第3章 第2节 第1课时 目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建（Word教参）-【状元桥·优质课堂】2024-2025学年高中生物学选择性必修第三册（人教版2024）

第2节　基因工程的基本操作程序 第1课时　目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建 [课标要求] 1.掌握目的基因的筛选与获取方法(科学思维、生命观念)。2.学会基因表达载体构建的方法和要求(科学探究)。 (见学生用书P70) 知识点1　目的基因的筛选与获取1.培育转基因抗虫棉的四个主要步骤：__目的基因__的筛选与获取、__基因表达载体__的构建、将目的基因导入__受体细胞__、目的基因的__检测与鉴定__。 2．目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变__受体细胞性状__或获得__预期表达产物__等的基因。目的基因主要指编码蛋白质的基因。 3．获取方法 (1)筛选合适的目的基因：从相关的__已知结构和功能清晰__的基因中进行筛选是较为有效的方法之一，如　Bt基因　是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。 (2)利用PCR获取和扩增目的基因 ①PCR(聚合酶链式反应)的概念 是一项根据DNA__半保留复制__的原理，在体外提供参与DNA复制的__各种组分__与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行__大量复制__的技术。 ②PCR反应条件：PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供__DNA模板__，分别与两条模板链结合的2种__引物__,4种脱氧核苷酸和__耐高温的DNA聚合酶__；同时通过控制__温度__使DNA复制在体外反复进行。 ③PCR反应过程 a．变性：当温度上升到__90__℃以上时，双链DNA__解聚为单链__。 b．复性：当温度下降到__50__℃左右时，两种引物通过__碱基互补配对__与两条单链DNA结合。 c．延伸：当温度上升到__72__℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在__耐高温的DNA聚合酶__的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 ④反应场所及结果鉴定 PCR反应可以在__PCR扩增仪(PCR仪)__中自动完成，完成以后，常采用__琼脂糖凝胶电泳__来鉴定PCR的产物。 (3)在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建__基因文库__来获取目的基因。 【辨正误】 (1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因，它们都是具有抗逆性的基因。(　×　) 目的基因未必都具有抗逆性。 (2)Taq DNA聚合酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA聚合酶。(　√　) (3)PCR扩增时，72 ℃左右，引物与作为模板的单链DNA特定部位相互配对、结合。(　×　) PCR扩增时，当温度下降到50 ℃左右时，引物与模板链特定部位结合。 (4)获取目的基因较为有效的方法之一是从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。(　√　) 知识点2　基因表达载体的构建1.基因表达载体的组成：一个基因表达载体的组成有目的基因、__启动子__、终止子、标记基因等。 2．基因表达载体的功能：让目的基因在__受体细胞__中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 3．启动子与终止子 (1)启动子：是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的__上游__，紧挨转录的起始位点，它是__RNA聚合酶__识别和结合的部位，可驱动基因转录出mRNA。 (2)终止子：位于基因的__下游__，也是一段有特殊序列结构的DNA片段，能够__终止转录__。 4．基因表达载体的构建 (1)首先会用一定的限制酶切割__载体__，使它出现一个切口。 (2)用__同种__限制酶或__能产生相同末端__的限制酶切割含有__目的基因__的DNA片段。 (3)利用__DNA连接酶__将目的基因片段拼接到载体的__切口__处，这样就形成了一个重组DNA分子。 【辨正误】 (1)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。(　×　) 外源DNA必须位于启动子与终止子之间才能“表达”。 (2)基因表达载体中含有起始密码子与终止密码子。(　×　) 基因表达载体中有启动子、终止子而无起始密码子与终止密码子。 (3)基因表达载体的构建是基因工程的核心。(　√　) 1．(教材P80“图3－6”拓展)如图为某质粒构成图，请写出A、B、C的名称。目的基因将嵌入哪一位置？ 提示　A——启动子，B——终止子，C——标记基因。目的基因将嵌入A与B之间被限制酶切割后产生的切口处。 探究点1　利用PCR获取和扩增目的基因 如图是PCR扩增技术相关过程图，请思考回答下列问题： (1)请完善图中的信息①__变性__；②__复性__；③__延伸__。 (2)高温变性的目的是使__双链DNA解聚为单链__。 (3)PCR所需引物是依据__目的基因__的一段已知序列设计而成的，图中引物A与引物B__不同__(填“相同”或“不同”)，其在PCR过程中__不能__(填“能”或“不能”)重复利用。 (4)DNA复制时为什么需要引物？ (5)如图所示利用PCR技术扩增目的基因，从第几轮循环才会产生完整的目的基因(可用相关图解解释)? (6)要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？ (7)如果循环n次，则需消耗多少对引物？ 提示　(4)在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3端延伸DNA链，因此DNA复制时应加入两种引物。 (5)第3轮，如图所示： (6)要在两种引物的5端分别添加限制酶的识别序列。 (7)需消耗(2n－1)对引物。 1．PCR反应的过程 过程 说明 图解 变性 当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链 复性 当温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 延伸 72 ℃左右时，Taq DNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5端向3端延伸 2.体内DNA复制与PCR技术的比较 项目 DNA复制 PCR技术 区别 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温作用下变性解旋 场所 细胞内(主要在细胞核内) 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 酶 解旋酶、DNA聚合酶等 耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 温度条件 细胞内温和条件 需控制温度，在较高温度下进行 结果 形成完整的DNA分子 短时间内可形成大量的DNA片段 联系 ①模板：均以脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成； ②原料：均为四种脱氧核苷酸，但PCR中是以dNTP形式加入的； ③酶：均需要DNA聚合酶进行催化； ④引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸 【例1】 下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是(　　) A．