专题15 基因工程-【好题汇编】2025年高考生物一模试题分类汇编（新高考通用）

专题15 基因工程 考点概览 考点01基因工程 考点02生物技术的伦理和安全 基因工程考点01 一、单选题 1．（2025·贵州铜仁·一模）水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。研究人员发现用赖氨酸替换水蛭素第47位的天冬酰胺可以提高它的抗凝血活性。下列叙述正确的是（　　） A．该项替换研究中，目前可行的直接操作对象是蛋白质 B．该项替换研究中，改造前后水蛭素的空间结构未发生改变 C．该项替换研究的思路与按照中心法则合成蛋白质的思路一致 D．改造的水蛭素基因导入微生物后可利用发酵工程生产水蛭素 2．（2025·山西·一模）人参这种珍贵中药材的药效主要由人参皂苷发挥作用。科研人员将合成人参皂苷Rh2的关键酶基因（UGT和D12H）导入酿酒酵母，实现了多基因表达，从而实现人参皂苷Rh2工厂化生产。下图为相关操作流程图，①~④表示过程。下列叙述正确的是（　　） A．①需要先将RNA反转录出DNA，再利用PCR获取和扩增目的基因 B．②利用PCR在目的基因上添加酶切位点时，需在引物的3'端引入该位点 C．③是基因表达载体的构建，将目的基因1连接在启动子1的上游 D．启动子是一段有特殊序列的DNA片段，是DNA聚合酶识别和结合的部位 3．（2025·河北邯郸·一模）下列有关“DNA的粗提取与鉴定”“琼脂糖凝胶电泳”实验的相关说法，正确的是（    ） A．利用酒精初步分离DNA与蛋白质的原理是DNA溶于酒精 B．过滤后的研磨液放置在4℃冰箱中可防止DNA被降解 C．琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子越大，迁移速率越快 D．提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后即可变为蓝色 4．（2025·山东青岛·一模）野生大豆的SAMS基因具有提高抗逆性的作用。水稻是一种盐敏感型作物，为提高水稻的抗盐碱胁迫能力，研究者将野生大豆的SAMS基因转入水稻细胞内，从而培养出转基因水稻株系，具体过程如图。下列说法错误的是（    ） A．图示过程中发生了两次转化 B．Ⅰ和Ⅲ都需使用固体培养基 C．Ⅰ中的筛选可使用PCR技术 D．获得的转基因水稻苗都具备抗盐碱能力 5．（2025·山东青岛·一模）酶联免疫吸附测定是一种灵敏的免疫检测技术，过程如图。下列说法错误的是（    ） A．该技术可以用来检测特定抗原的浓度 B．两种抗体与特定抗原的同一区域结合 C．第二种抗体可以用蛋白质工程来制备 D．加入底物前需要漂洗掉未结合的抗体 6．（2025·山东青岛·一模）已知紫外线（UV）可诱导DNA单链上相邻的T之间相互结合形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对而导致复制错误引起突变，DNA修复机制对维持遗传稳定性至关重要。研究人员发现某细菌中存在两种如图所示修复机制：①光复活修复：光复活酶（PRE）在可见光下直接切割二聚体，恢复原结构；②暗修复：无需光照，通过切除损伤单链并重新合成。下列说法正确的是（    ）    A．PRE可将嘧啶二聚体的磷酸二酯键断开 B．暗修复过程中还需消耗原料、能量和引物 C．PRE基因发生碱基替换后，在光照下PRE的修复功能可能正常 D．UV诱导DNA形成嘧啶二聚体引起的变异不可遗传 7．（2025·山东青岛·一模）采用PCR技术可获取并扩增目的基因。下列说法正确的是（    ） A．若PCR的模板是mRNA，完成扩增只需要逆转录酶 B．预变性有利于模板DNA充分解聚为单链 C．复性温度太高会导致引物和模板的非特异性结合增加 D．一个DNA模板完成第20轮循环需要（220-2）个引物 8．（2025·河北石家庄·一模）研究人员将胰岛素B链的第28位氨基酸替换为天冬氨酸，抑制了胰岛素聚合，从而获得速效胰岛素类似物。下列叙述正确的是（    ） A．该产品是通过直接改造胰岛素来生产的 B．改变氨基酸的种类不会影响胰岛素的空间结构 C．可通过定向诱导胰岛素基因碱基增添达到改造目的 D．胰岛素改造的基本思路与天然蛋白质合成过程相反 9．（2025·河北石家庄·一模）原生质体比正常植物细胞更易接受外源DNA，其制备过程主要包括取材→剪碎→酶解。下列叙述错误的是（    ） A．细胞壁可能会阻止外源DNA进入细胞 B．取材后需用酒精和次氯酸钠对材料灭菌 C．剪碎的目的是使酶与细胞充分接触 D．可用台盼蓝染液来鉴定原生质体活性 10．（2025·广东深圳·一模）研究者从酵母菌中获取控制细胞色素氧化酶（存在于线粒体）的某一段肽合成的DNA片段，将其与小鼠的二氢叶酸还原酶（只存在于细胞质基质）基因融合。重组基因在酵母菌表达后，在线粒体中发现了二氢叶酸还原酶。该研究的目的是（    ） A．获得融合蛋白 B．研究该段肽的作用 C．引导二氢叶酸还原酶进入线粒体 D．研究重组基因的功能 11．（2025·宁夏银川·一模）下图为构建基因表达载体和检测受体细胞是否含有目的基因的过程示意图，其中LacZ基因控制合成的酶可以分解物质X产生蓝色物质，使平板上形成的菌落呈蓝色，否则菌落为白色。图中③过程所用培养基含有氨苄青霉素和物质X。下列叙述错误的是（    ）    A．①过程需要使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶 B．实验结果中形成的蓝色菌落中的大肠杆菌含有目的基因 C．③过程使用的培养基中含有氨苄青霉素，属于选择培养基 D．可用处理大肠杆菌使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 12．（2025·安徽马鞍山·一模）为提高水稻的产量，科研人员将四种基因（EcCAT、OsGLO1、EcGCL、TSR）与叶绿体转运肽基因连接，构建多基因表达载体，引导合成的蛋白质定向运输至叶绿体，从而在水稻叶绿体内构建了一条新的代谢途径。下列说法正确的是（　　） A．T-DNA插入到水稻的染色体DNA中可能会影响水稻自身基因的表达 B．含卡那霉素的培养基上不能存活的水稻细胞未成功导入四种目的基因 C．限制酶识别特定的序列具有专一性，DNA连接酶不具有专一性 D．目的基因产物转运至叶绿体，避免了目的基因通过花粉转移到近缘植物 13．（2025·天津武清·一模）下列有关教材实验探究的说法正确的是（    ） A．猪红细胞是实验“DNA粗提取与鉴定”的良好材料 B．“探究酵母菌细胞的呼吸方式”的实验中无氧气组为对照组 C．“探究土壤微生物的分解作用”实验中，利用了减法原理“ D．设计预实验是为了避免实验数据的偶然性，减少误差 14．（2025·福建龙岩·一模）柳穿鱼花的形态有两侧对称型（野生型）和辐射对称型（突变型），柳穿鱼花的形态与Lcyc基因直接相关，两种类型体内Lcyc基因的序列相同。研究人员将野生型植株A与突变型植株B杂交得到，自交得到的中野生型：突变型=34：5，该结果不符合典型孟德尔性状分离比。为弄清其产生原因，研究人员进行下表所列实验，下列叙述错误的是（　　） 实验处理 结果 实验一：检测植株A、B花芽细胞中的mRNA 植株A花芽细胞中含有Lcyc基因转录的mRNA 植株B花芽细胞中不含Lcyc基因转录的mRNA 实验二：用两种限制酶对植株A、B的Lcyc基因进行酶切，酶切位点如图1。若识别位点附近被甲基化则PstI无法识别对应序列。 植株A的Lcyc基因经酶切产生1.5kb、0.7kb、0.2kb三种片段；植株B的Lcyc基因经酶切产生2.4kb一种片段 A．实验一证明植株B花形为辐射对称的原因是Lcyc基因不表达 B．实验二证明植株B的Lcyc基因中PstI酶切位点附近发生甲基化 C．实验一、二说明植株B碱基的甲基化特征可以遗传给后代 D．中突变型占5/39是Lcyc基因选择性表达的结果 15．（2025·福建龙岩·一模）科研人员利用两种识别不同序列的限制酶（E1和E2）处理某一基因表达载体后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．该载体的长度约为800bp，E1和E2在该载体上的酶切位点最短相距约400bp B．电泳加样时，将扩增得到的PCR产物与电泳缓冲液（内含指示剂）混合，注入加样孔内 C．待观察到DNA片段前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 D．凝胶中的DNA分子与核酸染料结合后可以在紫外灯下被检测出来 16．（2025·黑龙江吉林·一模）新型蛋白质进化模型EVOLVEpro可以利用氨基酸序列，仅通过少量学习和最低限度的实验测试来预测蛋白质空间结构，从而获得新型高活性蛋白质改造方案。下列有关说法正确的是（    ） A．预测蛋白质结构需要依据肽链中肽键的结构、氨基酸的物理性质与结构 B．氨基酸是蛋白质的基本单位，氨基酸发生替换一定使蛋白质的结构和功能发生改变 C．EVOLVEpro在蛋白质工程广泛应用后将不再需要借助基因工程手段改造蛋白质 D．通过EVOLVEpro得到的蛋白质还需要进行进一步的功能检测实验才可以投入生产 17．（2025·广东深圳·一模）为探究DNA片段P与O2蛋白结合的关键位点，研究者获得片段P不同位点的突变体M1、M2和M3，用O2蛋白进行结合试验，并用指示探针（带荧光的片段P）等进行检测，结果如图。下列分析正确的是（    ） 注：“－”表示未添加，“+”表示添加，指示探针的浓度很低 A．条带1越宽说明O2蛋白与待测物的结合越强 B．显示条带2就说明O2蛋白与P无法结合 C．M1的突变位点几乎不影响O2蛋白的结合 D．M2和M3与O2蛋白的结合强度相同 18．（2025·山东济宁·一模）端粒学说是细胞衰老的假说之一，研究发现，端粒缩短与DNA复制方式有关。人体细胞内DNA复制部分过程如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．图示体现了DNA半保留复制、双向复制的特点 B．图示引物为短单链核酸，复制过程中会被酶切除 C．PCR扩增的原理与生物体内DNA复制的原理相同 D．端粒缩短的原因是新合成的子链5'端变短 19．（2025·江西·一模）由于花椰菜杂种优势在提高花椰菜产量方面发挥着巨大的作用，而利用细胞质雄性不育系生产杂交种子，可以简化制种程序。利用原生质体非对称融合技术比较容易实现胞质雄性不育基因的转移，某研究利用该技术成功获得了含有胞质雄性不育基因的花椰菜植株，制作流程如下，下列说法错误的是（    ）    注：UV处理可以随机破坏染色体结构，使其发生断裂、丢失等，使细胞不再分裂 A．原生质体非对称融合技术使得杂种植株性状更接近于供体植株 B．②过程的原理是细胞膜具有一定的流动性，常用PEG融合法 C．培养一段时间后可通过观察叶绿体初步判断是否为异源原生质体 D．为鉴定再生植株成功获得细胞质雄性不育基因，可利用PCR进行鉴定 20．（2025·湖北武汉·一模）PCR技术的每轮循环可以分为变性、复性、延伸三步。引物与其模板链形成的杂合分子的解链温度称为引物的Tm值。下列叙述正确的是（    ） A．引物与模板链的结合属于延伸过程 B．变性过程的温度一般要低于复性过程 C．复性过程的温度应设置为略低于Tm值 D．引物的 Tm 值越接近,引物之间越容易结合 21．（2025·福建厦门·一模）RT-PCR是将RNA逆转录（RT）成cDNA（与mRNA互补的DNA单链）和聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术，具体过程如图所示，下列叙述正确的是（　　） A．过程Ⅰ获得cDNA的过程与DNA复制过程中碱基配对方式相同 B．图中A、B两种引物在72°C时通过碱基互补配对结合到模板链 C．图中子链的合成均是以四种核糖核苷酸为原料从引物的一端开始的 D．过程Ⅱ中，若进行6轮循环，则共需要加入引物的数量为63个 22．（2025·四川巴中·一模）科学家发现一未知DNA分子，该DNA分子存在多种限制酶切位点。研究人员利用三种限制酶对该DNA分子进行不同的酶切处理，将处理后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图所示。据图推断，下列选项最可能为该DNA分子原始图谱的是（　　） A． B． C． D． 23．（2025·陕西西安·一模）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，正确的是（　　） A．在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关 B．鉴定DNA时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中进行沸水浴 C．选用植物细胞提取DNA时，研磨后用滤纸进行过滤 D．琼脂糖凝胶加样孔一端朝向电泳槽的正极 二、多选题 24．（2025·江西·一模）除草剂有效成分草甘膦的作用机理是和PEP竞争性结合EPSP合酶，从而扰乱生物体的正常氮代谢。但作为一种非选择性除草剂，草甘膦对农作物同样具有杀伤作用，这大大限制了其在农业生产中的应用，培育抗草甘膦作物将会解决这一难题。下列说法错误的是（    ） A．长期使用草甘膦除草剂，会导致杂草产生抗除草剂突变，降低除草剂的效果 B．根据草甘膦的作用机理，可通过导入强启动子使EPSP合酶过量表达获得抗草甘膦作物 C．可通过蛋白质工程直接替换EPSP合酶个别氨基酸，使草甘膦无法与EPSP酶结合 D．在培育抗草甘膦作物时，为避免外源基因流入杂草，最好将外源基因插入细胞核基因组 25．（2025·江西·一模）融合PCR技术（SOE PCR）是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分作为模板进行PCR扩增，连接两段基因以获得目的基因的方法。通过SOE PCR将鸡干扰素α基因（甲）和鸡白介素18基因（乙）连接的过程如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．融合PCR技术的每次循环都需经历两次降温和一次升温 B．两基因融合过程既需限制酶，也需耐高温的DNA聚合酶 C．图中PCR1至少需经过2次PCR循环才可获得双链等长的DNA片段 D．引物3是同时依据鸡干扰素α基因和鸡白介素18基因的碱基序列设计的 26．（2025·河北沧州·一模）基因工程可将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。下列相关叙述正确的是（　　） A．基因工程需引物是因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA B．引物设计时既要考虑目的基因的碱基序列，还要考虑载体的碱基序列 C．为便于目的基因与载体连接，需在引物的3′端加上限制酶的酶切位点 D．用同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒，在DNA连接酶作用下可能会反向连接 27．（2025·山东枣庄·一模）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”（实验1）和“DNA的粗提取与鉴定”（实验2）的实验操作，下列相关叙述错误的是（　　） A．实验1中，DNA电泳时需要在琼脂糖熔化之后凝固之前加入核酸染料 B．实验1中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源 C．实验2中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积的体积分数为70%的冷酒精后析出DNA D．实验2中，需先将白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺试剂并进行沸水浴，用于鉴定DNA 三、非选择题 28．（2025·天津蓟州·一模）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)进行PCR扩增时需要耐高温的DNA聚合酶，为使其活化应在PCR反应缓冲液中加入 （填“Ca2+”或“Mg2+”）。 (2)有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R应在下列选项中分别选用 。 A．5'-ATGGTG……CAACCA-3' B．5'-TGGTTG……CACCAT-3' C．5'-GACGAG……CTGCAG-3' D．5'-CTGCAG……CTCGTC-3' (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在酶的作用下可形成环形质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要是 。 (4)构建好的重组质粒除了含有目的基因、标记基因，还要有 ，用以控制目的基因的表达。 (5)如何将重组质粒导入大肠杆菌？ 。 (6)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3.根据图中结果判断，符合要求的质粒为 。 29．（2025·黑龙江·一模）研究人员通过基因工程制备了能生产乙肝病毒抗原蛋白的酿酒酵母。抗原蛋白基因转录的模板链碱基序列为5'-GATTCG-3',5'-CCATGC-3'。如图表示育种过程利用的载体及限制酶的识别序列（注：假设目的基因内不含有相应酶的识别序列）。    (1)在通过PCR扩增目的基因片段的反应条件中，预变性的目的是 。在实际PCR反应中，扩增效率通常低于100%。若某次PCR反应的扩增效率为80%（PCR扩增效率是指在PCR反应中，每个循环中目标DNA分子的实际增加倍数与理论增加倍数的比值），初始模板DNA的量为10ng，经过25个循环后，实际获得的PCR产物量为 ng。 (2)据图分析，为了构建基因表达载体，我们应选择 来切割载体。由于抗原蛋白基因无法直接插入载体中，因此需要通过设计特定的引物，这些引物不仅包含与目的基因两端匹配的序列，还需包含特定的酶切位点，以便在扩增后能够与载体进行连接。引物的碱基序列从5'端到3'端依次 、 。 (3)真核生物的基本启动子没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列，可增强一个或多个基因的转录水平（如图）。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。    ①对文中“增强子”的理解，错误的是 A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B．一个增强子只能作用于一个基本启动子 C．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 D．很多增强子在不同组织中的活性不同 ②科学家鉴定出小鼠某胚胎细胞内一个增强子附近有两个基因A和B，为了确定这两个基因是否为特异表达的基因，他们应该检测 。 (4)检测受体细胞是否成功导入了重组载体，除了利用利用抗生素抗性筛选，还可以利用 方法。 30．（2025·河北石家庄·一模）草甘膦是一种广泛使用的除草剂，对大多数植物都具有杀灭作用。为在作物生长期间定向除草，研究人员改变芥菜EPSPS基因特定位点，将其导入芥菜，培育出了抗草甘膦的新品种，操作流程如图。回答下列问题：    (1)过程①为 ，其需要在缓冲液中进行，缓冲液的作用是 ；①与②（PCR）的反应体系相比不同点有 （答出两点即可）。 (2)以cDNA为模板扩增EPSPS基因后一般通过 鉴定产物，并置于 下观察结果。 (3)芥菜EPSPS基因定点突变原理如图2所示，引物2的部分核苷酸序列为5'－GAATAGTCATGCGTTCACTC…－3'，请据此补充引物3的核苷酸序列5'－GTGAACGCATGA …－3'，引物3与反义链相应的核苷酸序列 （填“相同”或“不同”）。    (4)研究人员将突变基因插入T－DNA的绿色荧光蛋白基因上游，如图3。为使两个基因融合表达以确定EPSPS在细胞的位置，需要去除突变基因的 序列。 31．（2025·贵州铜仁·一模）植物在遭受生物或非生物胁迫时，往往会积累次生代谢产物来应对外界伤害。紫杉醇是存在于红豆杉属植物体内的一种次生代谢产物，具有高抗癌活性。研究发现从红豆杉愈伤组织细胞就可以提取紫杉醇。 回答下列问题： (1)在利用植物组织培养技术生产紫杉醇的过程中，最好选择红豆杉的 （幼嫩茎段/成熟茎段）作为外植体进行培养，原因是 。 (2)在一定激素和营养等条件的诱导下，外植体细胞会失去其特有的结构和功能，转变成未分化的细胞，这个转变过程称为 。未分化的细胞进而形成愈伤组织，将愈伤组织悬浮培养可获得紫杉醇。 (3)研究人员在利用植物组织培养技术生产紫杉醇的过程中发现紫杉醇的产量很低。结合题干信息，提出一种提高紫杉醇产量的措施 。目前利用基因工程构建稳定高产紫杉醇的工程菌研究取得很大进展，写出利用紫杉醇合成酶基因构建基因表达载体的思路 。 32．（2025·河北唐山·一模）四甲基吡嗪（TTMP）是枯草芽孢杆菌的一种代谢产物，是影响白酒风味的重要物质。bdhA基因的表达产物是降低TTMP含量的关键酶，研究人员欲通过敲除枯草芽孢杆菌的bdhA基因提高TTMP产量。回答下列问题： (1)为获取枯草芽孢杆菌的纯净培养物E，可取少量枯草芽孢杆菌菌液接种到牛肉膏蛋白胨 （填“固体”或“液体”）培养基中，蛋白胨提供的主要营养是 。 (2)利用下图中的3对引物扩增出bdhA基因的上、下游片段和cat基因，将3种扩增产物和质粒1分别酶切后进行连接以获得质粒2。为使cat基因位于质粒2的上、下游片段之间，在设计引物5、6时，应在引物的 端分别加入限制酶 和 的识别序列。 (3)用质粒2转化菌株E时，可用 处理菌株E以提高转化的成功率。质粒2与菌株E的DNA发生同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与E中bdhA基因上、下游片段配对，并发生交换）使E的bdhA基因替换为cat基因。将转化处理的枯草芽孢杆菌置于含有 的培养基中以筛选出目的菌株E-。 (4)为检验E-的bdhA基因被成功敲除，以E-的基因组DNA为模板，选用引物 进行PCR，预期扩增只获得一种大小为 bp的DNA片段。对于PCR产物电泳结果符合预期的DNA片段，通常还需进一步通过基因测序确认，原因是 。为研究敲除bdhA基因是否影响菌株生长，可用接种环挑取E⁻后直接用 法进行接种，观察到菌落大小和形态与菌株E一致。 33．（2025·山东聊城·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因（如图1所示）的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将斑马鱼的vtg基因，与人工构建的含萤火虫荧光素酶基因（无启动子）的载体（如图2所示）连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼。图2中Luc表示萤火虫荧光素酶基因，可以催化荧光素氧化产生荧光；为氨苄青霉素抗性基因，表示四环素抗性基因，BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ为限制酶。 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，可选用限制酶 进行双酶切Luc基因载体，其优点是 。 (2)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，通过PCR技术扩增vtg基因时，需设计合适的加端引物。依据图1、图2信息推测引物2包含的碱基序列为 。一个vtg基因经过4轮循环后，得到的子代DNA分子中，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为 。 (3)若筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养，筛选 的大肠杆菌即为目的菌；若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加 进行检测。 34．（2025·内蒙古阿拉善盟·一模）双乙酰是啤酒中的主要风味物质，含量过高会影响啤酒的品质；谷胱甘肽可以提高啤酒的抗老化能力。研究发现，ILV2基因编码双乙酰合成中的关键酶，GSH1基因编码谷胱甘肽合成中的关键酶。为生产低双乙酰且抗老化的啤酒，科研人员运用基因工程技术制备啤酒酵母工程菌，过程如图，其中CUPI基因的表达产物可使细胞对一定浓度的硫酸铜产生抗性。请分析回答： SalⅠ 5'-G↓TCGAC-3' Kpn Ⅰ 5'-G↓GTACC-3' Sph Ⅰ 5' -GCATG↓C -3 Xba Ⅰ 5'-T↓CTAGA-3'' Bgl Ⅱ 5'-A↓GATCT-3' Pst Ⅰ 5'-CTCC↓AG-3' (1)分析图1可知，需用 （填限制酶名称）切割质粒1以获取CUPI基因。 (2)转化后的啤酒酵母应置于含 的培养基中进行初步筛选。 (3)进一步鉴定需要以转化后啤酒酵母的 为模板，用图示两种引物进行PCR扩增。若扩增产物的大小约为1300bp，则说明 基因已整合到啤酒酵母的染色体上。 (4)将啤酒酵母工程菌与未转化的受体菌分别置于麦芽汁培养基中培养，定期取样检测，结果如图2。    据图2分析，啤酒酵母工程菌抗老化能力 。啤酒酵母工程菌的双乙酰合成量明显 未转化的受体菌，原因是 。 35．（2025·河北邯郸·一模）逆转录转座子是真核生物基因组中最丰富的一类可移动基因元件。逆转录转座子经过转录和逆转录后可整合进基因组中达到复制自身的目的，且插入基因组中时表现出精细的插入位点特异性。某研究团队为了研究4.5SRNA逆转录转座子的生物学作用，对4.5SRNA逆转录转座子DNA进行了克隆，部分过程如图1所示。回答下列问题： (1)获取鼠肝细胞总RNA时，使用异硫氰酸胍法提取，从保护RNA完整性的角度推测，异硫氰酸胍的作用是 。过程①和②中需要使用的酶分别是 、 。 (2)过程②获得的DNA补平且磷酸化后形成平末端，电泳鉴定结果如图2所示，优先使用 酶将DNA与pGEM3Zf连接形成重组质粒pGEM3Zf—4.5S．将重组质粒导入大肠杆菌中进行克隆。从大肠杆菌中提取质粒，选择限制酶 和 进行双酶切，酶切产物经过电泳鉴定，出现大小为139bp的条带，说明克隆成功。 (3)将4.5SRNA逆转录转座子DNA接入表达载体的SV40启动子的上游后，脂质体转染法将表达载体导入小鼠骨髓瘤细胞NS—1、SP2/0和人乳腺癌细胞Bca61中，研究4.5SRNA逆转录转座子对荧光素酶基因表达的影响，结果如图3所示，说明 。 (4)请你提出逆转录转座子在基因工程中的应用前景，逆转录转座子可作为 （写出1点即可）。 36．（2025·河北保定·一模）由P基因编码的P蛋白是一种水通道蛋白，该蛋白在植物调节水分吸收方面发挥着 重要作用。科研人员利用基因工程技术培育出了高表达P蛋白的转基因玉米，图1表示P 基因片段和农杆菌的Ti质粒及几种限制酶的识别序列和切割位点。回答下列问题： (1)若b链为P基因转录的模板链，则扩增P 基因时，应选择的引物是 。构建基因 表达载体时，切割Ti质粒应选用的两种酶为 。 (2)用含重组 Ti质粒的农杆菌侵染玉米后，应在含 的培养基中进行筛选。科研人 员进一步用PCR 验证P基因是否成功导入玉米细胞，电泳结果如图2所示。其中①为 P 基因，作为阳性对照，②为阴性对照，③为检测结果，由此可验证 。 (3)为了验证玉米植株中是否成功表达出P 蛋白，可用 技术进行检测。 (4)侵染后的玉米外植体需要先进行脱分化，然后在含有 （填植物激素）的培养基上诱导生根和生芽。从遗传学的角度看，玉米外植体能形成完整植株的原因是 。 37．（2025·河北承德·一模）为解决猪肉中多不饱和脂肪酸（PUFAs）含量不足的问题，研究人员获取了控制PUFAs合成的两个必需酶基因fat2和fat1，并构建pCAG-fat1-fat2融合表达质粒（如图所示），该质粒全长15300 bp（碱基对），CMV启动子启动EGFP基因表达绿色荧光蛋白，CAG启动子启动融合基因fatl-fat2的表达，AflⅡ和DraⅢ为两种限制酶的酶切位点。科研人员将构建好的质粒导入猪胎儿成纤维细胞，并最终获得转fatl-fat2融合基因的转基因猪。请回答下列问题：    (1)启动子是 识别和结合的部位，其作用是 。图中的EGFP起到了 的作用，便于重组DNA分子的筛选。 (2)用DraⅢ酶切如图所示质粒时，可断裂 个磷酸二酯键，且酶切产物是 bp和1700 bp两个片段。 (3)科研人员通过 法将构建好的质粒导入猪胎儿成纤维细胞，可通过 等技术检测目的基因是否进入受体细胞，该技术的原理是 。 (4)将含目的基因的猪胎儿成纤维细胞的细胞核移入 中，通过 法使两细胞融合形成重构胚，并用特定方法激活重构胚，使其发育为转基因猪，该技术属于 （填“有性”或“无性”）繁殖技术。 38．（2025·山东青岛·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1中的vtg基因与图2中Luc基因载体连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 注：图1DNA片段不含有图2所示限制酶的识别序列 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶 切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1包含的碱基序列为5′ 3′。（写出已知的所有碱基序列） (2)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含 的培养基中，转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是 。 (3)Luc基因载体上有一段P2A序列，其功能如图所示，据此推测P2A的作用 。 (4)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子含区域1和区域2，为研究E蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1和区域2的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点位于Luc基因的上游，形成两种重组载体。将重组载体分别导入斑马鱼的 ，待发育成熟后，往水体中添加 进行检测。 39．（2025·广东湛江·一模）某种野兔的毛色黑色和灰色是一对相对性状，由E、e基因决定。该种野兔的尾巴长尾和短尾是另一对相对性状，由F、f基因决定。将若干纯合的黑色长尾野兔和灰色短尾野兔进行杂交，所得子一代均为黑色长尾野兔。将子一代分别作母本和父本，进行测交，所得后代的表型和数量如图所示。请回答下列问题：    (1)由实验结果推测，两对相对性状的遗传遵循 定律，判定依据是 。 (2)子一代作父本测交后代中黑色长尾野兔的基因型为 ，子一代分别作母本和父本测交结果不同的原因是 。子一代雌雄个体自由交配后代中灰色短尾野兔占比为 。 (3)野兔中染色体上毛色基因两侧MspⅠ限制酶切位点的分布存在如下两种形式。黑色野兔甲和黑色野兔乙经杂交得到子代灰色野兔丙和未知毛色的野兔丁，分别提取甲、乙、丙、丁个体的DNA，经MspⅠ酶切后进行电泳分离，结果如图所示：    乙个体分离出的19kbDNA片段上含有的毛色基因为 （填“E”或“e”），理由是 ，推测野兔丁为杂合子的概率为 。 (4)科学家将某种人类致病基因转入该种野兔中，模拟疾病的发生和发展过程，该实例说明转基因动物的应用有 。 40．（2025·宁夏石嘴山·一模）亚洲玉米螟、黏虫是造成我国玉米减产的主要害虫。我国科研人员通过图示过程将Bt基因（能够控制合成Bt毒蛋白）转入玉米细胞培育出了抗虫转基因玉米。回答下列问题： (1)用PCR扩增下面的Bt基因的DNA片段：5'-GACCTGTGGAAGC．.....CATACGGGATTG-3' 3'-CTGGACACCTTCG......GTATGCCCTAAC-5'供选择的引物有：①5'-GACCTGTGGAAGC-3'  ②5'-CTGGACACCTTCG-3'  ③5'-GTTAGGCATAC-3'④5'-CAATCCCGTATG-3'共四种，应选择________（填字母）。 A．①② B．②③ C．③④ D．①④ (2)据图分析，为确保目的基因能够与Ti质粒正确连接，形成含有目的基因的重组Ti质粒，科研人员应选用限制酶 切割Ti质粒和含Bt基因的DNA片段。在获得重组Ti质粒后，可将其加入经 处理的农杆菌；导入重组质粒的玉米细胞经 成为转基因玉米植株。    (3)为检测转基因玉米是否培育成功，科研人员首先利用 法检测Bt基因是否成功翻译：在进行个体生物学水平的鉴定时，科研人员将获得的多株转基因玉米进行自交，发现除少数植株的子代均抗虫外，多数植株的子代中均出现了不抗虫植株，统计这些植株的子代中抗虫与不抗虫的比例，发现有3:1和15:1两种情况。出现15:1的原因是 。 (4)某科研小组在做抗虫棉试验时，虽已经检测出棉花植株中含有抗虫基因，但让棉铃虫食用棉花叶片时，棉铃虫并没有被杀死，这说明 ，为此，科学家对棉花植株中的Bt毒蛋白基因进行了修饰，结果食用了棉叶的棉铃虫中毒死亡了，从变异类型分析，这种对Bt毒蛋白基因的修饰属于 。 41．（2025·广东湛江·一模）柑橘树生长过程中易受某种革兰氏阴性菌感染，严重危害柑橘产量。科研人员将M基因转入柑橘中，该基因控制合成的酶可抑制该种革兰氏阴性菌的生长与繁殖。如图是培育转基因柑橘的过程示意图，已知限制酶HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ的识别序列及切割位点分别为5'-A↓AGCTT-3′、5′-G↓GATCC-3′、5-G↓TCGAC-3'。请回答下列问题：    (1)构建的基因表达载体，除了含有目的基因外，还必须含有 （回答2点）等。据图分析，在基因表达载体构建过程中，应使用 对M基因和质粒进行切割，原因是 。 (2)利用PCR技术克隆M基因时，应选择下图中的引物 （填序号），引物的作用是 。    (3)将图中农杆菌先后置于含 的培养基中培养，从而筛选出含重组质粒的农杆菌。为检测转基因柑橘幼苗是否可以抵抗革兰氏阴性菌的感染，在个体生物学水平上，操作方法是 。 (4)图中由柑橘细胞培育成转基因柑橘幼苗采用了 技术，该技术的原理是 ，由柑橘细胞获得愈伤组织的过程称为 。 42．（2025·广东深圳·一模）在植物基因组中天然存在着一类自私的基因或遗传元件，能够使得自身传递给后代的比例大大提高，被称为基因驱动元件。受天然基因驱动元件的启发，我国研究团队开发了一种名为CAIN的基因驱动系统，如图。 CRISPR/ Cas9能够靶向切割NPG1基因的编辑工具；NPG1表示花粉萌发所必需的基因 回答下列问题： (1)CRISPR/Cas9由人工合成的短链RNA和一种来自细菌的核酸酶Cas9。短链RNA作为“向导”；核酸酶Cas9切割目的DNA，使DNA双链断裂。短链RNA作为“导向”作用的具体原理是 。 (2)CAIN系统基于“毒药—解药”机制，据图分析，通过 的作用在植物花粉中产生毒药效应；再以 作为解药，让花粉正常萌发。图中重新编码后的NPG1需要具备的条件是 ，为实现这一目的，研究人员利用了密码子的 现象对NPGI进行重新编码，最终实现了 的花粉能够正常萌发。 (3)研究人员选用了自交繁殖的拟南芥作为材料，研究结果如下图。 ①若是双剪切，基因驱动工具CAIN系统在人工杂交世代中表现出了显著的高效遗传，理论上后代带有CAIN个体为100%，远高于孟德尔遗传的期望比例 。 ②若是单剪切，如下图所示，则可以产生 种雄配子，理论上后代带有CAIN个体的比例为 。 43．（2025·广西·一模）塑料的主要成分为聚氯乙烯（PVC）、聚乙烯（PE）和聚丙烯（PP）等，会造成难以降解的“白色污染”。自然界有多种细菌可以降解塑料的不同成分，研究人员欲通过筛选，并利用基因工程技术培育能降解多种塑料成分的“超级菌”。 (1)研究人员欲比较大肠杆菌YT1和芽孢杆菌YP1两类细菌降解PE塑料的能力，配置固体培养基，接种菌株后表层覆盖0.1 mm厚的PE塑料。