第3章 第2节 基因工程的基本操作程序-【金版教程】2024-2025学年高中生物必修3 生物技术与工程 创新导学案word（人教版2019 多选版）

第2节　基因工程的基本操作程序 1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。2.针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。3.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。 知识点一　基因工程操作的基本程序 目的基因的筛选与获取 ↓ 基因表达载体的构建 ↓ 将目的基因导入受体细胞 ↓ 目的基因的检测与鉴定 知识点二　目的基因的筛选与获取 1．目的基因 (1)概念：基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 (2)类型：根据不同的需求，目的基因是不同的，主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性，生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。 2．筛选合适的目的基因 方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 3．获取目的基因的方法：人工合成；利用PCR技术获取和扩增；构建基因文库等。 4．利用PCR获取和扩增目的基因 (1)PCR概念 PCR(聚合酶链式反应的缩写)：根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 (2)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列(目的：合成引物)。 (3)PCR条件 ①原料：4种脱氧核苷酸。 ②模板：加热变性解旋后的两条DNA母链。 ③酶：耐高温的DNA聚合酶。 ④引物：2种，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 ⑤其他条件：需要一定的缓冲液和能够自动调节温度的温控设备等。 易漏边角 (1)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。 (2)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。 (4)PCR过程(变性→复性→延伸) ①变性：当温度超过90__℃时，双链DNA解聚为单链。 ②复性：当温度下降到50__℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 ③延伸：当温度上升到72__℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 (5)结果：由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。 (6)反应仪器：PCR扩增仪(PCR仪)。 (7)产物鉴定：琼脂糖凝胶电泳。 特别提醒 1．PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR过程温度较高，所以需要能耐高温的DNA聚合酶。 2．由于DNA两条模板链中碱基序列并不相同，引物需要分别与两条模板链进行碱基互补配对，因此DNA两条模板链在进行扩增时，需要的引物碱基序列是不同的，克隆DNA时应加入两种引物。 3．两种引物都结合在DNA模板链的3′端，脱氧核苷酸连接在引物的3′端进行延伸。 4．n代后，DNA分子有2n个； n代后，DNA链有2n＋1条； n代后，含引物的DNA分子有2n个； n代后，共消耗了2n＋1－2个引物； 第n代复制，消耗了2n个引物。 知识点三　基因表达载体的构建——核心工作 1．目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 2．基因表达载体的组成 3．构建过程 (1)首先用一定的限制酶切割载体。 (2)然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 (3)再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处(如图)。 特别提醒 1．用同一种限制酶切割载体和含有目的基因的DNA在构建基因表达载体时容易造成载体和目的基因的自身环化和反向连接。可以同时用两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体(使得目的基因的一端与载体一端的黏性末端相同，而目的基因的另一端与载体另一端的黏性末端相同)。 2．目的基因插入载体的位置不是随机的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位，若目的基因插入启动子序列内部，启动子将失去原功能，同时也不能破坏所有标记基因，否则会不利于筛选。 知识点四　将目的基因导入受体细胞 1．将目的基因导入植物细胞 (1)花粉管通道法(我国独创) ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。 ②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 (2)农杆菌转化法 ①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 ②农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T­DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 ③转化过程：目的基因插入Ti质粒的T­DNA上→重组Ti质粒转入农杆菌→含重组Ti质粒的农杆菌侵染植物细胞→目的基因整合到受体细胞的染色体DNA中→表达。 2．将目的基因导入动物细胞 (1)方法：显微注射技术。 (2)受体细胞：受精卵。 3．将目的基因导入微生物细胞 (1)受体细胞：常用原核生物(使用最广泛的是大肠杆菌)。 (2)方法：用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。 