二者子链的延伸方向相同，均为5端→3端 B．二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋 C．体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量 D．二者遵循的碱基互补配对原则相同 答案　B 解析　体内DNA复制与利用PCR技术扩增DNA时，子链的延伸方向相同，均为5端→3端，A项正确；PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，在高温条件下氢键断裂，B项错误；体内DNA复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量，但两者所需能量来源不同，C项正确；体内DNA复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互补配对原则相同，D项正确。 【例2】 如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，便捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图(以EcoR Ⅰ酶切为例)： 请据图回答问题： (1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种____________酶，它通过识别特定的____________切割特定位点。 (2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3－羟基与5－磷酸间形成__________；PCR循环中，升温到90 ℃以上是为了获得____________；Taq DNA聚合酶的作用是催化______________________________。 (3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ应用的PCR引物是____________(从引物①②③④中选择，填编号)。 DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知序列 PCR引物 ①5—AACTATGCGCTCATGA—3 ②5—GCAATGCGTAGCCTCT—3 ③5—AGAGGCTACGCATTGC—3 ④5—TCATGAGCGCATAGTT—3 (4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是____________。 A．5—AACTATGCG……AGCCCTT—3 B．5—AATTCCATG……CTGAATT—3 C．5—GCAATGCGT……TCGGGAA—3 D．5—TTGATACGC……CGAGTAC—3 解析　(1)由题图可知，EcoRⅠ酶将DNA分子切出两个黏性末端，可判断EcoRⅠ是一种限制性核酸内切(或限制)酶，限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。(2)DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3－羟基与5－磷酸间形成磷酸二酯键。PCR扩增DNA的过程包括变性、复性和延伸，高温90 ℃变性是为了破坏碱基对之间的氢键，获得DNA单链，Taq DNA聚合酶能够催化以DNA为模板的DNA子链沿引物的3端延伸。(3)引物是一小段单链DNA，引物5端的碱基可以与DNA两条链的3端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向为5→3。据题图分析 片段F的已知DNA序列如题表所示，要通过设计引物进行反向PCR，从而得到已知序列在两端、未知序列在中间段的PCR产物(过程如反向PCR的原理示意图)，则需要反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，因此要选择②④这对引物。(4)据题图及反向PCR的原理示意图可知片段F的两端为EcoRⅠ切割后的黏性末端序列，EcoRⅠ识别的序列是，且在G与A之间切割，ACD项错误，B项正确。 答案　(1)限制性内切核酸(或限制)　核苷酸序列 (2)磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA链的延伸　(3)②④　(4)B 探究点2　基因表达载体的构建 构建基因表达载体是培育转基因产品的核心工作，图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段，图中箭头表示相关限制酶的切割位点。 (1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶有__限制酶和DNA连接酶__。 (2)用图中质粒和DNA构建基因表达载体时，不能使用限制酶Sma Ⅰ切割，原因是__Sma_Ⅰ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因__。 (3)构建基因表达载体时，可用限制酶EcoR Ⅰ同时切割质粒和DNA，但会导致____等问题，为避免以上问题出现，应使用　BamH Ⅰ和Hind Ⅲ(或EcoRⅠ和Hind Ⅲ)　两种限制酶。 (4)构建好的基因表达载体在目的基因前要加上__启动子__，尤其是__RNA_聚合酶__识别和结合的部位。 1．区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子 启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。 2．图解限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因：如图甲中可选择Pst Ⅰ，而不选择Sma Ⅰ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma Ⅰ。 (3)确保出现相同黏性末端：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中Pst Ⅰ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择Pst Ⅰ 和EcoR Ⅰ 两种限制酶。 【拓展延伸】 基因的结构 【例3】 (2023·湖北)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用Pvu Ⅰ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用Sph Ⅰ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用Sph Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 答案　D 解析　若用Hind Ⅲ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA连接酶将两者连接成重组质粒，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同，A项正确；若用Pvu Ⅰ酶切，会破坏氨苄青霉素抗性基因，在含Tet(四环素)培养基中的菌落可能是含有目的基因的重组质粒，也可能是质粒自身连接的普通质粒，因此，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B项正确；若用Sph Ⅰ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C项正确；若用Sph Ⅰ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet(四环素)的培养基中不能形成菌落，D项错误。 