分组实验结果如表所示： 培养基及接种菌株 培养基1 培养基2 培养基3 单独培养并接种YT1 单独培养并接种YP1 提取YT1和YP1的核酸，并与YT1和YP1混合，培养一段时间后选取YP1接种 降解圈（直径D/mm） 3.5 1.8 4.2 ①筛选能分解PE塑料的菌株时，应将菌株接种到以 为唯一碳源的培养基，从功能上讲，属于 培养基。 ②培养基3中接种混合培养后的YP1，其降解圈直径明显加大，其原因可能是 。 (2)研究人员发现一种胞外酶基因A，有降解PVC塑料的功能。对A基因测序可知，其调节功能区增加一个碱基对A/T，可增强其表达能力。通过PCR定点诱变技术在体外改造A基因（如图1），然后构建表达载体（如图2），导入受体菌培育“超级菌”。 注：LacZ基因编码产生的酶能分解β-半乳糖苷，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色 ①图1所示，大引物②是指以 （选填“引物1”或“诱变引物”）延伸得到的DNA链为模板， （选填“引物1”或“诱变引物”）与之结合延伸得到的DNA子链。获得图1中的改良A基因至少需要 个PCR循环。 ②图2中要实现质粒和改良A基因的正确连接，应选用的限制酶是 。将构建的表达载体导入受体菌后，在含氨苄青霉素和β-半乳糖苷的平板上培养，长出的 （选填“蓝色”或“白色”）菌落是成功导入重组质粒的菌株，依据是 。 44．（2025·江西赣州·一模）二化螟的幼虫主要危害水稻的叶和茎，转Bt基因水稻能一定程度抵抗二化螟的侵害。科研人员构建了GAL4/UAS基因调控系统的转基因水稻，过程如图1所示：GAL4/UAS系统调控基因表达的机理如图2所示：UAS序列可抑制靶基因表达，GAL4蛋白是一种转录活性因子，可特异性地识别并结合UAS序列，激活UAS下游基因的转录。    (1)图1中①②操作过程涉及到的酶有 。③④过程除了要进行目的基因的检测和鉴定外，还需要进行 才能将细胞培养成转基因个体。 (2)现已获得crylC基因、Bt基因和绿色荧光蛋白GFP基因，crylC基因能促进Bt基因的表达。若要以GFP基因为标记基因筛选受体细胞，在构建UAS-靶基因表达载体时，应将crylC、Bt、GFP三个基因插入到图3（Ti质粒的T-DNA片段示意图）中的位置分别是 （用序号①②③作答）。    (3)将GAL4转基因个体与UAS-Bt转基因个体杂交得，中出现了抗虫植株，其表现抗虫性状的原因是 。利用中抗虫个体自交得，若中表型及其比例为 ，则GAL4基因和Bt基因插入同一对同源染色体上；若中表型及其比例为 ，则GAL4基因和Bt基因插入两对同源染色体上（假设插入的基因均有效，个体的存活率相等）。 (4)采用在水稻叶片和茎鞘中特异性表达的GAL4基因的启动子，构建表达载体，得到转基因抗虫水稻，在食品安全方面的意义是 。 45．（2025·天津武清·一模）非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染家猪和野猪引起的一种高致病性传染病。科研人员在病毒ASFV的K基因（大小为790bp）中间插入荧光素酶基因（Gluc基因）和增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP基因），从而构建可以进行快速观察及定量检测酶活性的重组病毒（ASFV-Gluc-EGFP）体系，如图1所示。回答下列问题：    (1)构建出图1所示的融合基因，需要借助的工具酶有 。Gluc基因和EGFP基因有助于重组病毒的筛选，起到基因表达载体中 （填结构）的作用。 (2)为了初步鉴定重组病毒是否构建成功，科研人员提取相应病毒的DNA，选用图1中的一对引物 进行PCR扩增，扩增结果有1、2两种类型，如图2所示。该实验结果表明Gluc基因和EGFP基因 （填“有”或“没有”）插入病毒ASFV的K基因. (3)若要验证重组病毒中Gluc基因和EGFP基因是否成功表达，科研人员可将猪肺泡巨噬细胞（PAMS）培养一段时间后，平均分成A、B两组，其中A组接种病毒ASFV，B组接种 ，过一段时间后检测两组是否发出绿色荧光及 。 (4)同时科研人员又分别测定了A、B两组的病毒数量变化，发现两者无显著差异，该结果表明 。因此，该重组病毒体系的构建可为后续研究ASFV的致病机制及药物治疗奠定基础。 46．（2025·福建龙岩·一模）科研人员采用重叠延伸PCR技术，成功构建了突变的IKBA基因（以下称IKBAm），使IKBA蛋白中第32、36位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸，阻断了IKBA蛋白的磷酸化，IKBA蛋白磷酸化与哺乳动物组织中广泛存在的某种转录因子的功能有关。该技术采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，获得定点突变的新基因，原理如图，回答下列问题： (1)利用重叠延伸PCR技术诱变IKBA基因时，将预期的突变碱基设计在PCR的引物3和引物4中，分别进行PCR体系1和PCR体系2的扩增。PCR体系1中加入的引物是 。PCR体系1和PCR体系2必须分开进行的原因是 。 (2)将PCR体系1、2的产物（图中a、b和c、d）混合后，继续进行下一次PCR反应。在该PCR反应体系中经过高温变性后，当温度下降到55℃，能够互补配对的DNA链相互结合，理论上有 种结合的可能，其中能进行进一步延伸的是 组合的DNA片段。 (3)质粒A上有限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ的识别序列，为将IKBAm与质粒A正确连接，在设计IKBAm的扩增引物时，需在引物 的端分别添加相应的限制酶的识别序列。下表为重叠延伸PCR引物序列表，引物3的①位置上有关的碱基序列是 （填写出6个碱基）。 名称 引物序列 备注 引物1 GATCGGATCCCGTTCCAGGCGGCCGAGCGCCCCCA BamH I的识别序列： G↓GATCC 引物2 TCCTGAATTCTCATAACGTCAGACGCTGGCC EcoR I的识别序列： G↓AATTC 引物3 ①_____TTCATGGCGTCCAGGCCGGCGTCGTGGCG 引物4 CGCCACGAC……ATGAAAGACGA “…”表示省略的碱基 (4)已知IKBA基因的部分序列为： 数字94、95、96、106表示碱基位置，丙氨酸的密码子：GCU、GCC、GCA、GCG，则突变引物4中省略的碱基是 （选填①、②、③、④）。 ①AGC、GGC、CTG、GAC、GCC ②UCG、GGC、CTG、GAC、ACC ③GCC、GGC、CTG、GAC、GCC ④TCG、CCG、GAC、CTG、AGG 47．（2025·福建龙岩·一模）油菜花是两性花，其雄蕊的育性由位于同源染色体相同位置上的3个基因（、、）决定。研究人员为培育具有杂种优势的油菜新品种，利用品系1（，雄性不育）、品系2（，育性正常）、品系3（，育性正常），进行如下实验： 实验一：将品系1与品系2杂交，均为雄性不育植株，将与亲本回交获得； 实验二：将品系1与品系3杂交，均育性正常，将与品系1回交获得． (1)上述杂交实验中，在授粉前必须对品系1采取的操作是 。 (2)若、、基因中碱基数目不同，原因是基因突变时发生了 。根据杂交一、二的结果判断、、之间的显隐性关系是 。 (3)SNP是指基因组中由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性。当SNP位点与某基因非常接近时，它们在后代中往往保持连锁状态，使得SNP可以作为特定基因的遗传标记。研究人员提取实验一中亲本、、若干植株DNA，利用PCR扩增不同样本的SNP遗传标记，电泳结果如下图：    ①染色体互换通常发生在 时期，其引起的变异属于 。 ②据图推测， 序列与雄性不育基因紧密连锁，可作为雄性不育基因的分子标记，理由是 。 ③为进一步验证上述结论，研究人员提取实验二中亲本、、各植株DNA，并将表现型一致的植株DNA混合，利用PCR扩增不同样本的SNP遗传标记，请在下图画出支持上述结论的电泳结果 。    48．（2025·天津河东·一模）植物为了适应干旱胁迫，在长期的进化过程中形成了从分子到表型的一系列复杂的抗旱调控机制，其中沉积于植物表面的外角质层蜡质是防止水分散失、减轻干旱胁迫危害的重要屏障。明确角质层蜡质调控关键基因，解析蜡质形成机理，能够为抗旱作物新品种培育提供基因资源和理论依据。科研人员通过EMS诱变获得一个大麦突变体Cer1（纯合体），其颖壳蜡质合成有缺陷（本题假设完全无蜡质）。初步研究表明，突变表型是因为C基因突变为c，使棕榈酸转化为16-羟基棕榈酸受阻所致（本题假设完全阻断），符合孟德尔遗传规律，回答下列问题。 (1)在C基因两侧设计引物，PCR扩增，电泳检测PCR产物。如图泳道1和2分别是突变体Cer1与野生型（WT，纯合体）。据图判断，C基因突变成c基因的原因是 。 (2)将突变体Cer1与纯合野生型杂交，全为野生型，与突变体Cer1杂交，获得若干个后代，利用上述引物PCR扩增这些后代的基因组DNA，电泳检测PCR产物，可以分别得到与如图泳道 和泳道 （从1~5中选择）中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为 。 (3)进一步研究意外发现，16-羟基棕榈酸合成蜡质过程中必需的D基因（位于另一条染色体上）也发生了突变，产生了基因，其编码多肽链的DNA序列中有1个碱基由G变为T，但氨基酸序列没有发生变化，原因是 。 (4)假设诱变过程中突变体Cer1中的D基因发生了使其丧失功能的突变，产生基因。CCDD与个体杂交，的表型为野生型，自交，野生型与突变型的比例为 ；完善以下表格： 部分个体基因型 棕榈酸 16-羟基棕榈酸 颖壳蜡质 有 ① 无 有 有 ② 49．（2025·天津河东·一模）温度是影响微生物生长的重要因素，科研人员应用基因工程以实现通过温度控制工程菌合成所需物质。 (1)大肠杆菌是一种常见的微生物，常被改造为基因工程菌，其原因包括 （写出2点）。 (2)为实现温度控制蛋白质合成，科研人员设计了方案1，构建表达载体（见图1），将其导入大肠杆菌，获得转基因工程菌。大肠杆菌在30℃和37℃均可生长和繁殖，当培养温度为30℃时，C基因编码的C蛋白形成二聚体， ，因而大肠杆菌表达 荧光蛋白。    (3)为更精准调控荧光蛋白表达，将上述表达载体改造为方案2中的载体（见图2）。与方案1相比，方案2的主要优势是 。    (4)为检测方案2，科研人员将该方案中的工程菌稀释涂布在固体培养基上，形成单菌落，培养温度周期控制见图3。依据方案2，每个菌落生长2天后可出现4个不同的荧光环带，请预测图4所示菌落每个环带的工程菌中荧光蛋白表达情况，在下面表格中按时间顺序，依次写出所表达荧光蛋白的颜色（注：环带1形成时间为0-48小时，以此类推）。        菌落环带 1 2 3 4 所表达荧光蛋白的颜色 绿、红、绿 (5)聚羟基脂肪酸酯（PHA）常用于制备可降解的塑料包装材料。PHA是一种生物大分子，可由单体分子3HB和4HB随机聚合，或通过分段聚合形成嵌段共聚物（见图5），其中嵌段共聚物性能更优。共聚物的合成过程如图5，请完善以下表格，通过改造方案2以实现应用工程菌大规模生产优质PHA（不考虑各种酶在不同温度下的活性差异）。    操作 目的 对方案2表达载体的改造为：① 。 将构建好的表达载体导入大肠杆菌，获得工程菌。 获得可以合成PHA的工程菌。 以葡萄糖为原料配置培养基，灭菌后加入上述工程菌。 配制培养基、接种。 控制发酵条件：② 。 发酵48小时，获得3HB比例为25%的嵌段共聚物。 50．（2025·黑龙江吉林·一模）实验室某小组新发现一个调控水稻种子活力的基因Oshipll，并通过基因编辑获得含有其突变基因a、b、c的三种水稻，来鉴定该基因作用机制。利用CRISPR/Cas9复合体进行基因编辑时，复合体首先会定位目标序列（非模板链）的5´-NGG-3´位点（N表示任意一种碱基），然后利用自身所含的一段20bp长度的向导RNA，与该位点5´端相连的序列互补配对，若能够互补，复合物会切割互补序列某位点，使该位点插入或丢失部分碱基，可能导致基因突变失活。下图表示相应基因的非模板链部分序列和编码的肽链的部分氨基酸序列。回答下列问题。    相应基因合成的肽链的氨基酸序列为 Oshipll         MANSKSLLLCWCSLLLL……*73    a           MANSKSLLLLLVLAPPP……*64    b            MANSKSLLL*9    c            MANSKSLLLLAAAAPPAL……*85 注：各个英文大写字母表示不同的氨基酸；*后面的数字表示肽链氨基酸个数；终止密码子为UAA、UAG、UGA (1)该复合物与基因工程基本操作工具中 酶作用相似，作用的化学键为 。 (2)若分析基因a、b、c的突变位点，应设计 ，扩增相应基因，然后测序，并利用 分析比较得出突变位点。 (3)该复合物所含的向导RNA的序列为5´- ...-3´（只填5´端前6个碱基），b基因所编码肽链的氨基酸数目比Oshipll减少的原因是 。 (4)下图图1为携带基因Oshipll及突变基因a、b、c的水稻萌发处理后发芽率比较。图2为用不同浓度ABA浸泡5天后，携带基因Oshipll及突变基因a、b的水稻发芽指数（发芽指数可反映种子萌发的速度，发芽指数越高种子萌发速度越快）比较。从图中数据可以得出基因Oshipll对于水稻萌发的作用为 ；出现图2结果的作用机制可能是 。    51．（2025·山东聊城·一模）现发现一株叶色为黄绿色且雄性不育的双突变体两性植物（既可以自花传粉又可以异花传粉），其野生型表型为叶色绿色且雄性可育。已知叶色和雄蕊的育性分别受A/a和B/b控制。科研人员以该突变株（）和野生型（）进行了杂交，50%为绿色雄性可育，50%为黄绿色雄性可育，选取中黄绿色雄性可育植株自交，所得中绿色雄性可育：黄绿色雄性可育：绿色雄性不育：黄绿色雄性不育=3：6：1：2．回答下列问题： (1)结合实验分析，亲本和的基因型分别为 。 (2)中绿色雄性可育中纯合子所占的比例为 ，让中所有的黄绿色雄性可育植株间随机受粉，获得的子代中绿色雄性不育植株的概率为 (3)如果将中所有的绿色雄性可育株与绿色雄性不育株间行种植，则在绿色雄性不育株上收获的种子将来发育成绿色雄性不育株的概率为 ，绿色雄性可育株上收获的种子将来发育成绿色雄性不育株的概率为 (4)SSR是DNA中的简单重复序列，非同源染色体上、不同品种的同源染色体上的SSR重复次数不同，故常用于染色体特异性标记。科研人员提取出亲本、亲本及中50株雄性不育株叶肉细胞的核DNA，利用6号、8号染色体上特异的SSR进行PCR扩增，电泳结果如图2。 ①据图分析，控制雄性不育性状的基因可能位于 号染色体上。 ②2号不育株6号染色体SSR扩增结果出现的原因是 。 ③请在图3中画出植株8号染色体SSR扩增后的电泳结果 。 52．（2025·广东梅州·一模）苯丙酮尿症是由于患者体内苯丙氨酸代谢途径中的酶发生缺陷，使得苯丙氨酸及其代谢物酮酸在血液和组织中大量累积，进而阻碍脑的发育。研究发现，苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因可在大肠杆菌中表达并降解苯丙氨酸。科学家将PAL基因导入到肠道益生菌Nissle1917大肠杆菌（EcN）中，构建工程菌EcN-PAL，用于治疗苯丙酮尿症。图1为2.7Kb的质粒，其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，EcoRⅠ和PvuⅠ两种限制酶的酶切位点与复制原点之间的距离分别为0.6Kb和0.8Kb。图2为含PAL基因的DNA片段。 回答下列问题： (1)PAL是一种胞内酶，据此推测EcN-PAL的细胞膜上应具有 功能的蛋白质与PAL协同工作，完成EcN-PAL的预期作用。 (2)利用PCR技术扩增PAL基因，若该基因编码区其中一条链的序列为5'-AGCCCTCC……GAACCAGC-3'，下列可选用的一对引物是______。 A．5'-CCTCCCCA-3' B．5'-AGCCCTCC-3' C．5'-GCTGGTTC-3' D．5'-GAACCAGC-3' (3)据图分析，选用 酶切割PAL基因和质粒，构建重组表达载体。为确保目的基因正确插入质粒中，使用EcoRⅠ对重组DNA分子完全酶切后，进行凝胶电泳分析。若电泳图谱中出现长度为 Kb的条带，则说明是符合要求的重组质粒。 (4)研究表明EcN菌株不会在人体肠道中定殖，一段时间后会从胃肠道全部清除。据此推测，若服用EcN-PAL治疗苯丙酮尿症，需 （答出一点即可）。 53．（2025·山东济宁·一模）为筛选出能与SARS病毒的S蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员利用基因工程技术，在S蛋白末端添加TAP标签（能特异性地与人和哺乳动物体内IgG类抗体结合）形成S-TAP融合蛋白，再利用该标签在病毒敏感细胞中纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，部分过程如图。回答下列问题。    注：XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI表示限制酶识别序列，各限制酶识别序列及切割后产生的DNA末端均不同；F、R表示引物；T7表示启动子；Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列。 (1)为成功构建重组质粒pcDNA3．1-S-TAP，在利用PCR扩增S基因时，需在F引物的5'端外侧依次添加 序列。PCR时新合成链的延伸方向是 （填“5′→3′”或“3′→5′”）。 (2)使用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，DNA分子的迁移速率与 有关。 (3)在该重组质粒pcDNA3.1-S-TAP中，T7的作用是 ，重组质粒中还应该有的结构有 。 (4)为检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，科研人员将转染细胞置于载玻片，洗涤、固定后，滴加带有荧光标记的 稀释液，荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。 