特别提醒 农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析 (1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T­DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T­DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 (2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是将农杆菌(含目的基因)导入受体细胞。 知识点五　目的基因的检测与鉴定 1．操作目的：目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测和鉴定才能知道，这是检查基因工程是否成功的一步。 2．目的基因检测与鉴定的方法 类型 检测内容 方法 分子水平的检测　　 检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 PCR等技术 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗原— 抗体杂交技术 个体生物学水平的鉴定 检测表达产物是否具有生物学活性(或生物个体是否具有相应性状) 抗虫、抗病等接种实验 特别提醒 基因表达载体中已经具备标记基因(如抗生素抗性基因)，对受体细胞进行了筛选，基因工程的第四步还要对目的基因进行检测和鉴定的原因：在含抗生素的选择培养基上能生长的是导入了载体的细胞，这里的载体可能是基因表达载体，也可能是未插入目的基因的空载体。因此第四步需要对目的基因是否导入进行进一步的检测。此外，即便在选择培养基上能生长的细胞中导入的是基因表达载体，但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达，因此也需要在转录和翻译以及个体水平上进行检测和鉴定。 知识点六　实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 1．原理 (1)DNA片段的扩增 PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，利用PCR仪扩增DNA片段。 (2)电泳鉴定PCR的产物 ①电泳 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 ②鉴定方法 PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 ③鉴定原理 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 2．实验操作 (1)PCR扩增 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94 ℃，5 min — — 30次 94 ℃，30 s 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min 最后1次 94 ℃，1 min 55 ℃，30 s 72 ℃，10 min (2)PCR产物的鉴定——琼脂糖凝胶电泳 3．注意事项 (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 (2)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20__℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 (3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 (4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 课堂小结 1．(目标1)下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是(　　) A．启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核苷酸 B．基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因等组件 C．人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达 D．由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别 答案　B 解析　启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核苷酸，A正确；基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等组件，B错误；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，D正确。 2．(目标1)下列关于目的基因导入受体细胞的方法中，不正确的是(　　) A．我国利用花粉管通道法培育了转基因抗虫棉 B．用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 C．将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是显微注射法 D．利用农杆菌转化法培育大多数单子叶转基因植物 答案　D 解析　农杆菌转化法可将目的基因导入双子叶植物细胞和裸子植物，而农杆菌对大多数单子叶植物没有侵染能力，D错误。 3．(目标2)下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，不正确的是(　　) A．①→②利用两种不同限制酶处理，能避免含抗虫基因的DNA片段自身环化 B．②→③可用氯化钙处理农杆菌，有助于促进重组Ti质粒转化到农杆菌细胞中 C．③→④用农杆菌侵染植物细胞，重组Ti质粒整合到植物细胞的染色体上 D．④→⑤用植物组织培养技术培养，具有抗虫性状的植株产生了可遗传变异 答案　C 解析　图示是利用基因工程培育抗虫植物的示意图，其中①为质粒，作为载体；②为重组Ti质粒；③为含有重组Ti质粒的农杆菌；④为含有目的基因的植物细胞；⑤为转基因植株。