4表示质粒。请回答下列问题。 2 3 1 4 5 (1)获得图2中目的基因的方法除PCR技术外，还有________________。 (2)采用PCR扩增目的基因的原理是____________________，图2中A、B、C、D 4种单链DNA片段，应选取________两种作为引物(DNA复制方向由5′→3′)。 2 3 1 4 5 2 3 1 4 5 (3)图3为目的基因中的某一片段，下列有关叙述错误的是________(填下列字母，不定项)。 a．该片段的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成 b．该片段含A－T碱基对比较多，故其结构比较稳定 c．若利用PCR扩增该片段，则需解旋酶将①氢键全部解开 d．若该目的基因复制6次，则需要碱基A的数量是252个 2 3 1 4 5 (4)在构建目的基因表达载体时，用PstⅠ、EcoR Ⅰ两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时发生_______________，从图2切割下目的基因需要消耗________个水分子。由图4可知，不选用限制酶PstⅠ和Hind Ⅲ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是____________________________________________________________ __________________________________________________________。 2 3 1 4 5 答案：(1)从基因文库中获取、人工合成 (2)DNA半保留复制　B、C (3)bcd (4)目的基因与载体自身环化和反向连接　4　会破坏质粒上所有的标记基因 2 3 1 4 5 解析：(1)获得目的基因的方法有PCR技术、从基因文库中获取、人工合成。 (2)采用PCR扩增目的基因的原理是DNA半保留复制，由图2可知，DNA复制只能从5′到3′，因此构建前利用PCR技术扩增基因时，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取B和C作为引物。 (3)DNA的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成，a正确；其结构中G－C碱基对越多，分子结构越稳定，b错误；PCR技术利用高温解开氢键，不需要解旋酶，c错误；由图3可知，目的基因碱基A有2个，复制6次需要碱基A的数量为26×2－2＝126个，d错误。故选b、c、d。 2 3 1 4 5 (4)在构建目的基因表达载体时，用PstⅠ、EcoRⅠ两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时发生目的基因与载体自身环化和反向连接。限制酶破坏的是磷酸二酯键，图中目的基因切割需要破坏4个磷酸二酯键，因此需要消耗4个水分子。由图4可知，不选用限制酶PstⅠ和Hind Ⅲ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是会破坏质粒上所有的标记基因。 课时作业 巩固提升 [基础巩固练] 1．利用PCR技术扩增DNA，需要的条件是(　　) ①目的基因　②引物　③四种脱氧核苷酸　④耐高温的DNA聚合酶　⑤mRNA　⑥核糖体　⑦能量 A．②③④⑤⑥　　　　　　　　 B．①③④⑤⑦ C．①②③⑤⑥ D．①②③④⑦ 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 D 解析：PCR技术需要以目的基因为模板，①正确；PCR技术需要一对引物，分别与解旋后的单链结合，并延伸子链，②正确；PCR技术需要以四种脱氧核苷酸作为合成DNA的原料，③正确；PCR技术是在高温条件下进行的，因此需要耐高温的DNA聚合酶等，④正确；mRNA是合成蛋白质的模板，在DNA复制过程中不需要，⑤错误；核糖体是合成蛋白质的场所，在DNA复制过程中不需要，⑥错误；PCR扩增过程中需要能量，⑦正确。综上分析，D正确，A、B、C错误。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 2．下列关于PCR的叙述，错误的是(　　) A．PCR只能扩增引物之间的DNA片段而非整个完整的模板DNA分子 B．PCR过程中变性的目的是让引物与模板DNA单链结合 C．PCR的原理是DNA半保留复制 D．PCR的过程需要耐高温的DNA聚合酶但不需要解旋酶 解析：变性的目的是通过升高温度，破坏氢键，打开模板DNA分子，为子链的延伸提供模板。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 B 3．PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。下列关于利用PCR技术扩增目的基因的叙述，正确的是(　　) A．PCR技术利用DNA双链复制的原理，使核糖核苷酸序列呈指数方式增加 B．扩增目的基因前，需要设计可与目的基因的碱基序列互补的两种双链引物 C．基因的扩增依赖于模板、耐高温的DNA聚合酶和原料等物质 D．加热至90～95 ℃的目的是使基因的磷酸二酯键断裂 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 C 解析：PCR技术利用DNA半保留复制的原理，构成DNA的基本单位为脱氧核苷酸，A错误；在扩增目的基因前，需要设计可与目的基因的碱基序列互补的两种单链引物，在复性时引物分别与目的基因的两条链结合形成双链，B错误；利用PCR技术扩增基因依赖于目的基因的模板、耐高温的DNA聚合酶和相应原料(脱氧核苷酸)等物质，C正确；加热至90～95 ℃的目的是使基因的两条链解聚，因此高温破坏的是两条链间的氢键，D错误。