54．（2025·安徽滁州·一模）滁菊是菊花中花瓣最为紧密的一种，素有“金心玉瓣，翠蒂天香”之美誉，名列“四大名菊”之首。在滁菊的生长过程中，常常会受蚜虫的危害，使茎叶粘连、叶片卷缩等。研究发现雪花莲凝集素（GNA）和尾穗苋凝集素（ACA）可以有效抑制蚜虫生长和繁殖，并且对蚜虫天敌的生长无害，所以研究人员利用转基因技术获得了抗蚜虫滁菊的新品种。下图表示培育滁菊新品种的过程，图中的α、β、γ、δ均为限制酶。    回答下列问题。 (1)获得GNA-ACA融合基因的过程中，可以使用β、γ两种不同限制酶的原因是 。过程①是基因工程的核心步骤，其目的是 ，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)重组质粒导入大肠杆菌时，需要使用Ca2+处理大肠杆菌，其目的是 。 (3)图中过程②是 ，过程③要进行光照培养，其作用是有利于 和植物光合作用。 (4)在上述培育滁菊新品种的过程中没有出现操作错误，但在对所得到的乙中的滁菊植株进行抗虫性检查时，发现有许多滁菊植株没有抗虫性。请你分析出现以上结果的原因可能是 （答出一点即可）。 55．（2025·安徽·一模）某些植物凝集素如雪花莲凝集素和尾穗苋凝集素对一部分昆虫有毒性，可用作抗虫转基因植物的目的基因。研究人员将雪花莲凝集素基因（GNA）和尾穗苋凝集素基因（ACA）与载体（pBI121）结合，然后导入棉花细胞，获得转基因抗虫棉。部分过程如图所示，图中KpnⅠ及XhoⅠ为载体上限制酶的识别位点。回答下列问题： (1)限制酶SmaⅠ的识别序列为，可使用SmaⅠ处理GNA及ACA，然后用 DNA连接酶处理可获得二者的融合基因。若图1中融合基因的①链为模板链，使用限制酶KpnⅠ及XhoⅠ构建基因表达载体时，需在融合基因的ACA侧添加限制酶 的识别序列。 (2)将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是 （答出两种）。取一部分在添加了卡那霉素的培养基上正常生长的棉花细胞，通过 技术获得的棉花植株不一定具有抗虫性状的原因是 （答出两点）。 (3)图2是重组质粒的部分结构放大示意图，对单独使用KpnⅠ处理融合基因和载体得到的转基因棉花细胞需要进行进一步鉴定：获得棉花细胞的DNA，再用图2中的引物 进行PCR，并利用 技术对PCR产物进行鉴定。 56．（2025·安徽·一模）香蕉在生长过程中常因感染病原体而减产。为了增加香蕉的抗病能力，从某生物中提取mRNA通过逆转录获得抗病基因，构建表达载体、通过农杆菌转化法获得转基因抗病香蕉，过程如图1。回答下列问题：    (1)DNA在扩增的过程中需要引物，引物是指 。由mRNA逆转录获得抗病基因时，不但需要引物，且需在引物 端添加相应的限制酶序列。 (2)在构建重组质粒时，需要加入相应的限制酶，请写出被限制酶切制后抗病基因两端的黏性末端序列：    (3)用农杆菌侵染香蕉组织块，其目的是 。 (4)图1中①②过程培养基中生长素和细胞分裂素的 等都会影响植物细胞的发育方向。 (5)植物组织培养获得的转基因抗病香蕉需要进行个体生物学水平的鉴定。欲从个体生物学水平来鉴定抗病基因是否赋予香蕉抗病特性的操作是 。 57．（2025·上海·一模）重组人纤溶酶原激活剂（hPA）能够高效特异性地溶解血栓，目前已培育成功rhPA转基因兔，作为乳腺生物反应器批量生产药物。 某科研团队构建重组质粒PCL25/rhPA如图1所示（该质粒以β﹣casein作为调控序列，以CMV为启动子，其中SalⅠ、XhoⅠ、NotⅠ所在位置表示相关限制酶切点）。    (1)重组质粒PCL25/rhPA如图1所示。rhPA基因上游的CMV能被 结合，从而开启转录过程。在PCL25质粒的 限制酶切位点处插入化学合成的rhPA﹣cDNA片段。 (2)氨苄西林抗性基因是ampr，能否用只含有氨苄西林的培养基筛选出导入重组质粒的细胞？ 。原因是 。 (3)为筛选出含有重组质粒P3（图2）的菌落，tetr代表四环素抗性基因，采用含有不同抗生素的平板进行筛选后得到A、B、C三类菌落，其生长情况如表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的目标菌落是 （填表中字母）类，另外两类菌落的质粒导入情况分别是 。 平板类型 菌落类型 A B C 无抗生素 + + + 氨苄西林 + + ﹣ 四环素 + ﹣ ﹣ 氨苄西林+四环素 + ﹣ ﹣ 58．（2025·贵州·一模）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。    (1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是 。 (2)SgRNA可识别并特异性结合目标DNA序列，二者结合所遵循的原则是 。Cas9蛋白相当于 酶，可催化 键断裂，可在受体细胞中特定的基因位点进行切割，导致 （填变异类型），改变基因结构。 (3)构建完成CRISPR/Cas9重组质粒后，需要对其进行扩增，扩增的原理是 。 (4)CRISPR/Cas9基因编辑技术可通过改变 的碱基序列，从而可以任意编辑基因组上的各种靶序列。若要将目标基因从目标DNA上切除下来，一般需要设计 种不同的SgRNA。 (5)CRISRP/Cas9基因编辑技术中常用的SgRNA长度为20个碱基左右。某SgRNA因细胞内其他DNA序列也含有与其相对应的序列，造成该SgRNA错误结合而脱靶，解决的具体措施是 。 59．（2025·海南·一模）抗性淀粉是指在小肠中不能被消化吸收但能够作为肠道中某些消化细菌的底物。由于其不能被快速分解，相比于其他淀粉来说具有较低的升糖指数，在饮食上可一定程度地缓解糖尿病。除此之外，抗性淀粉还有降低胰岛素反应、调节肠道功能、能防止脂肪堆积等生理功能，因此其作为一种新型的膳食纤维，正在被广泛追崇。抗性淀粉（RS）的含量与直链淀粉与支链淀粉的含量比呈显著相关。可以通过提高直链淀粉的含量来提高 RS 的比例。 水稻是我国的主要粮食作物，是人体淀粉的重要来源。研究者设想特异性编辑水稻品种“嘉花 1 号”的淀粉分支酶基因，通过降低或抑制该基因的正常表达，从而影响该酶功能，减少支链淀粉的合成，升高直链淀粉和支链淀粉之间的比例，达到抗性淀粉上升的目的。 (1)如图1是水稻中淀粉的转化情况。分析可知，淀粉分支酶 （填“SSS”“GBSS”或“SBE”）是支链淀粉形成过程中的关键酶。 (2)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除或破坏目标基因（靶基因）其工作原理如图2所示。     研究发现CRISPR-Cas9系统广泛存在于细菌细胞内，从功能上看，细菌体内的Cas9类似于基因工程中的 ，推测细菌中Cas9存在的意义： 。 (3)自然界中的水稻不存在CRISPR/Cas9系统，可以利用基因工程技术。为了导入CRISPR/Cas9系统需要获取哪些基因？ 。 科研团队选择利用农杆菌转化法将含CRISPR/Cas9系统导入水稻细胞内。 这里所用的载体是 ，选择它的原因是 。 基因工程操作流程如下： 获取目的基因→构建重组质粒→转入 →导入水稻叶细胞→筛选得到含CRISPR/Cas9系统的水稻细胞→ 得到目标水稻植株，可从哪些方面去检测和鉴定得到的水稻是否达标？ （写1点即可）。 60．（2025·黑龙江辽宁·一模）植物中的光敏蛋白Р可以感受红光和远红光，在活化状态下可以与核输入蛋白（F）结合形成复合体，并被转运到细胞核中起作用；在失活状态下则与F蛋白分离。研究人员利用光敏蛋白的性质设计了转基因表达系统（REDMAP系统）。回答下列问题：    (1)糖尿病是一种常见的代谢类疾病，主要通过注射胰岛素进行治疗。研究人员利用图1所示的REDMAP系统治疗糖尿病小鼠。当使用 （选填“红光”或“远红光”）照射时，启动子UAS激活并顺利表达胰岛素基因。这种治疗方式的优势在于 。研究人员用腺相关病毒（AAV）作为基因载体将该REDMAP系统导入糖尿病小鼠体内。使用前需要对AAV中编码病毒蛋白的部分进行 ，以减少感染时机体的 ，使其能在体内长期存在；同时基因载体上必须保留 ，使外源基因在细胞内能自主复制。 (2)为检验REDMAP系统治疗糖尿病的效果，研究人员使用链脲佐菌素（诱导糖尿病的物质）注射正常小鼠，观察到小鼠出现 症状后，均分成三组在适宜条件下进行不同的实验处理。实验结果如图2所示，A、B、C三组的处理分别为注射空载病毒AVV溶液、 、 。实验结果显示，REDMAP系统 。 61．（2025·黑龙江哈尔滨·一模）金黄色葡萄球菌（简称Sa）可能引发从轻微皮肤感染到严重的全身感染，尤其对免疫力低下者危害更大。预防感染的关键在于良好的卫生习惯和合理使用抗生素。但不规范使用抗生素易出现抗药性Sa。推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以下图中R基因的上、下游片段及质粒1共同构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。 (1)操作步骤如下： ①根据图1信息，质粒2的构建过程中用引物 （填数字）进行PCR扩增，每次循环一般可以分为 三步，n次循环后可以得到等长的目的基因 个。然后选择限制酶 对扩增产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含氯霉素的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将步骤②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的概率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落中分别挑取少许菌体，依次接种到含 的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因可能被敲除。 (2)以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，产物一般通过 （技术名称）来鉴定。检测结果如下图所示，表明R基因已被敲除的是 。 62．（2025·江西·一模）研究人员以酵母菌为受体细胞，运用酵母双杂技术找到了柑橘黄龙病致病菌分泌的SDE19蛋白在柑橘中发挥作用的靶蛋白。酵母双杂技术原理如下，酵母菌的转录激活因子包括DNA结合域（BD）和转录激活域（AD），这两个结构单独存在时不能激活转录。将待测蛋白X与BD融合，蛋白质Y与AD融合，蛋白X和Y有相互作用时，两结构域能呈现转录因子活性，激活报告基因的表达，如图1所示。请回答下列问题： AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TRP、LEU分别编码合成Trp、Leu两种氨基酸的酶；Sal I、Nde I、EcoR I，BamH I，Not I，HindIII为酶切位点。 (1)研究人员将编码SDE19蛋白基因连接到含有编码BD多肽基因的质粒PBD中，获得BD-SDE19融合表达载体。通过PCR获取SDE19蛋白基因时，需在引物1和引物2的 （“3′或5′”）端分别添加酶切位点 和 。 (2)为寻找SDE19在柑橘中的靶蛋白，需要提取柑橘细胞的RNA，通过 ，再将其插入含有编码AD多肽的基因质粒pAD中，构建AD-Yn表达载体（Yn表示不同cDNA表达的蛋白质）。 (3)研究人员选用Trp、Leu氨基酸合成缺陷型酵母菌进行实验，原因是 ，若报告基因为LacZ（LacZ编码的物质可以降解X-Gal使菌落呈蓝色，否则为白色），培养基中添加X-Gal，含有靶蛋白的酵母菌菌落会表现为 色。 (4)酵母双杂技术在研究和鉴定蛋白质互作方面有重要作用，以下适合采用此技术进行的是______。 A．判断控制某一性状的两对基因能否独立遗传 B．筛选宿主细胞上能与新冠病毒S蛋白特异性结合的受体 C．判断RNA聚合酶和某启动子的结合是否具有特异性 63．（2025·山西吕梁·一模）苯丙酮尿症是单基因遗传病，科学家将正常基因D导入该病患者的细胞，以治疗该病。图甲为A、B、C三种质粒，图乙为含有目的基因D的DNA片段，图丙为重组载体的示意图。Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，LacZ为蓝色显色基因，其表达产物可以将无色化合物Xgal转化为蓝色物质，使菌落呈蓝色，EcoRⅠ（0.6Kb）、PvuⅠ（0.8Kb）为限制酶及其切割位点与复制原点之间的距离。回答下列问题： (1)科学家将正常基因D导入该病患者的细胞中常用的方法是 。图甲中三种质粒适宜作为载体的是质粒 （填字母），与另外两种质粒相比，其优点是 。 (2)获取目的基因D时应选择乙图中 限制酶对其所在的DNA进行切割。如果仅知道D基因首尾的部分核苷酸序列，可根据D基因已知核苷酸序列合成引物，利用 技术扩增目的基因。 (3)将目的基因D和甲图中相应质粒连接后，得到图丙中三种重组质粒。为选出正向连接的重组质粒，使用 限制酶对重组质粒完全酶切后，进行电泳分析，若电泳图谱中出现长度为 Kb的两条带，则为正向连接的重组质粒。 (4)利用自身不含LacZ基因且对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，若要在已转化的含重组质粒、已转化的含空质粒的受体细胞和未转化成功的细胞中筛选出已转化的含重组质粒的受体细胞的方法是 。 64．（2025·山东菏泽·一模）北京紫眼果蝇（基因型hh）是从野生型红眼果蝇（基因型HH）中分离出来的隐性突变体。对控制果蝇眼色的H、h基因进行了相关研究。F1、F2、F3、P1、P2、P3这六种引物及H基因结构如图1所示。    (1)为获取h基因，以北京紫眼果蝇体细胞的总DNA作为 ，用图1中F1、P1作为引物进行PCR，推测这对引物中与α链结合的引物碱基序列为5’- -3'（写出前6个碱基），扩增得到的DNA片段长度超过7000bp，说明北京紫眼的h基因是由于H基因中插入外来片段形成的。 (2)根据图1，运用PCR继续探究突变位点在H基因上的大致位置，简要写出实验思路： 。 (3)为验证H基因突变是北京紫眼性状产生的原因，运用UAS-GAL4转基因体系将H基因导入北京紫眼果蝇中，流程如图2。GAL4基因的表达产物是一种转录因子，UAS是一段特殊的具有调控功能的DNA片段。UAS上有GAL4蛋白的结合位点，只有当GAL4和UAS存在于同一个体时，GAL4才能激活与UAS相连接的下游基因的转录。 ①H基因在品系1、2中均不表达，只在两个品系杂交的后代中表达，H基因应该插入到位点 （填“a”、“b”或“c”）。 ②若受体中只有其中一条常染色体上导入一个外来基因，品系1和品系2杂交的F1代中红眼果蝇所占比例为 ，F1代红眼果蝇雌雄杂交得到的F2代中红眼所占比例可能为 。 65．（2025·广东深圳·一模）乳糖操纵子是大肠杆菌中一个经典的基因表达调控系统，该系统在生物工程和分子生物学中有广泛应用。如图表示乳糖操纵子调控结构基因表达的过程，回答下列问题： (1)大肠杆菌会优先利用葡萄糖，同时添加葡萄糖和乳糖的培养基培养大肠杆菌，早期大肠杆菌主要是利用 （填“①”或“②”）途径调控结构基因。当培养基中的葡萄糖消耗完，大肠杆菌开始利用乳糖进行自身代谢，此时乳糖作为 为大肠杆菌提供营养，阻遏蛋白主要与 结合，从而调控结构基因表达。 (2)研究人员对传统乳糖操纵子的阻遏蛋白进行分子内的光控化改造，利用蓝光可以改变阻遏蛋白的结构，如图1。用蓝光照射时，GFP基因的表达情况是 。根据该原理，研究人员构建了如图2基因表达载体，除未标出终止子外，该表达载体缺少的结构是 。 (3)为验证阻遏蛋白光控化改造后的调控效果，研究人员用野生型大肠杆菌、IPTG（诱导物）、光控化改造后的大肠杆菌进行验证实验，请完成以下表格中4组实验的设置情况，表格里填“－”和“+”分别表示不处理和处理。 处理 组别 1 2 3 4 野生型大肠杆菌 光控化改造后的大肠杆菌 IPTG 蓝光 (4)为验证阻遏蛋白光控化改造后的空间控制效果，将光控化改造后的大肠杆菌涂布在培养基上，蓝光环境下用三角形遮光板遮挡培养基（如图），适宜温度下培养一段时间后，描述紫外灯下培养基的实验现象 。若用成功转化后的大肠杆菌构建其他形状的荧光图案，需要进行的调控是 。 培养基遮光示意图（黑色区域为退光区） 处理 组别 1 2 3 4 野生型大肠杆菌 光控化改造后的大肠杆菌 IPTG － + － － 蓝光 － － + － 66．（2025·广东汕头·一模）水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器(下图)，为环境污染治理提供新方法。 回答下列问题： (1)Pc和Ps启动子可被 酶识别并结合后驱动基因的模板链沿3′→5′方向转录出mRNA。分析图上图可知，当环境中存在水杨酸时， 可激活PS启动子，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。 (2)研究人员改造重组质粒，选择激活能力更强的蛋白的基因nahR1替代nahR，实现在相同浓度的水杨酸条件下荧光强度扩大为原来的2倍，提高传感器的灵敏度。该改造过程需要用到的工具酶是 。请提出另一种改造重组质粒以提高传感器灵敏度的思路： 。 (3)水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基因与mrfp基因连接成融合基因，则工程菌可同时实现对水杨酸的动态检测和清除。现欲通过PCR判定融合基因已准确连接，应选择如图中的引物组合是 。 (4)工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdB两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdA、ccdB分别插入下图中的 、 位点。 67．（2025·四川巴中·一模）草甘膦是一种应用广泛、高毒高效且可生物降解的除草剂。研究人员在施加草甘膦的土壤中发现某种细菌体内存在抗草甘膦的EPSPS基因，并利用农杆菌转化法将该基因转入匍匐剪股颖(一种常用于高尔夫球场的草坪草)，从而获得对草甘膦具有抗性的转基因匍匐剪股颖。