【例4】 (2023·全国乙节选)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。 (1)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为____________；②为____________，其作用是____________；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是____________。 解析　(1)一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子，终止子以及标记基因等，且基因的转录方向为从启动子到终止子，故图中①为终止子，②为启动子，启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素基因就可以作为这种基因。 答案　(1)终止子　启动子　RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录　鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 核心知识小结 [网络构建] [答题必备] 1．基因工程的操作程序包括：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 2．筛选目的基因的方法包括：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选；利用PCR扩增目的基因；通过构建基因文库获取目的基因等。 3．PCR反应过程包括90 ℃以上处理使DNA变性，温度下降至50 ℃左右的复性及温度再上升到72 ℃左右的延伸等循环过程。 4．基因表达载体的构建是基因工程操作的核心步骤。基因表达载体中目的基因上游有启动子，下游有终止子。 1．(2023·新课标)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 答案　C 解析　只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，A项错误；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，无法连接，B项错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插入到质粒中，C项正确；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D项错误。 2．下图为基因表达载体模式图，下列有关叙述正确的是(　　) A．甲表示启动子，位于基因的上游，它是DNA聚合酶识别和结合的位点 B．乙表示终止密码子，位于基因的下游，作用是使转录过程停止 C．丙表示目的基因，其作用是获取人们需要的性状 D．复制原点的存在有利于目的基因在宿主细胞内扩增 答案　D 解析　甲表示启动子，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的位点，A项错误；乙表示终止子，不是终止密码子，B项错误；丙表示标记基因，其作用是筛选含有重组质粒的受体细胞，C项错误：复制原点的存在有利于目的基因在宿主细胞内扩增，D项正确。 3．下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是(　　) A．表达载体中的胰岛素基因可通过胰岛A细胞的mRNA逆转录获得 B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点 C．借助标记基因筛选出的受体细胞不一定含有目的基因 D．起始密码子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用 答案　C 解析　由于基因的选择性表达，在人的胰岛A细胞中，没有胰岛素基因转录的mRNA，A项错误；表达载体的复制启动于复制原(起)点，胰岛素基因的表达启动于启动子，B项错误；标记基因位于载体上，利用标记基因筛选出来的受体细胞可能只含有载体而不含有目的基因，C项正确；胰岛素基因的转录启动于启动子，终止于终止子，而密码子在翻译过程中起作用，D项错误。 4．在核酸分子杂交技术中，常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)。为了获得B链作探针，可应用PCR技术进行扩增，应选择的引物种类是(　　) A．引物1与引物2　　 B．引物3与引物4 C．引物2与引物3 D．引物1与引物4 答案　C 解析　要获得B链，根据PCR中子链延伸方向为5到3，则需选择引物2与引物3进行扩增，故选C。 5．(2024·新课标)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5→3方向。回答下列问题。 (1)限制酶切割的化学键是____________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是___________________________________。 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和_________________________________________________________。 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是____________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是__________________________________________________________。 (4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是_____ __________________________________________________________________________________________________________________。(答出2点即可)。 解析　(1)限制酶切割磷酸二酯键；将M1和M2片段分别插入特定的酶切位点，可以避免破坏N基因的启动子、终止子和N基因，保证N基因能在菌株B2中表达。(2)向导RNA与DNA进行互补配对，可以形成的碱基对有G—C、C—G、A—T、U—A。(3)以细菌B2基因组为模板，通过从B2基因组中扩增出N基因，验证片段甲插入了细菌B1基因组；用引物P3和P4进行PCR，无法得到PCR扩增产物。 答案　(1)磷酸二酯键　可以避免破坏启动子、终止子和N基因　(2)C—G、A—T、U—A　(3)细菌B2基因组　无 PCR扩增产物 (4)无火灾隐患；对环境无污染；分解效率更高等(合理即可) 学科网（北京）股份有限公司 $$