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 4．用PCR扩增下面的DNA片段： 5′GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG3′ 3′CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC5′ 供选择的引物有： ①5′GACCTGTGGAAGC3′ ②5′CATACGGGATTG3′ ③5′GTATGCCCTAAC3′ ④5′CAATCCCGTATG3′ 共四种，应选择(　　) A．①② B．②③ C．③④ D．①④ 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 D 解析：用PCR扩增DNA片段的过程中，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5′端至3′端延伸的，故引物的碱基序列应与每条模板链5′端的一段核苷酸链的碱基序列相同，即应以模板链5′端的一段脱氧核苷酸单链片段作为引物；由题干信息分析可知，5′端的碱基序列是5′GACCTGTGGAAGC和5′CAATCCCGTATG，故对应的引物为①④，D正确。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 5．在核酸分子杂交技术中，常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)。为了获得B链作探针，可应用PCR技术进行扩增，应选择的引物种类是(　　)   A．引物1与引物2 B．引物3与引物4 C．引物2与引物3 D．引物1与引物4 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 C 解析：要获得B链，根据PCR中子链延伸方向为5′→3′，则需选择引物2与引物3进行扩增，故选C。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 6．如图是基因工程中基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是(　　)   A．目的基因插入位点 B．启动子 C．标记基因 D．DNA聚合酶识别位点 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 B 解析：基因表达载体由启动子、终止子、标记基因、复制原点和目的基因等组成。题图中有终止子、标记基因(抗生素抗性基因)、目的基因、复制原点等，还缺少启动子。启动子位于基因的上游，所以X最可能是启动子，B正确。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 7．下列关于基因表达载体的说法，不正确的是(　　) A．基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤 B．基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因、复制原点等 C．终止子位于目的基因的下游，能够终止翻译过程 D．不同的目的基因所需的启动子不一定相同 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 C 解析：基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，A正确；基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，其中启动子位于目的基因的上游，是启动转录的一段DNA片段，终止子位于目的基因的下游，能够终止转录过程，B正确，C错误；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其启动子也不尽相同，D正确。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 8．某目的基因两侧的DNA序列所含的限制酶酶切位点如图所示，最好应选用下列哪种质粒作为载体(　　) 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 D 解析：目的基因只有一侧含有限制酶NheⅠ的识别序列，用此酶不能获取目的基因，A错误；目的基因两侧含有限制酶AluⅠ的识别序列，但只用此酶切割可能会导致目的基因和质粒反向连接或自身环化，B错误；目的基因两侧含有限制酶NheⅠ和AluⅠ的识别序列，但用这两种酶切割可能获得的片段不含目的基因，C错误；目的基因两侧含有限制酶NheⅠ和SmaⅠ的识别序列，用这两种酶切割能获取目的基因，而且能防止目的基因和质粒的自身环化和反向连接，D正确。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 [素能培优练] 9．科研人员利用PCR技术扩增X基因片段，需加入两种引物，引物结合位置如图甲所示。PCR循环后产生五种DNA分子，如图乙所示。下列叙述正确的是(　　) 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 A．利用DNA聚合酶和DNA连接酶才能完成PCR扩增过程 B.如果加入大量引物1和引物2，会干扰正常的PCR扩增过程 C．在第四轮复制后，会出现8个X基因片段 D．