EPSPS基因编码区的非模板链序列为5′-ACTATG……GCTGCC-3′，针对该序列设计的一对引物FP和RP可用于EPSPS基因的PCR扩增。获得转基因匍匐剪股颖的过程如图所示。请回答下列问题：    (1)研究人员利用Ti质粒构建基因表达载体时，需在EPSPS基因的上游导入有特殊序列结构的启动子，启动子的作用是 ；图中引物FP的序列为5′- -3′(只写出前6位碱基)。 (2)图中的选择培养基需添加 从而只允许从农杆菌中获得了T-DNA的植物细胞增殖，SIM培养基通常具有较高浓度的 ，能够促进植物体芽的形成。 (3)抗草甘膦的转基因作物可能由于基因流动影响生态安全。研究人员将一高尔夫球场作为控制区，种入抗草甘膦匍匐剪股颖，在控制区外不同位点(如图所示)种植了若干株非转基因的匍匐剪股颖和亲缘物种作为哨兵植物。为确定转基因作物向其同种或亲缘物种转移EPSPS基因的情况，一段时间后需将用于监测的哨兵植物的种子收集并培育成幼苗，请写出从分子水平上检测EPSPS基因是否流入幼苗的方法： (答出一种即可)；经检测后发现EPSPS基因流动的最大距离在匍匐剪股颖和亲缘物种中分别为21公里和14公里，请推测哨兵植物主要放置在顺风向的原因是： ；基于上述分析，提出一条有效防止转基因污染的策略： 。    68．（2025·山西·一模）碱基编辑系统是一种新型基因修饰技术，通过在双链造成单切口后对碱基进行单一碱基的精准替换，提高单碱基编辑的精确性及效率，为家畜育种的精确基因修饰提供了一种更简单、更有效的方法。胞嘧啶碱基编辑器（CBE）能将G-C碱基对替换为A-T碱基对，作用模式如图。请回答下列问题：    (1)CBE的作用原理是 。欲将G-C碱基对最终替换为A-T碱基对，丙还需要复制 次。 (2)肌肉生长抑制素（MSTN）可抑制肌细胞的增殖与分化。科研人员利用碱基编辑工具成功改变哈萨克羊MSTN基因，使终止密码子提前出现，显著增加了肌肉纤维的直径和数量，获得改良品种。 ①用改造后的基因构建表达载体时，还需要在该基因的上游和下游分别添加 和 ，使用的工具酶有 ；构建的表达载体通过 的方式导入哈萨克羊的 中。 ②改造后的MSTW基因表达的蛋白质肽链比MSTN要 （填“长”或“短”），失去其应有的功能。 69．（2025·吉林延边·一模）药物A是从某植物体叶肉细胞中提取的一种蛋白质，对治疗糖尿病具有良好的疗效。某研究团队运用生物工程相关技术，利用大肠杆菌来生产这种药物。回答下列问题。 (1)科学家根据药物A的氨基酸序列人工合成DNA片段，由于 ，该方法得到的DNA片段有多种可能，也可以用PCR技术从植物细胞中扩增出药物A基因，该技术的原理为 。 (2)下图表示制备工程菌时所使用的质粒、目的基因的结构及其相关限制酶识别位点（限制酶的识别序列和切割位点如表所示），其中lacZ基因表达的产物可将无色物质X-gal催化为蓝色物质，从而使菌落呈现蓝色。回答下列问题。    注：kb代表碱基对，Kanr基因为卡那霉素抗性基因 限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ Sau3AⅠ SmaⅠ XmaⅠ 识别序列和切割位点 -G↓GATCC- -G↓AATTC- -↓GATC- -CCC↓GGG- -C↓CCGGG- ①利用PCR技术获取和扩增目的基因，已知待扩增的目的基因两侧相关序列如下，扩增时选用的两种引物碱基序列为（注明序列的5′和3′端） 、 。    ②分析上图，为将目的基因准确插入质粒中，最好选用 酶切割目的基因，酶切处理后的目的基因和质粒需使用 （填“T4”、“E.coli”或“T4或E.coli”）DNA连接酶处理，才能得到重组质粒。 ③将目的基因导入受体菌时，若要准确筛选出含重组质粒的受体菌，需要将其培养在添加了 的培养基上。 ④若将重组质粒用EcoRⅠ充分酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离，可得到长度为 bp的条带。对于琼脂糖凝胶电泳结果符合预期的PCR产物条带，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。 70．（2025·四川·一模）构建可降解多环芳烃的转基因大肠杆菌是解决在石油及页岩油开采过程中多环芳烃污染的手段之一。科研人员利用从石油中分离得到的石油降解菌，通过 PCR 扩增的方法得到邻苯二酚1，2 双加氧酶(C12O)基因片段，再将C12O基因连接到载体pET-28a转入大肠杆菌中，期望获得可降解多环芳烃的转基因大肠杆菌。相关信息如图所示。    (1)从石油降解菌基因组 DNA中PCR 扩增目标基因 C12O时，每次循环的步骤一般可以分为 。PCR扩增时，图示中四种引物可以扩增 种不同长度的目标基因片段。 (2)为将扩增后的目标基因C12O插入载体pET-28a.后与卡拉霉素抗性基因读取方向一致，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在R1、R2 和R3末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在Rx末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从C12O基因扩增到载体pET-28a构建完成的整个过程除了需要多种限制酶以外还需要 酶。 (3)与图中载体pET-28a上卡拉霉素抗性基因的启动子结合的酶是 。将构建的载体pET-28a成功导入大肠杆菌后，含R1、R2与 Rx扩增产物的大肠杆菌能够有效降解多环芳烃，含R3与 Rx扩增产物的大肠杆菌不能降解多环芳烃。含 R3与 Rx扩增产物的大肠杆菌不能降解多环芳烃的原因可能是 。 71．（2025·陕西西安·一模）某科研人员将甜蛋白基因导入番茄，可提高番茄甜味，改善果实品质。如图为甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切位点示意图。回答下列相关问题： (1)利用PCR技术扩增甜蛋白基因时，为了特异性扩增甜蛋白基因序列，需根据 设计引物；每次循环一般可以分为 、 、 三步。 (2)用限制酶切割含有甜蛋白基因的DNA片段时，不用限制酶BamHⅠ的原因是 。科研人员最终选择了限制酶XbaⅠ和HindⅢ切割质粒和含有甜蛋白基因的DNA片段，而不是选择限制酶XbaⅠ和EcoRⅠ的理由是 。 (3)为了让甜蛋白基因进入受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上，可以将甜蛋白基因插入Ti质粒的 中。将基因表达载体导入农杆菌前，需用Ca2+处理农杆菌，其目的是 。为了确定农杆菌中是否导入基因表达载体，需将农杆菌置于含 的培养基中进行培养，然后用筛选出来的农杆菌去侵染番茄细胞。 72．（2025·江西新余·一模）土壤盐分过高对植物的伤害作用称为盐胁迫。SOS信号转导途径是介导盐胁迫下细胞外排Na+，维持Na-/K+平衡的重要调节机制。盐胁迫出现后，磷脂分子（PA）在质膜迅速聚集并与能催化底物磷酸化的蛋白激酶SOS2结合，致使SOS2接触激活钠氢转运蛋白SOS1，并使钙结合蛋白SCaBP8磷酸化，具体调节机制如图所示。请回答下列问题： (1)盐胁迫下，通过SOS信号转导途径，细胞内的Na+/K+比值 （填“升高”或“降低”），据图推测磷酸化的SCaBP8的作用机理 。 (2)科学家通过基因工程在水稻中过量表达SOS1蛋白，以期增强水稻抗盐能力。 ①为获得编码SOS1蛋白的基因，可提取野生型水稻总RNA，通过 获得模板DNA，再经PCR获得SOS1基因片段。 ②测序表明，SOS1基因中A+T含量占53%，模板链中C的含量为26%，那么编码链（非模板链）中C的含量为 %。 ③构建表达载体时，在下图所示载体含有的限制酶识别位点插入SOS1基因。序列分析发现SOS1基因内部有XbaⅠ的识别序列，为使载体中SOS1基因和绿色荧光蛋白基因正确表达，应在SOS1基因两端分别添加 两种限制酶的识别序列，将SOS1基因插入载体前，应选用 两种限制酶对载体酶切。 生物技术的伦理和安全考点02 一、单选题 1．（2025·宁夏银川·一模）生物技术就像一把“双刃剑”，它既可以造福人类，也可能在使用不当时给人类带来潜在的危害。下列叙述错误的是（    ） A．研究转基因农作物时应采取多种方法防止转基因花粉的传播，避免基因污染 B．干细胞培养在临床医学等领域前景广泛，但也可能面临一些问题，如存在导致肿瘤发生的风险 C．生物武器是用病毒类、干扰素及生化毒剂类等来形成杀伤力 D．反对设计试管婴儿的原因之一是避免有人滥用此技术选择性设计婴儿 2．（2025·安徽马鞍山·一模）为提高水稻的产量，科研人员将四种基因（EcCAT、OsGLO1、EcGCL、TSR）与叶绿体转运肽基因连接，构建多基因表达载体，引导合成的蛋白质定向运输至叶绿体，从而在水稻叶绿体内构建了一条新的代谢途径。下列说法正确的是（　　） A．T-DNA插入到水稻的染色体DNA中可能会影响水稻自身基因的表达 B．含卡那霉素的培养基上不能存活的水稻细胞未成功导入四种目的基因 C．限制酶识别特定的序列具有专一性，DNA连接酶不具有专一性 D．目的基因产物转运至叶绿体，避免了目的基因通过花粉转移到近缘植物 3．（2025·安徽黄山·一模）抗虫和耐除草剂玉米“双抗12-5”是我国自主研发的转基因品种。在转基因产品的研发、生产、销售等环节，可采用PCR技术进行基因监测，为转基因生物安全监管提供依据。下列叙述错误的是（    ） A．PCR开始阶段的预变性可使模板DNA变性更充分 B．PCR循环过程中，复性的目的是使DNA聚合酶与模板相结合 C．进行PCR基因监测时，应使用待检目的基因的特征序列作为引物 D．安全监管中，应阻止检测出转基因扩增产物的非转基因标识农产品上市 4．（2025·浙江温州·一模）下列关于生物技术安全与伦理问题的叙述，错误的是（   ） A．我国禁止进行任何生殖性克隆人实验 B．治疗性克隆不会产生道德、伦理问题 C．我国反对生物武器的研发、生产和扩散 D．转基因食品存在引发过敏的风险 二、多选题 5．（2025·江西·一模）除草剂有效成分草甘膦的作用机理是和PEP竞争性结合EPSP合酶，从而扰乱生物体的正常氮代谢。但作为一种非选择性除草剂，草甘膦对农作物同样具有杀伤作用，这大大限制了其在农业生产中的应用，培育抗草甘膦作物将会解决这一难题。下列说法错误的是（    ） A．长期使用草甘膦除草剂，会导致杂草产生抗除草剂突变，降低除草剂的效果 B．根据草甘膦的作用机理，可通过导入强启动子使EPSP合酶过量表达获得抗草甘膦作物 C．可通过蛋白质工程直接替换EPSP合酶个别氨基酸，使草甘膦无法与EPSP酶结合 D．在培育抗草甘膦作物时，为避免外源基因流入杂草，最好将外源基因插入细胞核基因组 试卷第1页，共3页 2 / 62 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题15 基因工程 考点概览 考点01基因工程 考点02生物技术的伦理和安全 基因工程考点01 一、单选题 1．（2025·贵州铜仁·一模）水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。研究人员发现用赖氨酸替换水蛭素第47位的天冬酰胺可以提高它的抗凝血活性。下列叙述正确的是（　　） A．该项替换研究中，目前可行的直接操作对象是蛋白质 B．该项替换研究中，改造前后水蛭素的空间结构未发生改变 C．该项替换研究的思路与按照中心法则合成蛋白质的思路一致 D．改造的水蛭素基因导入微生物后可利用发酵工程生产水蛭素 【答案】D 【分析】蛋白质工程指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要．蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。 【详解】A、蛋白质工程的直接操作对象是基因而非蛋白质,通过修改基因序列来改变氨基酸组成，而非直接对蛋白质进行操作，A错误； B、根据题意信息可知，将天冬酰胺（极性氨基酸）替换为赖氨酸（带正电荷的碱性氨基酸），两者的理化性质差异显著，可能导致局部电荷分布和空间结构改变，从而影响蛋白质功能，B错误； C、中心法则是从DNA到RNA再到蛋白质的正向流程，而蛋白质工程的思路是逆向的：先设计所需蛋白质结构，再反向推导并修改基因序列。因此，两者的研究思路并不一致，C错误； D、改造后的水蛭素基因导入微生物（如大肠杆菌或酵母菌）后，可通过发酵工程大规模生产水蛭素，D正确。 故选D。 2．（2025·山西·一模）人参这种珍贵中药材的药效主要由人参皂苷发挥作用。科研人员将合成人参皂苷Rh2的关键酶基因（UGT和D12H）导入酿酒酵母，实现了多基因表达，从而实现人参皂苷Rh2工厂化生产。下图为相关操作流程图，①~④表示过程。下列叙述正确的是（　　） A．①需要先将RNA反转录出DNA，再利用PCR获取和扩增目的基因 B．②利用PCR在目的基因上添加酶切位点时，需在引物的3'端引入该位点 C．③是基因表达载体的构建，将目的基因1连接在启动子1的上游 D．启动子是一段有特殊序列的DNA片段，是DNA聚合酶识别和结合的部位 【答案】A 【分析】基因表达载体中应含有启动子和终止子，才能确保目的基因能顺利启动转录和终止转录。PCR时一般需要两种引物，才能将目的片段扩增出来，设计的引物中，同一引物自身和两种引物之间都不能有互补序列。 【详解】A、由于PCR的原理是DNA的半保留复制，因此①需要先将RNA反转录出DNA，再利用PCR获取和扩增目的基因，A正确； B、②利用PCR在目的基因上添加酶切位点时，需在引物的5'端引入该位点，若酶切序列添加在引物的3'端，则会导致引物不能继续延伸，B错误； C、③是基因表达载体的构建，据图可知，应将目的基因1连接在启动子1的下游，保证能将目的基因1正常转录，C错误； D、启动子是一段有特殊序列的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，D错误。 故选A。 3．（2025·河北邯郸·一模）下列有关“DNA的粗提取与鉴定”“琼脂糖凝胶电泳”实验的相关说法，正确的是（    ） A．利用酒精初步分离DNA与蛋白质的原理是DNA溶于酒精 B．过滤后的研磨液放置在4℃冰箱中可防止DNA被降解 C．琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子越大，迁移速率越快 D．提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后即可变为蓝色 【答案】B 【分析】DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精；鉴定DNA时，需要先将DNA溶解在NaCl溶液中，再与二苯胺溶液混合，并在水浴加热条件下呈现蓝色；耐高温的DNA聚合酶在延伸环节时进行子链的合成。 【详解】A、DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离，A错误； B、洋葱研磨液在4℃℃冰箱中放置几分钟，可降低DNA水解酶的活性，防止DNA降解，B正确； C、待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率，DNA分子越小，迁移的速率越快，DNA分子越大，迁移速率越慢，C错误； D、将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后，水浴加热条件下才会呈现蓝色，D错误。 故选B。 4．（2025·山东青岛·一模）野生大豆的SAMS基因具有提高抗逆性的作用。水稻是一种盐敏感型作物，为提高水稻的抗盐碱胁迫能力，研究者将野生大豆的SAMS基因转入水稻细胞内，从而培养出转基因水稻株系，具体过程如图。下列说法错误的是（    ） A．图示过程中发生了两次转化 B．Ⅰ和Ⅲ都需使用固体培养基 C．Ⅰ中的筛选可使用PCR技术 D．获得的转基因水稻苗都具备抗盐碱能力 【答案】D 【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法。 【详解】A、转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，图示过程需要两次转化，分别为，一是将目的基因（SAMS基因）转化质粒的T-DNA分子上，二是指被插入目的基因的T-DNA转化到受体细胞的染色体DNA分子上，A正确； B、Ⅰ和Ⅲ分别用于培养农杆菌和植物组织培养的再分化过程，均需要使用固体培养基，B正确； C、PCR技术可用于目的基因和基因表达载体的筛选，C正确； D、SAMS基因具有提高抗逆性的作用，获得的转基因水稻幼苗不一定都具有抗盐碱的能力，所以需要将转基因水稻置于盐碱的环境中，进行筛选与鉴定，D错误。 故选D。 5．（2025·山东青岛·一模）酶联免疫吸附测定是一种灵敏的免疫检测技术，过程如图。下列说法错误的是（    ） A．该技术可以用来检测特定抗原的浓度 B．两种抗体与特定抗原的同一区域结合 C．第二种抗体可以用蛋白质工程来制备 D．加入底物前需要漂洗掉未结合的抗体 【答案】B 【分析】据图分析，抗体和抗原特异性结合，再与酶标抗体结合，催化特定底物形成检测产物。 【详解】A、由图可知，加入酶标抗体的目的是酶催化检测底物反应，通过测定单位时间有色产物生成量来推测待测检测特定抗原的浓度，A正确； B、由图可知，两种抗体与特定抗原的不同区域结合，B错误； C、第二种抗体可以用蛋白质工程来制备，C正确； D、由图可知，第二种抗体具有蛋白酶可催化无色底物转变为有色底物，因此加入底物前需要漂洗掉未结合的抗体，D正确。 故选B。 6．（2025·山东青岛·一模）已知紫外线（UV）可诱导DNA单链上相邻的T之间相互结合形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对而导致复制错误引起突变，DNA修复机制对维持遗传稳定性至关重要。研究人员发现某细菌中存在两种如图所示修复机制：①光复活修复：光复活酶（PRE）在可见光下直接切割二聚体，恢复原结构；②暗修复：无需光照，通过切除损伤单链并重新合成。下列说法正确的是（    ）    A．PRE可将嘧啶二聚体的磷酸二酯键断开 B．