①→②利用两种不同限制酶处理，能避免目的基因和质粒的自身环化，A正确；②→③可用氯化钙处理农杆菌，使之处于易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这样有助于促进重组Ti质粒转化到农杆菌细胞中，B正确；③→④用农杆菌侵染植物细胞，重组Ti质粒的T­DNA片段整合到植物细胞的染色体DNA上，C错误。 4．(多选)(目标3)下列关于利用PCR技术扩增目的基因的叙述，不正确的是(　　) A．PCR技术利用DNA半保留复制的原理，使核糖核苷酸序列呈指数方式增加 B．扩增目的基因前，需要设计可与目的基因的碱基序列互补的两种双链引物 C．基因的扩增依赖于模板、耐高温的DNA聚合酶和原料等物质 D．加热至90 ℃以上的目的是使基因的磷酸二酯键断裂 答案　ABD 解析　PCR技术利用DNA半保留复制的原理，DNA的基本单位为脱氧核苷酸，A错误；在扩增目的基因前，需要设计可与目的基因的碱基序列互补的两种单链引物，在复性时引物分别与目的基因的两条链结合形成双链，使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3′端进行延伸，B错误；从整个PCR过程：高温变性、低温复性、中温延伸，可以确定，在扩增过程中需依赖于目的基因的模板、耐高温的DNA聚合酶和相应原料(脱氧核苷酸)等物质，C正确；加热至90 ℃以上的目的是使基因的两条链断开，因此高温破坏的是两条链间的氢键，D错误。 5．(目标3)(2021·全国甲卷)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题： (1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是________(用数字序号表示)。 (2)操作③中使用的酶是______________________。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是__________________________________________。 (3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与______________特异性结合。 (4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指__________________________________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。 答案　(1)④②③① (2)耐高温的DNA聚合酶　延伸　引物结合到互补DNA链 (3)病原菌的DNA解旋成的单链 (4)在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术 题型一　PCR过程分析 例1　科学家将海鱼的抗冻蛋白基因用PCR技术扩增，如图1是扩增的目的基因的示意图。为寻找合适的载体，科学家对某载体用EcoRⅠ和SmaⅠ两种限制酶进行酶切后，再利用琼脂糖凝胶电泳得到图2所示图谱(其中1号泳道是标准DNA样品的电泳结果，2号、3号、4号泳道分别是EcoRⅠ单独处理、SmaⅠ单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果)。下列说法错误的是(　　) A．应选用引物2和引物3对目的基因进行扩增 B．扩增5次后有16个等长的目的基因片段 C．凝胶中的DNA分子经过染色可在紫外灯下观察得到图2所示图谱 D．由图2可知该载体DNA分子中两种限制酶的酶切位点各有一个 解题分析　DNA聚合酶只能从引物的3′端开始延伸DNA链，因此应选用引物2和引物3对目的基因进行扩增，A正确；在PCR仪中经过5次循环后会产生25＝32(个)DNA片段，其中只有2个DNA片段含有最初的模板链，另外以由引物参与合成的与最初模板链配对的单链为模板形成的DNA片段的两条链不等长，这样的DNA片段有8个，因此经过5次复制产生的等长的目的基因片段有32－10＝22(个)，B错误；凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，C正确；当仅用一种限制酶切割载体时，图中的2号、3号泳道仅产生一种长度的DNA片段，当用两种限制酶切割载体时，图中的4号泳道产生两种长度的DNA片段，说明该载体DNA分子中两种限制酶的酶切位点各有一个，D正确。 答案　B 例2　PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶酶切位点等。下列叙述正确的是(　　) A．该图表示PCR循环中的变性环节 B．脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到引物的5′端 C．耐高温的DNA聚合酶催化相邻的两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键 D．用图中引物扩增两个循环后即可获得两端添加限制酶酶切位点的目标产物 解题分析　图中引物与模板链碱基互补配对，该图表示PCR循环中的复性环节，A错误；DNA聚合酶只能催化脱氧核苷酸连接在引物的3′端，B错误；延伸时，在耐高温的DNA聚合酶催化下，相邻的脱氧核苷酸间形成磷酸二酯键，C正确；由于两个引物均不在该片段的端点，因此第一轮循环后得到的两个DNA片段中两条脱氧核苷酸链都不等长，第二轮中亦不会出现两条链等长的目的DNA片段，在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，所以第三轮循环后可获得两端添加限制酶酶切位点的目的产物，D错误。 答案　C 题后归纳 引物的考点总结 (1)引物的本质：一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸(DNA或RNA单链)，用于PCR扩增的引物长度一般为20～30个核苷酸。 (2)引物的作用：DNA聚合酶不能从头开始合成子链，引物能够使DNA聚合酶能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 (3)PCR扩增时，一般选择两种引物，且两种引物分别与两条模板链结合。 (4)若目的基因两侧没有酶切位点，设计引物时，可在引物的5′端加上限制酶识别序列。 题型二　启动子、终止子、起始密码子和终止密码子的区分 例3　(多选)下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，不正确的是(　　) A．起始密码子是一段DNA序列，位于胰岛素基因的上游 B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点 C．抗生素抗性基因可用于将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来 D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用 解题分析　起始密码子是mRNA上三个相邻的碱基，是翻译的开始信号，A错误；基因表达载体的复制原点和启动子是不同的位点，基因表达载体的复制开始于复制原点，胰岛素基因的转录开始于启动子，B错误；抗生素抗性基因可作为基因工程中的标记基因，可用于将含有目的基因的受体细胞筛选出来，C正确；启动子在基因表达的转录中起作用，终止密码子在基因表达的翻译中起作用，D错误。 答案　ABD 题后归纳 1．启动子、终止子、起始密码子和终止密码子的比较 分类 项目 　 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 位置 基因的上游 基因的下游 mRNA上 mRNA上 本质 DNA序列 DNA序列 RNA序列 RNA序列 作用 RNA聚合酶识别和结合的部位，启动基因的转录 终止基因的转录 蛋白质合成开始的信号 蛋白质合成终止的信号 2．真、原核细胞基因的结构和表达 (1)基因的结构 (2)基因表达遗传信息 ①原核生物基因 ②真核生物基因 题型三　限制酶的选择 例4　肿瘤坏死因子(TNF)在体内和体外均能杀死某些肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞的增殖，科研人员欲利用乳腺生物反应器大量生产TNF，用于临床上疾病的治疗。已知HindⅢ、BamHⅠ、BglⅡ和PstⅠ为限制性内切核酸酶，识别的序列均不相同。下列关于基因工程中重组质粒构建的说法，正确的是(　　) A．可选用PstⅠ、BglⅡ和HindⅢ、BglⅡ两种组合切割质粒和目的基因 B．可用DNA连接酶或DNA聚合酶连接TNF基因和切割开的质粒 C．大多数限制酶的识别序列由8个核苷酸组成 D．四环素抗性基因属于标记基因，便于鉴别受体细胞中是否含有目的基因 解题分析　据图可知，限制酶PstⅠ切割质粒时，会将质粒切成两段，且会破坏标记基因并丢失启动子序列，因此不能选用PstⅠ、BglⅡ这一组合，A错误；不能使用DNA聚合酶连接目的基因和切割开的质粒，应使用DNA连接酶，B错误；大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，C错误；四环素抗性基因属于标记基因，便于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，D正确。 答案　D 技法提升 构建基因表达载体时限制酶的选择 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 (4)所选择的限制酶的切割位点应位于启动子和终止子之间，以保证目的基因可以转录。 题型四　含目的基因的受体细胞的筛选 例5　(多选)下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法正确的是(　　) A．将重组质粒导入细菌B常用的方法是Ca2＋转化法 B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的是导入了重组质粒的细菌 C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，导入了质粒A或重组质粒的细菌能够在该培养基上生长 D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长 解题分析　基因必须保持结构的完整性才能得以表达，质粒A和重组质粒中氨苄青霉素抗性基因结构完整，能够表达而使细菌具有对氨苄青霉素的抗性，所以在含有氨苄青霉素的培养基上能存活的是导入了质粒A或导入了重组质粒的细菌，C正确；由于将人的生长激素基因插入质粒的四环素抗性基因上，破坏了四环素抗性基因的完整性，导入了重组质粒的细菌对四环素没有抗性，在含有四环素的培养基上不能存活，能存活的是导入了质粒A的细菌，B错误；目的基因成功表达的标志是产生人的生长激素，D错误。 答案　AC 技法提升 如何筛选出含有目的基因的受体细胞 (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入到某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入到四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌可能有：含目的基因—目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒—质粒的细菌、含质粒的细菌、含目的基因的细菌等。 (3)筛选方法：将转化后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌、含质粒的细菌和含质粒—质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有重组质粒的菌落，如图1、5。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 题型五　电泳鉴定PCR产物 例6　在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因表达载体，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述错误的是(　　) A．电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程，带电分子会向着电荷相反的电极移动 B．