经过第二轮PCR后会出现①②③④⑤五种DNA分子 答案：C 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 解析：PCR技术扩增X基因片段，利用DNA聚合酶就能完成PCR扩增过程，A错误；由图甲可知，利用PCR技术扩增X基因片段需要引物1和2，如果加入大量引物1和引物2，不会干扰正常的PCR扩增过程，B错误； 第四次复制得到16个DNA分子：①复制得①和③，②复制得②和④，2个③复制得2个③和2个⑤，2个④复制得2个④和2个⑤，2个⑤复制得4个⑤，共8个⑤(X基因片段)，C正确；X基因第一次复制得到2个两种DNA分子：①和②；X基因第二次复制得到4个四种DNA分子：①复制得①和③，②复制得②和④。可见，经过第二轮PCR后会出现①②③④四种DNA分子，D错误。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 10．RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示，以下说法错误的是(　　)   A．设计扩增目的基因的引物时需考虑基因表达载体的序列 B．G—C含量高的引物在与模板链结合时，需要更高的温度 C．过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、耐高温的DNA聚合酶和引物A等 D．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 C 解析：设计扩增目的基因的引物时，引物应当可以与表达载体两端的序列进行互补配对，所以设计引物时需要考虑基因表达载体的序列，A正确；A—T对之间有两个氢键，G—C对之间有三个氢键，所以G—C含量高的引物在与模板链结合时，需要更高的温度，B正确；过程Ⅰ是逆转录过程，所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶和引物A等，C错误；该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度，D正确。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 11．不对称PCR的基本原理是采用不等量的引物，产生大量的单链目标DNA。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物；其最佳比例一般为1∶50～1∶100。在PCR反应的早期循环(约20次)中，扩增产物主要是双链DNA，当后期数量较少的限制性引物耗尽后，数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA，过程如图所示。下列相关叙述错误的是(　　) 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 A．PCR反应缓冲液中一般需添加Mg2+，以激活DNA聚合酶 B．复性时引物与模板链3′端的碱基序列通过互补配对结合 C．PCR进行最初20次循环的目的是增加模板DNA的量 D．不对称PCR产生的大量单链DNA是由限制性引物延伸而来的 答案：D 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 解析：PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+，以激活耐高温的DNA聚合酶，A正确；复性时引物会与模板链3′端的碱基序列互补配对，B正确；PCR进行最初20次循环的目的是增加模板DNA的量，C正确；不对称PCR产生的大量单链DNA是由非限制性引物延伸而来的，D错误。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 12．研究人员用如图1中质粒和图2中含目的基因的片段构建重组质粒(图中标注了相关限制酶切割位点)，将重组质粒导入大肠杆菌后进行筛选及PCR鉴定。下列叙述不正确的是(　　) 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 A．构建重组质粒的过程应选用BclⅠ 和Hind Ⅲ 两种限制酶 B．使用DNA连接酶将酶切后的质粒和目的基因片段进行重组 C．能在添加四环素的培养基上生存的一定是含有重组质粒的大肠杆菌 D．利用PCR鉴定含目的基因的大肠杆菌时应选用引物甲和引物丙 答案：C 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 解析：选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但BamHⅠ会使质粒中的两种标记基因都被破坏，因此只能选BclⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶切割，A正确；酶切后的质粒和目的基因片段要用DNA连接酶连接，构建重组载体，B正确；只含有质粒的大肠杆菌也能在添加四环素的培养基上生存，C错误；PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反的方向合成子链，故所用的引物为图2中引物甲和引物丙，D正确。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 13．如图是制备含目的基因的“工程菌”的示意图。请回答下列问题。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 (1)利用PCR技术特异性扩增目的基因需使用耐高温的DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶，原因是____________________； 若PCR过程完成4轮循环，理论上至少需________个引物4，获得__________个目的基因。 (2)为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物________(填“3′端”或“5′端”)添加相应的限制酶识别序列；过程①中应使用限制酶________切割质粒。 (3)图中启动子的作用是____________________；对于实验失败的大肠杆菌及其培养基应进行__________处理后再丢弃，以防其污染环境。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 答案：(1)耐高温的DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活　15　8 (2) 5′端　BamHⅠ (3)作为RNA聚合酶的识别和结合部位，驱动基因转录出mRNA　灭菌 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 解析：(1)在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解聚为单链的条件是加热至90 ℃以上，耐高温的DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活；PCR技术大量扩增目的基因时，缓冲液中需要加入的引物个数计算公式为2(n+1)－2(n为循环次数)，因此PCR过程完成4轮循环，理论上至少需加入引物2(4+1)－2＝30(个)，其中引物1和引物4分别为15个，获得目的基因8个。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 (2)①是基因表达载体的构建过程，若使用限制酶EcoRⅠ切割质粒会将目的基因插入启动子上游，目的基因不能正确表达；使用限制酶HindⅢ切割质粒将破坏标记基因，不利于目的基因的鉴定和筛选，因此该过程中应使用限制酶BamHⅠ切割质粒。 (3)目的基因上游的启动子是RNA聚合酶的识别和结合部位，能驱动基因转录出mRNA；为了防止污染环境，对于大肠杆菌及其培养基应进行灭菌处理。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 14．利用图1和2所示的质粒X和含S蛋白基因的DNA构建基因表达载体，以培养转S蛋白基因的大肠杆菌，其中限制酶的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 (1)BamHⅠ、BclⅠ和Sau2AⅠ三种限制酶切割DNA时，形成的末端________(填“能”或“不能”)互连，理由是_________________。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 (2)利用图1和2所示的质粒X和含S蛋白基因的DNA构建基因表达载体时，质粒X中能作为标记基因的是____________________，理由是_______________________。 (3)Sau2AⅠ________(填“能”或“不能”)将由质粒X和含S蛋白基因的DNA构建的基因表达载体切割，理由是_________________。 基因工程中，构建基因表达载体时常选用两种限制酶切割载体和含目的基因的DNA。与同一种限制酶切割相比，一般情况下，其优点在于可以防止_____________________________________。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 答案：(1)能　这3种限制酶切割DNA形成的末端能发生碱基互补配对(或这3种限制酶切割DNA形成的黏性末端相同) (2)四环素抗性基因　将S蛋白基因切割下来，需用到BamHⅠ或BclⅠ中的一种，其中BamHⅠ会破坏四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，BclⅠ仅破坏氨苄青霉素抗性基因，保留四环素抗性基因 (3)能　构建的基因表达载体中含有Sau2AⅠ识别的GATC序列　目的基因和载体的自身环化以及载体与目的基因的反向连接 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 解析：(1)据表分析，BamHⅠ 、BclⅠ和Sau2AⅠ三种限制酶切割DNA时，形成的末端相同，均为GATC，能发生碱基互补配对，所以形成的末端之间能互连。 (2)据图1和2可知，将S蛋白基因切割下来，需用到BamHⅠ或BclⅠ中的一种，其中BamHⅠ会破坏四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，BclⅠ仅破坏氨苄青霉素抗性基因，保留四环素抗性基因，因此利用图1和2所示的质粒X和含S 蛋白基因的DNA 构建基因表达载体时，质粒X中能作为标记基因的是四环素抗性基因。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 (3)由质粒X和含S蛋白基因的DNA构建的基因表达载体中含有Sau2AⅠ识别的GATC序列，所以Sau2AⅠ能对该基因表达载体进行切割；一般情况下，选用两种限制酶切割载体和含目的基因的DNA，两种酶切割形成的末端不同，可以防止构建基因表达载体时目的基因和载体的自身环化以及载体与目的基因的反向连接。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 14 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 $$