暗修复过程中还需消耗原料、能量和引物 C．PRE基因发生碱基替换后，在光照下PRE的修复功能可能正常 D．UV诱导DNA形成嘧啶二聚体引起的变异不可遗传 【答案】C 【分析】DNA连接酶（将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键）： （1）种类： E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （2）作用：E.coli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段；而T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低。 【详解】A、由图可知，PRE（光复活酶）切割的是相邻T碱基之间形成的环状共价键，并非磷酸二酯键，A错误； B、无需光照，通过切除损伤单链并重新合成，即暗修复切除损伤片段后，DNA聚合酶可直接利用缺口处原有的3′OH末端延伸合成新链，不需要引物，B错误； C、由于密码子具有简并性，基因的碱基替换未改变氨基酸得排列顺序，酶活性不变，则在光照条件下PRE的修复功能仍可能维持正常，C正确； D、若嘧啶二聚体未被修复而导致DNA碱基序列永久改变，则该突变在细胞分裂过程中是可以遗传的，D错误。 故选C。 7．（2025·山东青岛·一模）采用PCR技术可获取并扩增目的基因。下列说法正确的是（    ） A．若PCR的模板是mRNA，完成扩增只需要逆转录酶 B．预变性有利于模板DNA充分解聚为单链 C．复性温度太高会导致引物和模板的非特异性结合增加 D．一个DNA模板完成第20轮循环需要（220-2）个引物 【答案】B 【分析】PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、复性、延伸三步。在循环之前，常需要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。PCR过程为：变性，当温度上升到90 ℃以上时，氢键断裂，双链DNA解旋为单链。复性，当温度降低到50℃左右是，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。延伸，温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【详解】A、若PCR的模板是mRNA，完成扩增需要逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶，A错误； B、预变性温度较高，双链DNA在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA，B正确； C、复性温度太低会导致引物和模板的非特异性结合增加，温度太高会使引物与模板结合减少，C错误； D、合成1个DNA分子需要2个引物，一个模板完成第20轮循环会合成220-219个DNA，因此需要的引物为（220-219）×2=220个，D错误。 故选B。 8．（2025·河北石家庄·一模）研究人员将胰岛素B链的第28位氨基酸替换为天冬氨酸，抑制了胰岛素聚合，从而获得速效胰岛素类似物。下列叙述正确的是（    ） A．该产品是通过直接改造胰岛素来生产的 B．改变氨基酸的种类不会影响胰岛素的空间结构 C．可通过定向诱导胰岛素基因碱基增添达到改造目的 D．胰岛素改造的基本思路与天然蛋白质合成过程相反 【答案】D 【分析】蛋白质工程概念及基本原理（1）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）。（2）蛋白质工程崛起的缘由：基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质。（3）蛋白质工程的基本原理：它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程。（4）基本途径：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因），最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成。 【详解】A、蛋白质工程最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成，即改造胰岛素的过程实际是改造胰岛素基因的过程，A错误； B、氨基酸的种类及排列顺序影响蛋白质的空间结构，B错误； C、可通过定向诱导胰岛素基因碱基替换达到第28位氨基酸替换为天冬氨酸的目的，C错误； D、蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因），胰岛素改造的基本思路与天然蛋白质合成过程（基因→蛋白质合成）相反，D正确。 故选D。 9．（2025·河北石家庄·一模）原生质体比正常植物细胞更易接受外源DNA，其制备过程主要包括取材→剪碎→酶解。下列叙述错误的是（    ） A．细胞壁可能会阻止外源DNA进入细胞 B．取材后需用酒精和次氯酸钠对材料灭菌 C．剪碎的目的是使酶与细胞充分接触 D．可用台盼蓝染液来鉴定原生质体活性 【答案】B 【分析】植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，所以制备原生质体，需要用纤维素酶和果胶酶将细胞壁去除，这种去除细胞壁的方法称为酶解法。 【详解】A、细胞壁的存在可能阻碍外源DNA进入细胞，原生质体因去除了细胞壁，更易吸收外源DNA，A正确； B、酒精和次氯酸钠常用于消毒（减少微生物数量），而非灭菌，B错误； C、剪碎材料可增大接触面积，便于酶解细胞壁，C正确； D、台盼蓝可鉴别原生质体活性，活细胞不被染成蓝色，死细胞膜破损，被染成蓝色，D正确。 故选B。 10．（2025·广东深圳·一模）研究者从酵母菌中获取控制细胞色素氧化酶（存在于线粒体）的某一段肽合成的DNA片段，将其与小鼠的二氢叶酸还原酶（只存在于细胞质基质）基因融合。重组基因在酵母菌表达后，在线粒体中发现了二氢叶酸还原酶。该研究的目的是（    ） A．获得融合蛋白 B．研究该段肽的作用 C．引导二氢叶酸还原酶进入线粒体 D．研究重组基因的功能 【答案】D 【分析】基因是有遗传效应的DNA片段，基因的表达包括转录和翻译两个阶段。染色体是基因的主要载体，核基因在染色体上呈线性排列。 【详解】A、重组基因在酵母菌表达后，在线粒体中发现了二氢叶酸还原酶，该酶不是新融合蛋白，A错误； B、获得的是二氢叶酸还原酶，它由二氢叶酸还原酶基因指导合成，跟段肽没有关联，该研究的目的并不是研究该段肽的作用，B错误； C、该实验没有体现引导二氢叶酸还原酶直接进入线粒体的过程，C错误； D、该实验从酵母菌中获取控制细胞色素氧化酶（存在于线粒体）的某一段肽合成的DNA片段，将其与小鼠的二氢叶酸还原酶（只存在于细胞质基质）基因融合，得到重组基因，重组基因在酵母菌表达后，在线粒体中发现了二氢叶酸还原酶，可以体现基因的表达过程，该研究的目的就是研究重组基因的功能，或者是表达情况，D正确。 故选D。 11．（2025·宁夏银川·一模）下图为构建基因表达载体和检测受体细胞是否含有目的基因的过程示意图，其中LacZ基因控制合成的酶可以分解物质X产生蓝色物质，使平板上形成的菌落呈蓝色，否则菌落为白色。图中③过程所用培养基含有氨苄青霉素和物质X。下列叙述错误的是（    ）    A．①过程需要使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶 B．实验结果中形成的蓝色菌落中的大肠杆菌含有目的基因 C．③过程使用的培养基中含有氨苄青霉素，属于选择培养基 D．可用处理大肠杆菌使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、①过程为基因表达载体的构建，使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶，A正确； B、标记基因因外源基因的插入而不能表达出相关酶，无法分解物质X，不能产生蓝色物质，故实验结果中形成的白色菌落中的大肠杆菌含有目的基因，B错误； C、③过程使用的培养基中含有氨苄青霉素，使得含有氨苄青霉素抗性基因的微生物能存活而其他微生物不能存活，属于选择培养基，C正确； D、可用Ca2+处理大肠杆菌使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，从而实现目的基因的转化，D正确。 故选B。 12．（2025·安徽马鞍山·一模）为提高水稻的产量，科研人员将四种基因（EcCAT、OsGLO1、EcGCL、TSR）与叶绿体转运肽基因连接，构建多基因表达载体，引导合成的蛋白质定向运输至叶绿体，从而在水稻叶绿体内构建了一条新的代谢途径。下列说法正确的是（　　） A．T-DNA插入到水稻的染色体DNA中可能会影响水稻自身基因的表达 B．含卡那霉素的培养基上不能存活的水稻细胞未成功导入四种目的基因 C．限制酶识别特定的序列具有专一性，DNA连接酶不具有专一性 D．目的基因产物转运至叶绿体，避免了目的基因通过花粉转移到近缘植物 【答案】A 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建（核心）；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、T-DNA插入到水稻染色体DNA中的位置是随机的，可能会破坏原有基因结构，影响该基因表达，A正确； B、含卡那霉素的培养基上不能存活的植物受体细胞可能未成功导入载体，但不能确定未成功导入四种目的基因，据图可知卡那霉素抗性基因在载体的非T-DNA区域，即使T-DNA携带目的基因导入成功，卡那霉素抗性基因也不会导入，B错误； C、酶都具有专一性，DNA连接酶只能连接两个DNA片段，催化形成磷酸二酯键，因此具有专一性，C错误； D、目的基因借助叶绿体转运肽转运到叶绿体中，避免了目的基因通过花粉（有细胞核，不含叶绿体）转移到近缘植物，D错误。 故选A。 13．（2025·天津武清·一模）下列有关教材实验探究的说法正确的是（    ） A．猪红细胞是实验“DNA粗提取与鉴定”的良好材料 B．“探究酵母菌细胞的呼吸方式”的实验中无氧气组为对照组 C．“探究土壤微生物的分解作用”实验中，利用了减法原理“ D．设计预实验是为了避免实验数据的偶然性，减少误差 【答案】C 【分析】设计实验方案时，要求只能有一个变量，这样才能保证实验结果是由你所确定的实验变量引起的，其他因素均处于相同理想状态，这样便于排除因其他因素的存在而影响、干扰实验结果的可能。 【详解】A、猪属于哺乳动物，其成熟红细胞没有细胞核和众多细胞器，也就几乎不含 DNA，所以不是“DNA 粗提取与鉴定”实验的良好材料，A错误； B、“探究酵母菌细胞的呼吸方式”的实验属于对比实验，有氧和无氧条件下的实验都是实验组，B错误； C、“探究土壤微生物的分解作用”实验中，实验组将土壤进行处理以排除土壤微生物的作用，利用了减法原理，即排除自变量对研究对象的干扰，C正确； D、设计预实验的主要目的是为进一步的实验摸索条件，也可以检验实验设计的科学性和可行性，而不是为了避免实验数据的偶然性、减少误差。要减少误差，通常采取多次测量取平均值等方法，D错误。 故选C。 14．（2025·福建龙岩·一模）柳穿鱼花的形态有两侧对称型（野生型）和辐射对称型（突变型），柳穿鱼花的形态与Lcyc基因直接相关，两种类型体内Lcyc基因的序列相同。研究人员将野生型植株A与突变型植株B杂交得到，自交得到的中野生型：突变型=34：5，该结果不符合典型孟德尔性状分离比。为弄清其产生原因，研究人员进行下表所列实验，下列叙述错误的是（　　） 实验处理 结果 实验一：检测植株A、B花芽细胞中的mRNA 植株A花芽细胞中含有Lcyc基因转录的mRNA 植株B花芽细胞中不含Lcyc基因转录的mRNA 实验二：用两种限制酶对植株A、B的Lcyc基因进行酶切，酶切位点如图1。若识别位点附近被甲基化则PstI无法识别对应序列。 植株A的Lcyc基因经酶切产生1.5kb、0.7kb、0.2kb三种片段；植株B的Lcyc基因经酶切产生2.4kb一种片段 A．实验一证明植株B花形为辐射对称的原因是Lcyc基因不表达 B．实验二证明植株B的Lcyc基因中PstI酶切位点附近发生甲基化 C．实验一、二说明植株B碱基的甲基化特征可以遗传给后代 D．中突变型占5/39是Lcyc基因选择性表达的结果 【答案】C 【分析】表观遗传是指DNA序列不发生变化，但基因的表达却发生了可遗传的改变，即基因型未发生变化而表现型却发生了改变，如DNA的甲基化，甲基化的基因不能正常表达。 【详解】A、依据实验一，植株A花芽细胞中含有Lcyc基因转录的mRNA，植株B花芽细胞中不含Lcyc基因转录的mRNA，说明植株B花形为辐射对称的原因是Lcyc基因不表达，A正确； B、依据题干信息可知，若识别位点附近被甲基化则PstI无法识别对应序列，植株A之所以产生1.5kb、0.7kb、0.2kb三种片段，是由于PstI酶的酶切，而植株B之所以只产生2.4kb片段，则可能是Lcyc基因中PstI酶切位点附近发生甲基化，导致PstI无法识别，B正确； C、依据实验一、二的结果无法说明碱基的甲基化特征可以遗传给后代的结论，C错误； D、结合A项可知，F2中突变型占5/39是Lcyc基因发生了选择性表达的结果，D正确。 故选C。 15．（2025·福建龙岩·一模）科研人员利用两种识别不同序列的限制酶（E1和E2）处理某一基因表达载体后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．该载体的长度约为800bp，E1和E2在该载体上的酶切位点最短相距约400bp B．电泳加样时，将扩增得到的PCR产物与电泳缓冲液（内含指示剂）混合，注入加样孔内 C．待观察到DNA片段前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 D．凝胶中的DNA分子与核酸染料结合后可以在紫外灯下被检测出来 【答案】D 【分析】切割DNA的工具是限制酶，它们能够识别双链DNA分子的某种特定脱氧核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 【详解】A、仅从图中信息无法直接得出载体的长度约为800bp。同时，仅根据现有信息也不能确定E1和E2在该载体上的酶切位点最短相距约400bp，因为不知道各片段的具体来源和连接关系等详细信息，A错误； B、电泳加样时，是将酶切后的产物与电泳缓冲液（内含指示剂）混合，注入加样孔内，B错误； C、接通电源后，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳，C错误； D、凝胶中的DNA分子和核酸染料结合后，在紫外灯下可以被检测出来，这是核酸检测的常见方法，D正确。 故选D。 16．（2025·黑龙江吉林·一模）新型蛋白质进化模型EVOLVEpro可以利用氨基酸序列，仅通过少量学习和最低限度的实验测试来预测蛋白质空间结构，从而获得新型高活性蛋白质改造方案。下列有关说法正确的是（    ） A．预测蛋白质结构需要依据肽链中肽键的结构、氨基酸的物理性质与结构 B．氨基酸是蛋白质的基本单位，氨基酸发生替换一定使蛋白质的结构和功能发生改变 C．EVOLVEpro在蛋白质工程广泛应用后将不再需要借助基因工程手段改造蛋白质 D．通过EVOLVEpro得到的蛋白质还需要进行进一步的功能检测实验才可以投入生产 【答案】D 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或者制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产生活需求。 【详解】A、对蛋白质进行分子设计应从预期的蛋白质功能出发，对蛋白质的空间结构进行设计，不是肽键的结构和氨基酸的物理性质与结构，A错误； B、氨基酸是蛋白质的基本单位，氨基酸发生替换后蛋白质的结构和功能可能没有发生改变，尤其个别氨基酸的改变可能没有影响，B错误； C、新型蛋白质进化模型EVOLVEpro可以利用氨基酸序列，蛋白质工程仍需要基因修饰或基因合成等手段，EVOLVEpro在蛋白质工程广泛应用后将还需要借助基因工程手段改造蛋白质，使得产品更优良，C错误； D、通过EVOLVEpro得到的蛋白质还需要进行进一步的功能检测实验才可以投入生产，确保对人体安全没有副作用，D正确。 故选D。 17．（2025·广东深圳·一模）为探究DNA片段P与O2蛋白结合的关键位点，研究者获得片段P不同位点的突变体M1、M2和M3，用O2蛋白进行结合试验，并用指示探针（带荧光的片段P）等进行检测，结果如图。下列分析正确的是（    ） 注：“－”表示未添加，“+”表示添加，指示探针的浓度很低 A．条带1越宽说明O2蛋白与待测物的结合越强 B．显示条带2就说明O2蛋白与P无法结合 C．M1的突变位点几乎不影响O2蛋白的结合 D．M2和M3与O2蛋白的结合强度相同 【答案】C 【分析】探针：是指经过同位素或荧光标记的DNA分子。 【详解】AB、泳道2与泳道1相比较，条带2变窄，条带1变宽，说明O2蛋白与指示探针结合，二者结合的越多，条带1就会越宽，条带2就会越窄，由于无荧光标记的P和突变体（M1、M2、M3）会竞争指示探针与O2蛋白结合，从而使条带2变宽，条带1变窄，且与O2蛋白的结合能力越强，条带1会越窄，条带2越宽，条带1越宽说明O2蛋白与指示探针的结合越强，探针与待测物的结合越弱，所以显示条带2说明全部或部分探针未结合O2蛋白，即说明O2蛋白与P可以结合，AB错误； C、M1的电泳条带与片段P的电泳条带大体一致，说明了M1的突变位点几乎不影响O2蛋白的结合，C正确； D、M2和M3的电泳条带不同，说明其与O2蛋白的结合强度不同，D错误。 故选C。 18．（2025·山东济宁·一模）端粒学说是细胞衰老的假说之一，研究发现，端粒缩短与DNA复制方式有关。人体细胞内DNA复制部分过程如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．图示体现了DNA半保留复制、双向复制的特点 B．图示引物为短单链核酸，复制过程中会被酶切除 C．