该载体最可能是环状DNA，两种限制酶在载体上各有一个酶切位点 C．限制酶R1和R2的酶切位点最短相距约200 bp D．DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率只与凝胶的浓度有关 解题分析　电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，A正确；由题可知，当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，只有1条片段，故该载体最可能是环状DNA，两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；由题可知，两种限制酶同时切割时则产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点至少相距200 bp，C正确；PCR扩增的DNA片段在琼脂糖凝胶中迁移的速率与凝胶浓度、DNA分子大小、构象等有关，D错误。 答案　D 例7　为优化目的基因(700 bp)的PCR条件，研究者设计不同的复性温度进行实验，产物的琼脂糖凝胶电泳结果如下图。下列表述错误的是(　　) A．对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同 B．电泳条带的宽度、亮度与DNA的含量呈正相关 C．复性温度的高低不会影响PCR扩增产物的纯度 D．58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度 解题分析　实验设计应遵循对照原则与单一变量原则，故对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同，A正确；PCR扩增时，复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低，易造成引物与模板错配，进而影响PCR扩增产物的纯度，C错误；据图可知，58 ℃条件下条带宽度最大，故该温度是本实验中扩增该基因的最佳复性温度，D正确。 答案　C 归纳总结 影响PCR扩增产物纯度的因素 (1)复性温度：若复性温度过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；复性温度过低，易造成引物与模板错配，非特异性产物增加。(PCR扩增时的复性温度取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，引物长度越短，引物中G＋C含量越低，所需复性温度越低。) (2)引物设计不合理，如特异性长度不够，引物之间形成二聚体等。 (3)耐高温的DNA聚合酶质量不好。 课后课时作业 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 难度 ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ 对点 PCR PCR引物确定 基因表达载体 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 将目的基因导入受体细胞 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 题号 9 10 11 12 13 14 15 难度 ★ ★ ★★★ ★★ ★★ ★ ★★★ 对点 目的基因的检测与鉴定 DNA片段的扩增及电泳鉴定 PCR 基因工程的程序 基因工程的程序 基因工程的程序 融合PCR技术 [单项选择题] 知识点一　目的基因的筛选与获取 1．扩增特定DNA片段可利用PCR技术，下列有关描述不正确的是(　　) A．利用PCR技术扩增目的基因时不需要解旋酶，但需要耐高温的DNA聚合酶 B．引物是子链合成和延伸的基础，子链沿着模板链的3′→5′方向延伸 C．利用PCR技术扩增目的基因时，需知道目的基因的全部核苷酸序列 D．复性温度过高，可能导致PCR得不到任何扩增产物 答案　C 解析　利用PCR技术扩增目的基因时不需要解旋酶，该过程中氢键的断裂是通过高温完成的，而子链延伸过程需要耐高温的DNA聚合酶，A正确；耐高温的DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸子链(子链的延伸方向是从5′→3′端)，即子链沿着模板链的3′→5′方向延伸，B正确；利用PCR技术扩增目的基因时不需要知道目的基因的全部核苷酸序列，只需要知道目的基因两端的部分核苷酸序列即可，C错误；复性温度过高会导致引物无法与模板结合，从而导致无扩增产物形成，D正确。 2．若想获得以下已知序列的DNA片段，设计了一些PCR引物，应选用的PCR引物是(　　) DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知序列 PCR引物 ①5′AACTATGCGCTCATGA3′ ②5′GCAATGCGTAGCCTCT3′ ③5′AGAGGCTACGCATTGC3′ ④5′TCATGAGCGCATAGTT3′ A．①③ B．①④ C．②③ D．③④ 答案　A 解析　引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，引物的5′端需要结合到模板链的3′端。 知识点二　基因表达载体的构建 3．下列关于基因表达载体的说法，不正确的是(　　) A．基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤 B．复制原点的存在有利于目的基因在受体细胞中扩增 C．终止子位于目的基因的下游，能够终止翻译过程 D．不同的目的基因所需的启动子不一定相同 答案　C 4．如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法不正确的是(　　) A．图示过程是基因工程的核心步骤 B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ C．卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 答案　B 解析　图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤，A正确；构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，SmaⅠ会破坏目的基因，B错误；卡那霉素抗性基因是标记基因，目的是便于筛选含有目的基因的细胞，C正确；基因表达载体包括复制原点、启动子、目的基因、终止子和标记基因等，D正确。 知识点三　将目的基因导入受体细胞 5．下列关于目的基因导入受体细胞的相关叙述错误的是(　　) A．目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化 B．农杆菌只能侵染双子叶植物和裸子植物 C．可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 D．可以用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使其能吸收周围环境中的DNA分子，有利于重组的基因表达载体导入其中 答案　B 解析　农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 6．下图表示利用基因工程生产胰岛素的三种途径，据图判断正确的是(　　) A．导入受体细胞C需要用Mg2＋处理使大肠杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 B．利用显微注射的方法将目的基因导入受体细胞A(受精卵)中 C．受体细胞B通常为莴苣的卵细胞，经脱分化、再分化形成个体 D．三种方法得到的胰岛素结构完全相同 答案　B 解析　将目的基因导入微生物细胞常用Ca2＋处理法，即用Ca2＋处理大肠杆菌，使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，利于完成转化过程，A错误；将目的基因导入动物细胞常采用显微注射法，因为高度分化的动物体细胞的全能性受到限制，因此，将目的基因导入动物细胞时一般选择动物的受精卵作为受体细胞，B正确；受体细胞B通常是莴苣的体细胞，目的基因导入该细胞后，需经脱分化和再分化过程形成转基因植株，C错误；三种方法所使用的受体细胞不同，因此经过基因的表达得到的胰岛素结构不完全相同，D错误。 7．自然状态下农杆菌能感染双子叶植物而通常不感染单子叶植物，是因为受伤的双子叶植物能分泌某些酚类物质诱导Ti质粒中的Vir基因区段表达，该表达产物能诱导Ti质粒产生一条新的T­DNA单链分子。此单链分子可进入植物细胞并整合到染色体上。下列相关叙述错误的是(　　) A．可以通过在伤口施加相关酚类物质而使单子叶植物也成为农杆菌易感植物 B．农杆菌感染宿主细胞的原理与肺炎链球菌转化实验的原理类似 C．使用农杆菌转化法时，目的基因应插入Ti质粒的T­DNA中 D．合成新的T­DNA单链需要DNA连接酶与限制酶 答案　D 解析　在自然条件下，农杆菌易感染双子叶植物和裸子植物，通常对单子叶植物没有感染力，原因是多数单子叶植物细胞不能分泌某些酚类物质，可以通过在伤口施加相关酚类物质而使单子叶植物也成为农杆菌易感植物，A正确；农杆菌感染宿主细胞的原理与肺炎链球菌转化实验的原理类似，实质都是基因重组，B正确；Ti质粒的T­DNA可转移到植物细胞中，并能整合到染色体DNA上，因此，目的基因应插入Ti质粒的T­DNA中，C正确；Ti质粒中的Vir基因区段的表达产物能诱导Ti质粒产生一条新的T­DNA单链分子，而合成新的T­DNA单链不需要限制酶，一般需要DNA聚合酶、DNA连接酶等，D错误。 知识点四　目的基因的检测和鉴定 8．转基因抗虫棉培育过程中，下列有关目的基因检测与鉴定方法的叙述，错误的是(　　) A．检测抗虫基因是否导入——农杆菌转化法 B．检测抗虫基因是否转录——PCR技术 C．检测抗虫基因是否翻译——抗原—抗体杂交 D．检测抗虫蛋白生物功能——抗虫接种实验 答案　A 解析　将抗虫基因导入受体细胞可以采用农杆菌转化法，但检测目的基因是否导入受体细胞一般采用PCR等技术，A错误；检测抗虫蛋白生物功能，可在个体水平进行抗虫接种实验，让害虫来食用棉花叶片，做毒性检测，D正确。 9．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基因在受体细胞中完成了表达的是(　　) A．从酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白 B．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列 C．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA D．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因 答案　A 解析　基因表达的产物是蛋白质，因此，只有在受体细胞中检测或提取到了相应蛋白质才能证明目的基因在受体细胞中完成了表达，B、D两项只能说明完成了目的基因的导入，C项只能说明完成了目的基因的导入和目的基因的转录过程。 知识点五　实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 10．人体内一些正常或异常细胞脱落破碎后，其DNA会以游离的形式存在于血液中，称为cfDNA。近几年，结合PCR及电泳鉴定、DNA测序等技术，cfDNA在临床上得到了广泛应用。下列相关说法不正确的是(　　) A．PCR反应中设置不同的温度是为了使DNA聚合酶催化不同的反应 B．在琼脂糖凝胶中，cfDNA的迁移速率与cfDNA分子的大小、构象等有关 C．在进行电泳时，要预留一个加样孔，加入指示分子大小的标准参照物 D．对cfDNA进行检测，可以用于肿瘤的早期筛查 答案　A 解析　PCR反应中温度的周期性改变是为了使解旋变性、复性、延伸循环进行，A错误；分子的大小、构象、凝胶的浓度，电泳的电压大小等都会影响分子迁移速率，B正确；cfDNA是人体内一些正常或异常细胞脱落破碎后形成的游离DNA，所以可通过检测cfDNA中的相关基因，判断其来自正常或异常细胞，并进行肿瘤的筛查，D正确。 [多项选择题] 11．农杆菌Ti质粒上的T­DNA可以转移并随机插入到被侵染植物的染色体DNA中。研究者将下图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T­DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T­DNA插入的具体位置。