PCR扩增的原理与生物体内DNA复制的原理相同 D．端粒缩短的原因是新合成的子链5'端变短 【答案】A 【分析】DNA复制过程为：（1）解旋：需要细胞提供能量，在解旋酶的作用下，两条螺旋的双链解开；（2）合成子链：以解开的每一段母链为模板，在DNA聚合酶等酶的作用下，利用游离的4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，合成与母链互补的子链；（3）形成子代DNA分子：延伸子链，母链和相应子链盘绕成双螺旋结构。 【详解】A、DNA复制是半保留的，即每个新合成的DNA分子包含一条亲代链和一条新合成的子链，图示过程可体现DNA的半保留复制，但不能体现双向复制（从复制起点向两个方向同时进行）的特点，A错误； B、结合图示可知，在DNA复制过程中，引物是短单链核酸，，用于启动DNA合成。随后，引物会被DNA聚合酶切除，并由DNA片段填补，B正确； C、PCR（聚合酶链式反应）是一种体外DNA扩增技术，其原理与生物体内的DNA复制相似，都是DNA半保留复制，C正确； D、结合图示可知，由于有冈崎片段等存在，新合成的子链5'端变短，从而导致端粒缩短，D正确。 故选A。 19．（2025·江西·一模）由于花椰菜杂种优势在提高花椰菜产量方面发挥着巨大的作用，而利用细胞质雄性不育系生产杂交种子，可以简化制种程序。利用原生质体非对称融合技术比较容易实现胞质雄性不育基因的转移，某研究利用该技术成功获得了含有胞质雄性不育基因的花椰菜植株，制作流程如下，下列说法错误的是（    ）    注：UV处理可以随机破坏染色体结构，使其发生断裂、丢失等，使细胞不再分裂 A．原生质体非对称融合技术使得杂种植株性状更接近于供体植株 B．②过程的原理是细胞膜具有一定的流动性，常用PEG融合法 C．培养一段时间后可通过观察叶绿体初步判断是否为异源原生质体 D．为鉴定再生植株成功获得细胞质雄性不育基因，可利用PCR进行鉴定 【答案】A 【分析】植物组织培养的条件：（1）细胞离体和适宜的外界条件（如适宜温度、适时的光照、pH和无菌环境等）；（2）一定的营养（无机、有机成分）和植物激素（生长素和细胞分裂素）。 【详解】A、供体细胞经UV处理失去了部分遗传物质，而受体细胞遗传物质完整，因此杂种植株性状更接近于受体植株，A错误； B、②过程为原生质体融合，其原理是细胞膜具有一定的流动性，常用方法有PEG融合法、电融合法等，B正确； C、供体细胞有叶绿体，受体细胞无叶绿体，供体细胞经UV处理，一段时间后失去活性，融合细胞具有叶绿体，且能保持活性，故可通过观察叶绿体初步判断是否为异源原生质体，C正确； D、提取再生植株基因组，针对细胞质雄性不育基因设计引物进行PCR，结合电泳技术观察有无目的条带判断是否获得目的基因，D正确。 故选A。 20．（2025·湖北武汉·一模）PCR技术的每轮循环可以分为变性、复性、延伸三步。引物与其模板链形成的杂合分子的解链温度称为引物的Tm值。下列叙述正确的是（    ） A．引物与模板链的结合属于延伸过程 B．变性过程的温度一般要低于复性过程 C．复性过程的温度应设置为略低于Tm值 D．引物的 Tm 值越接近,引物之间越容易结合 【答案】C 【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。其原理为DNA复制。PCR的前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。其过程为：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】A、PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步，引物与模板链的结合属于复性过程，A错误； B、变性过程的温度一般要高于复性过程，变性的目的是使DNA解旋成为单链，B错误； C、题意显示，引物与其模板链形成的杂合分子的解链温度称为引物的Tm值，复性过程的温度应设置为略低于Tm值，否则会导致解螺旋发生，C正确； D、引物的 Tm 值越接近，引物之间越不容易结合，因为该温度下氢键不容易形成，D错误。 故选C。 21．（2025·福建厦门·一模）RT-PCR是将RNA逆转录（RT）成cDNA（与mRNA互补的DNA单链）和聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术，具体过程如图所示，下列叙述正确的是（　　） A．过程Ⅰ获得cDNA的过程与DNA复制过程中碱基配对方式相同 B．图中A、B两种引物在72°C时通过碱基互补配对结合到模板链 C．图中子链的合成均是以四种核糖核苷酸为原料从引物的一端开始的 D．过程Ⅱ中，若进行6轮循环，则共需要加入引物的数量为63个 【答案】D 【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的简称，利用DNA复制的原理，RT-PCR需要先完成逆转录过程再进行DNA复制，逆转录和DNA复制都遵循碱基互补配对原则。 【详解】A、过程I是逆转录过程，是以mRNA为模板合成cDNA，该过程的碱基配对方式为A-T、U-A、G-C、C-G，而DNA复制过程的碱基配对方式为A-T、T-A、G-C、C-G，二者碱基配对方式不完全相同，A错误； B、引物是通过碱基互补配对结合到模板链上的，该过程是在复性阶段完成的，复性的温度一般为55-60°C，而不是72°C，72°C是延伸阶段的温度，B错误； C、图中子链的合成是以四种脱氧核糖核苷酸为原料，从引物的一端开始进行合成，C错误； D、过程Ⅱ中，若进行6轮循环，最终产生的DNA单链数为26=64（条），新合成的子链数为63条，则进行6轮循环，共需要加入引物的数量为63个，D正确。 故选D。 22．（2025·四川巴中·一模）科学家发现一未知DNA分子，该DNA分子存在多种限制酶切位点。研究人员利用三种限制酶对该DNA分子进行不同的酶切处理，将处理后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图所示。据图推断，下列选项最可能为该DNA分子原始图谱的是（　　） A． B． C． D． 【答案】D 【分析】切割DNA 分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。它们能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 【详解】A、由选项A的图可以看出，只有BglII，XhoI的酶切位点，不符合题意，A错误； B、由选项B图可以看出，用HindIII切割产生的是6Kb和8Kb，不符合题意，B错误； C、由选项C图可以看出，无HindIII的酶切位点，C错误； D、由选项D图可以看出，被XhoI切割后产生了一个2Kb和14Kb的片段，被BglII切割后产生了一个6Kb和10Kb的片段，被HindIII切割后产生了一个16Kb的片段，XhoI+HindIII切割，产生一个2Kb和6Kb和8Kb的片段，D正确。 故选D。 23．（2025·陕西西安·一模）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，正确的是（　　） A．在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关 B．鉴定DNA时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中进行沸水浴 C．选用植物细胞提取DNA时，研磨后用滤纸进行过滤 D．琼脂糖凝胶加样孔一端朝向电泳槽的正极 【答案】A 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：(1)DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的。 (2)DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离。 【详解】A、在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关。凝胶的浓度越大，DNA分子越大，DNA分子的迁移速率越慢，DNA构象也影响迁移速率，A正确； B、鉴定DNA时，应先将丝状物溶解在2mol/L的NaCI溶液中，再加入二苯胺试剂并进行沸水浴，B错误； C、选用植物细胞提取DNA时，研磨后用纱布进行过滤，C错误； D、DNA分子带负电荷，在电场的作用下，向着与它所带电荷相反的电极移动，故琼脂糖凝胶加样孔一端朝向电泳槽的负极，D错误。 故选A。 二、多选题 24．（2025·江西·一模）除草剂有效成分草甘膦的作用机理是和PEP竞争性结合EPSP合酶，从而扰乱生物体的正常氮代谢。但作为一种非选择性除草剂，草甘膦对农作物同样具有杀伤作用，这大大限制了其在农业生产中的应用，培育抗草甘膦作物将会解决这一难题。下列说法错误的是（    ） A．长期使用草甘膦除草剂，会导致杂草产生抗除草剂突变，降低除草剂的效果 B．根据草甘膦的作用机理，可通过导入强启动子使EPSP合酶过量表达获得抗草甘膦作物 C．可通过蛋白质工程直接替换EPSP合酶个别氨基酸，使草甘膦无法与EPSP酶结合 D．在培育抗草甘膦作物时，为避免外源基因流入杂草，最好将外源基因插入细胞核基因组 【答案】ACD 【分析】1、蛋白质工程的基本原理：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 2、现代生物进化理论的内容：适应是自然选择的结果;种群是生物进化的基本单位；突变和基因重组提供进化的原材料，自然选择导致种群基因频率的定向改变，进而通过隔离形成新的物种；生物进化的过程实际上是生物与生物、生物与无机环境协同进化的过程；生物多样性是协同进化的结果。 【详解】A、杂草中原本存在抗除草剂突变，除草剂起选择作用，长期使用除草剂，抗除草剂个体数量增多，表现为抗药性下降，A错误； B、草甘膦的作用机理是和PEP竞争性结合EPSP合酶，通过导入强启动子使EPSP合酶过量表达，可以和草甘膦结合，并且有足够的酶满足自身代谢需要，B正确； C、可利用蛋白质工程改造EPSP合酶的基因，使其表达产物与草甘膦无法结合，但是可以和PEP结合，达到抗草甘膦的效果，不能直接替换氨基酸，C错误； D、在培育抗草甘膦作物时，为避免外源基因流入杂草，最好将外源基因插入细胞质基因组，D错误。 故选ACD。 25．（2025·江西·一模）融合PCR技术（SOE PCR）是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分作为模板进行PCR扩增，连接两段基因以获得目的基因的方法。通过SOE PCR将鸡干扰素α基因（甲）和鸡白介素18基因（乙）连接的过程如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．融合PCR技术的每次循环都需经历两次降温和一次升温 B．两基因融合过程既需限制酶，也需耐高温的DNA聚合酶 C．图中PCR1至少需经过2次PCR循环才可获得双链等长的DNA片段 D．引物3是同时依据鸡干扰素α基因和鸡白介素18基因的碱基序列设计的 【答案】AB 【分析】PCR技术的PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，其原理为DNA复制，该过程的进行首先要有一段已知核苷酸序列的目的基因以便合成一对引物，其过程为：高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；中温延伸：合成子链。 【详解】A.融合PCR技术的每次循环（变性、复性、延伸）都需经历两次升温和一次降温，A错误； B.由图可知，先通过PCR1扩增出鸡干扰素α基因片段甲，PCR2扩增出鸡白介素18基因片段乙，再将甲、乙混合进行PCR扩增、融合，两基因融合过程不需要限制酶对DNA进行切割，但需要耐高温的DNA聚合酶催化DNA子链的合成，B错误； C.图中PCR1至少需经过2次PCR循环才可获得双链等长的鸡干扰素α基因片段甲，C正确； D.由图可知，引物3需要同时依据鸡干扰素α基因的右侧序列和鸡白介素18基因的左侧序列进行设计，D正确； 故选AB。 26．（2025·河北沧州·一模）基因工程可将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。下列相关叙述正确的是（　　） A．基因工程需引物是因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA B．引物设计时既要考虑目的基因的碱基序列，还要考虑载体的碱基序列 C．为便于目的基因与载体连接，需在引物的3′端加上限制酶的酶切位点 D．用同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒，在DNA连接酶作用下可能会反向连接 【答案】ABD 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、DNA 聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链 DNA 片段的引物链上，不能从头开始合成 DNA，所以基因工程中进行 PCR 扩增等操作时需要引物，A正确； B、在基因工程中，引物要与模板 DNA 链（可能是目的基因或载体的一部分）结合，以便进行 DNA 的合成，因此，引物设计时既要考虑目的基因的碱基序列，还要考虑载体的碱基序列，B正确； C、为便于目的基因与载体连接，需在引物的 5′端加上限制酶的酶切位点，而不是 3′端，因为 DNA 聚合酶只能从引物的 3′端开始延伸 DNA 链，若在 3′端加酶切位点会影响 DNA 的合成，C错误； D、用同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒，两端的黏性末端相同，在 DNA 连接酶作用下可能会出现正向连接，也可能会反向连接，D正确。 故选ABD。 27．（2025·山东枣庄·一模）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”（实验1）和“DNA的粗提取与鉴定”（实验2）的实验操作，下列相关叙述错误的是（　　） A．实验1中，DNA电泳时需要在琼脂糖熔化之后凝固之前加入核酸染料 B．实验1中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源 C．实验2中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积的体积分数为70%的冷酒精后析出DNA D．实验2中，需先将白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺试剂并进行沸水浴，用于鉴定DNA 【答案】BC 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、DNA电泳鉴定时需要在琼脂糖熔化之后尚未完全凝固之前加入核酸染料，预先将染料加入凝胶中，可使电泳分离后的DNA分子在凝胶中能充分染色，A正确； B、进行PCR扩增产物电泳时，应在加样后再接通电源，B错误； C、实验2中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积的体积分数为95%的冷酒精（或冷的无水乙醇）后析出DNA，C错误； D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此实验2中需先将白色丝状物（析出的DNA）溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺试剂并进行沸水浴，用于鉴定DNA，D正确。 故选BC。 三、非选择题 28．（2025·天津蓟州·一模）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)进行PCR扩增时需要耐高温的DNA聚合酶，为使其活化应在PCR反应缓冲液中加入 （填“Ca2+”或“Mg2+”）。 (2)有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R应在下列选项中分别选用 。 A．5'-ATGGTG……CAACCA-3' B．5'-TGGTTG……CACCAT-3' C．5'-GACGAG……CTGCAG-3' D．5'-CTGCAG……CTCGTC-3' (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在酶的作用下可形成环形质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要是 。 (4)构建好的重组质粒除了含有目的基因、标记基因，还要有 ，用以控制目的基因的表达。 (5)如何将重组质粒导入大肠杆菌？ 。 (6)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3.根据图中结果判断，符合要求的质粒为 。 【答案】(1)Mg2+ (2)CD (3)限制酶 (4)启动子和终止子 (5)用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，可将重组质粒导入细胞 (6)P1和P2 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）进行 PCR扩增时需要耐高温的DNA聚合酶，为使其活化应在PCR反应缓冲液中加入Mg2+。 （2）由图1可知，引物F2−F用于扩增F2片段，引物F1−R用于扩增F1片段，C选项中5′−GACGAG−3′ 能与EGFP基因右端和AnBI 中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物 F2−F 选用C；D选项中 5′−CTGCAG−3′ 能与AnBI 中左侧部分碱基和GFP基因右端右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1−R选用D。 