下列相关叙述正确的是(　　) A．PCR技术依据的原理是DNA的半保留复制 B．引物序列过短不会影响PCR扩增的特异性 C．选择图中的引物①、④组合可扩增出两侧的未知序列 D．通过与受体细胞的基因组序列比对来确定T­DNA的插入位置 答案　ACD 解析　PCR技术依据的原理是DNA的半保留复制，A正确；引物过短时与目标基因匹配的特异性差，从而导致PCR扩增的特异性较差，B错误；DNA的两条链反向平行，子链从引物的3′端开始延伸，利用图中的引物①、④组合可扩增出两侧的未知序列，C正确；通过与受体细胞的基因组序列比对，即可确定T­DNA的插入位置，D正确。 12．如图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。下列相关说法正确的是(　　) A．图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶 B．图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入农杆菌细胞 C．图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞 D．剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达 答案　ABCD 解析　图中Ⅰ为质粒，步骤①为基因表达载体的构建，需要用到限制酶和DNA连接酶，A正确；图中步骤②是将重组质粒导入农杆菌细胞，B正确；基因的表达具有一定的独立性，剔除抗虫棉体内的四环素抗性基因不影响抗虫基因的表达，D正确。 13．下图为转基因抗冻番茄培育过程的示意图(其中ampr为氨苄青霉素抗性基因)。下列叙述正确的是(　　) A．质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞和促进目的基因的表达 B．选用限制酶PstⅠ、SmaⅠ对含目的基因的DNA和质粒进行剪切 C．过程②可用农杆菌转化法将含目的基因的表达载体导入受体细胞 D．④过程中可利用含氨苄青霉素的培养基对植株进行筛选 答案　BC 解析　质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞，但不能促进目的基因的表达，A错误；目的基因两侧是限制酶PstⅠ和SmaⅠ的识别序列，且质粒上也含有这两种限制酶的切割位点，所以可选用限制酶PstⅠ、SmaⅠ对含目的基因的DNA和质粒进行切割，B正确；将目的基因导入植物细胞时，可用农杆菌转化法，C正确；图中过程④是进行移栽，不能再利用含氨苄青霉素的培养基来筛选含有目的基因的幼苗，应该在个体水平上进行抗冻性状检测，D错误。 [非选择题] 14．某研究小组为了研制预防SARS病毒的疫苗，开展了前期研究工作。其简要的操作流程如下，回答下列问题： (1)实验步骤①所代表的过程需要________酶催化。 (2)如果省略步骤②而将大量扩增的S基因直接导入大肠杆菌，一般情况下，不能得到表达的S蛋白，其主要原因是S基因在大肠杆菌中不能________，也不能____________________________。 (3)为了检验步骤④所表达的S蛋白是否与病毒S蛋白有相同的免疫反应特性，可用____________________与______________________进行抗原—抗体特异性反应实验，从而得出结论。 答案　(1)逆转录 (2)稳定存在　合成S基因的mRNA(或转录) (3)大肠杆菌中表达的S蛋白　SARS康复病人的血清 15．融合PCR技术(fusionPCR)采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来，为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。图1表示融合PCR技术的过程示意图(P1～P4表示引物)，图2表示融合后产物的电泳图。 (1)从化学本质上来说，引物是__________________________，作用是____________________________________________。 (2)图1过程设计的P2与P3引物的添加序列必须能够发生______________。融合PCR步骤1中，至少进行________次循环才能获得图中所示的基因A的PCR产物。 (3)融合PCR步骤2中基因A、B融合形成一个基因的机制是________________________________________________________________________________________________。若要对A、B融合基因继续进行PCR扩增，则图1中的M、N处位置所需要的引物分别是________。 (4)图2中电泳图中________号条带最可能表示融合后片段，若PCR反应没有扩增出任何产物，则可能的原因是______________________________________________________(至少两点)。 答案　(1)一小段单链核酸　使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 (2)部分碱基互补配对　2 (3)引物P2与P3添加序列的互补链发生碱基互补配对，然后在耐高温DNA聚合酶的作用下向两边延伸，基因A、B完成融合　P1、P4 (4)4　复性温度太高；引物设计不合理无法与目的基因结合 解析　(1)引物是一小段单链DNA或RNA，能与目的基因碱基互补配对，其作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 (2)由于A、B基因需要融合，融合依据的原理是碱基互补配对，因此在引物设计时P2与P3引物对应的序列就要求部分碱基能互补配对。RCR经过两次循环才能获得基因A的PCR产物。 (3)由图可知，引物P2与P3添加序列的互补链发生碱基互补配对，然后在耐高温的DNA聚合酶的作用下向两边延伸，使基因A、B完成融合。根据引物延伸的方向，N处添加的引物是P4，M处添加的引物是P1。 (4)融合后的片段长度更长，很有可能是4号条带。PCR技术没有扩增出目的基因的原因包括：复性温度太高；引物设计不合理无法与目的基因结合等。 25 学科网（北京）股份有限公司 $$