故选CD。 （3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用 DNA 连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将 PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在 DNA 连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制酶。 （4）启动子好和终止子分别控制转录的开始和结束，故构建好的重组质粒除了含有目的基因、标记基因，还要有启动子和终止子，用以控制目的基因的表达。 （5）大肠杆菌属于原核生物，将重组质粒导入大肠杆菌一般是用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态。 （6）EGFP为720bp，AnBI 为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1100bp，用引物F1−F和F2−R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，符合要求的质粒有P1、P2。 29．（2025·黑龙江·一模）研究人员通过基因工程制备了能生产乙肝病毒抗原蛋白的酿酒酵母。抗原蛋白基因转录的模板链碱基序列为5'-GATTCG-3',5'-CCATGC-3'。如图表示育种过程利用的载体及限制酶的识别序列（注：假设目的基因内不含有相应酶的识别序列）。    (1)在通过PCR扩增目的基因片段的反应条件中，预变性的目的是 。在实际PCR反应中，扩增效率通常低于100%。若某次PCR反应的扩增效率为80%（PCR扩增效率是指在PCR反应中，每个循环中目标DNA分子的实际增加倍数与理论增加倍数的比值），初始模板DNA的量为10ng，经过25个循环后，实际获得的PCR产物量为 ng。 (2)据图分析，为了构建基因表达载体，我们应选择 来切割载体。由于抗原蛋白基因无法直接插入载体中，因此需要通过设计特定的引物，这些引物不仅包含与目的基因两端匹配的序列，还需包含特定的酶切位点，以便在扩增后能够与载体进行连接。引物的碱基序列从5'端到3'端依次 、 。 (3)真核生物的基本启动子没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列，可增强一个或多个基因的转录水平（如图）。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。    ①对文中“增强子”的理解，错误的是 A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B．一个增强子只能作用于一个基本启动子 C．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 D．很多增强子在不同组织中的活性不同 ②科学家鉴定出小鼠某胚胎细胞内一个增强子附近有两个基因A和B，为了确定这两个基因是否为特异表达的基因，他们应该检测 。 (4)检测受体细胞是否成功导入了重组载体，除了利用利用抗生素抗性筛选，还可以利用 方法。 【答案】(1) 使DNA双链完全打开，为DNA复制提供单链模板。（或答提高模板DNA彻底变性的概率，为PCRDNA反应提供单链模板；或答确保模板完全解链） 10×（1.8）25 (2) EcoR I、BamH 1 5´-GAATTCGATTCG-3´ 5´-GGATCCGCATGG-3´ (3) B 这两个基因在不同组织或细胞类型中是否转录出相应的基因或是否翻译出相应的蛋白质 (4)PCR检测 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR过程包括变性、复性、延伸等过程，其中变性的目的是使DNA双链完全打开，为DNA复制提供单链模板。PCR的本质是DNA的复制，原本1个DNA经复制1次后可得到2个DNA，由题意可知，PCR反应的扩增效率为80%，则1ngDNA经1次复制后可得到1.8ngDNA，所以10ngDNA经复25次循环，即25次复制后可得到10×1.825ngDNA。 （2）为了保证目的基因能正常表达，切割载体时，切割位点应选在启动子和终止子之间，结合图示可知，由于EcoR V切割所得的是平末端，不利于表达载体的构建，所以选择EcoR I、BamH I对载体进行切割。由题意可知，抗原蛋白基因转录的模板链碱基序列为5'-GATTCG-3'，5'-CCATGC-3'，为将目的基因与载体连接起来，应在目的基因两端加上对应的限制酶切割位点，所以引物的碱基序列从5'端到3'端依次5´-GAATTCGATTCG-3´，5´-GGATCCGCATGG-3´。 （3）①AC、依据题干“增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因 表达的调控序列”可知，增强子是含有特定碱基序列的DNA片 段，增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体 上，AC正确； B、由图可知，一个增强子可作用于多个基本启动子，B错误； D、依据题干“很多增强子具有组织特异的活性”可知，很多增强子在不同组织中的活性不同，D正确。 故选B。 ②为了确定这两个基因是否为特异表达的基因，他们应该检测这两个基因在不同组织或细胞类型中是否转录出相应的基因或是否翻译出相应的蛋白质，若转录出相应的基因或是否翻译出相应的蛋白质，说明该基因表达，否则该基因未表达。 （4）检测目的基因是否导入受体细胞，可通过利用表达载体上抗性基因（标记基因）对应的抗生素进行筛选，也可通过PCR检测，若PCR后可检测到相关条带，则说明导入成功。 30．（2025·河北石家庄·一模）草甘膦是一种广泛使用的除草剂，对大多数植物都具有杀灭作用。为在作物生长期间定向除草，研究人员改变芥菜EPSPS基因特定位点，将其导入芥菜，培育出了抗草甘膦的新品种，操作流程如图。回答下列问题：    (1)过程①为 ，其需要在缓冲液中进行，缓冲液的作用是 ；①与②（PCR）的反应体系相比不同点有 （答出两点即可）。 (2)以cDNA为模板扩增EPSPS基因后一般通过 鉴定产物，并置于 下观察结果。 (3)芥菜EPSPS基因定点突变原理如图2所示，引物2的部分核苷酸序列为5'－GAATAGTCATGCGTTCACTC…－3'，请据此补充引物3的核苷酸序列5'－GTGAACGCATGA …－3'，引物3与反义链相应的核苷酸序列 （填“相同”或“不同”）。    (4)研究人员将突变基因插入T－DNA的绿色荧光蛋白基因上游，如图3。为使两个基因融合表达以确定EPSPS在细胞的位置，需要去除突变基因的 序列。 【答案】(1) 逆转录 维持反应体系的pH稳定，并提供酶所需的离子环境（如Mg²⁺） ①（反转录）需要逆转录酶，而PCR需要耐高温的DNA聚合酶（如Taq酶）；反转录的引物为oligo(dT)或随机引物，而PCR需要特异性引物 (2) 琼脂糖凝胶电泳 紫外灯 (3) CTATTC 不同 (4)编码终止密码子的序列 【分析】1、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）过程①将RNA转化为cDNA，属于逆转录。  缓冲液为酶反应提供适宜环境，包括pH和离子条件，缓冲液的作用是维持反应体系的pH稳定，并提供酶所需的离子环境（如Mg²⁺）。  反转录与PCR的差异主要体现在酶、引物类型及反应温度（如反转录无需高温循环），①（反转录）需要逆转录酶，而PCR需要耐高温的DNA聚合酶（如Taq酶）；反转录的引物为oligo(dT)或随机引物，而PCR需要特异性引物。 （2）PCR产物通常通过琼脂糖凝胶电泳分离，DNA与溴化乙锭（EB）结合后，在紫外灯下显示荧光条带。 （3）根据图示信息可知，引物2和引物3有部分序列是互补的，由此可知引物3需补充序列为5'－CTATTC…－3'，在PCR中，引物需与模板链的3'端互补。若反义链为模板，引物3的序列应与反义链互补（即与正义链相同）。题目中引物3的序列设计为与反义链互补，但是由于是进行基因定点突变，所以引物3与反义链对应区域的核苷酸序列不同。 （4）为使EPSPS突变基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合表达，需去除编码终止密码子的序列，使两个基因共同表达为融合蛋白。题中EPSPS基因是逆转录生成的，没有终止子。 31．（2025·贵州铜仁·一模）植物在遭受生物或非生物胁迫时，往往会积累次生代谢产物来应对外界伤害。紫杉醇是存在于红豆杉属植物体内的一种次生代谢产物，具有高抗癌活性。研究发现从红豆杉愈伤组织细胞就可以提取紫杉醇。 回答下列问题： (1)在利用植物组织培养技术生产紫杉醇的过程中，最好选择红豆杉的 （幼嫩茎段/成熟茎段）作为外植体进行培养，原因是 。 (2)在一定激素和营养等条件的诱导下，外植体细胞会失去其特有的结构和功能，转变成未分化的细胞，这个转变过程称为 。未分化的细胞进而形成愈伤组织，将愈伤组织悬浮培养可获得紫杉醇。 (3)研究人员在利用植物组织培养技术生产紫杉醇的过程中发现紫杉醇的产量很低。结合题干信息，提出一种提高紫杉醇产量的措施 。目前利用基因工程构建稳定高产紫杉醇的工程菌研究取得很大进展，写出利用紫杉醇合成酶基因构建基因表达载体的思路 。 【答案】(1) 幼嫩茎段 幼嫩茎段细胞的全能性高于成熟茎段（或幼嫩茎段细胞的分化程度低，全能性高） (2)脱分化 (3) 培养过程中模拟生物或非生物胁迫环境 先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有紫杉醇合成酶基因的DNA片段，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处 【分析】植物组织培养技术： （1）过程：离体的植物组织，器官或细胞（外植体）→愈伤组织→胚状体→植株（新植体）。 （2）原理：植物细胞的全能性。 （3）条件：①细胞离体和适宜的外界条件（如适宜温度、适时的光照、pH和无菌环境等）；②一定的营养（无机、有机成分）和植物激素（生长素和细胞分裂素）。 【详解】（1）在利用植物组织培养技术生产紫杉醇的过程中，最好选择红豆杉的幼嫩茎段作为外植体进行培养，原因是幼嫩茎段细胞的全能性高于成熟茎段（或幼嫩茎段细胞的分化程度低，全能性高）。在植物组织培养过程中更容易被诱导形成愈伤组织，进而用于生产紫杉醇。 （2）在植物组织培养中，外植体细胞在一定条件下失去其特有的结构和功能，转变成未分化细胞的过程就是脱分化，脱分化形成的未分化细胞会进一步形成愈伤组织，将愈伤组织悬浮培养可获得紫杉醇。 （3）研究人员在利用植物组织培养技术生产紫杉醇的过程中发现紫杉醇的产量很低，提高紫杉醇产量的措施为培养过程中模拟生物或非生物胁迫因素，诱导红豆杉愈伤组织细胞积累更多的紫杉醇。因为题干提到植物在遭受生物或非生物胁迫时会积累次生代谢产物，所以通过添加胁迫因素可促使愈伤组织细胞产生更多的紫杉醇。利用紫杉醇合成酶基因构建基因表达载体的思路：先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有紫杉醇合成酶基因的DNA片段，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成基因表达载体。 32．（2025·河北唐山·一模）四甲基吡嗪（TTMP）是枯草芽孢杆菌的一种代谢产物，是影响白酒风味的重要物质。bdhA基因的表达产物是降低TTMP含量的关键酶，研究人员欲通过敲除枯草芽孢杆菌的bdhA基因提高TTMP产量。回答下列问题： (1)为获取枯草芽孢杆菌的纯净培养物E，可取少量枯草芽孢杆菌菌液接种到牛肉膏蛋白胨 （填“固体”或“液体”）培养基中，蛋白胨提供的主要营养是 。 (2)利用下图中的3对引物扩增出bdhA基因的上、下游片段和cat基因，将3种扩增产物和质粒1分别酶切后进行连接以获得质粒2。为使cat基因位于质粒2的上、下游片段之间，在设计引物5、6时，应在引物的 端分别加入限制酶 和 的识别序列。 (3)用质粒2转化菌株E时，可用 处理菌株E以提高转化的成功率。质粒2与菌株E的DNA发生同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与E中bdhA基因上、下游片段配对，并发生交换）使E的bdhA基因替换为cat基因。将转化处理的枯草芽孢杆菌置于含有 的培养基中以筛选出目的菌株E-。 (4)为检验E-的bdhA基因被成功敲除，以E-的基因组DNA为模板，选用引物 进行PCR，预期扩增只获得一种大小为 bp的DNA片段。对于PCR产物电泳结果符合预期的DNA片段，通常还需进一步通过基因测序确认，原因是 。为研究敲除bdhA基因是否影响菌株生长，可用接种环挑取E⁻后直接用 法进行接种，观察到菌落大小和形态与菌株E一致。 【答案】(1) 固体 碳源、氮源、维生素 (2) 5' BamHI XbaI (3) CaCl2 氯霉素 (4) 1和4 3117 电泳条带仅能显示扩增片段的大致长度，不能呈现碱基序列 平板划线 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）取少量枯草芽孢杆菌菌液接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，挑选单菌落，获得纯培养物；蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，能为微生物提供碳源、氮源、维生素。 （2）为了在目的基因两侧加上限制酶识别序列，应在引物的5，端加上限制酶序列；结合图示可知，引物5、6扩增出的cat基因，同源替换到引物1、3扩增出的基因，需要相同的限制酶，引物1、3的两侧加入限制酶BamHI、XbaI的识别序列，因此引物5、6两侧应加入限制酶BamHI、XbaI的识别序列。 （3）CaCl2可以增加细胞膜的通透性，提高转化的成功率；E的bdhA基因替换为cat基因（氨苄青霉素抗性基因），将转化处理的枯草芽孢杆菌置于含有氨苄青霉素的培养基中以筛选出目的菌株E-（目的基因被破坏，替换成氨苄青霉素抗性基因）。 （4）选用引物1、4进行PCR，如果cat基因替换基因被敲除，则扩增出两边的序列长度为839+1540+738=3117；由于引物可能与其它地方发生配对，可能存在非特异性扩增，因此通常还需进一步通过基因测序确认；平板划线法是指用接种环在固体培养基表面连续划线，逐步使接种物随所划之线分散，便于形成单个菌落的操作。 33．（2025·山东聊城·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因（如图1所示）的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将斑马鱼的vtg基因，与人工构建的含萤火虫荧光素酶基因（无启动子）的载体（如图2所示）连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼。图2中Luc表示萤火虫荧光素酶基因，可以催化荧光素氧化产生荧光；为氨苄青霉素抗性基因，表示四环素抗性基因，BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ为限制酶。 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，可选用限制酶 进行双酶切Luc基因载体，其优点是 。 (2)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，通过PCR技术扩增vtg基因时，需设计合适的加端引物。依据图1、图2信息推测引物2包含的碱基序列为 。一个vtg基因经过4轮循环后，得到的子代DNA分子中，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为 。 (3)若筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养，筛选 的大肠杆菌即为目的菌；若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加 进行检测。 【答案】(1) EcoRI、HindⅢ 防止质粒和目的基因的自身环化和目的基因的反向连接 (2) 5'-AAGCTTAGAGGC-3' 1/8 (3) 能在含有氨苄青霉素的培养基中生长但不能在含有四环素的培养基中生长 雌激素和荧光素 【分析】基因工程技术的基本步骤：   1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。   2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。   3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。   4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）要使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，应选用两种不同的限制酶进行双酶切。观察图2，EcoRI和HindⅢ的酶切位点分别位于Luc基因载体的不同位置，用这两种酶双酶切可以满足要求，可以防止质粒和目的基因的自身环化和目的基因的反向连接； （2）引物2要与vtg基因的模板链互补配对，并且要包含与Luc基因载体双酶切后相同的黏性末端（HindⅢ的黏性末端）。根据图1中vtg基因的序列以及图2中HindⅢ的识别序列，引物2包含的碱基序列为5'-AAGCTTAGAGGC-3'；一个vtg基因经过4轮循环后，共得到24 = 16个DNA分子。其中只含有1种引物的DNA分子有2个，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为1/8； （3）重组载体中含有氨苄青霉素抗性基因，而四环素抗性基因因酶切被破坏，所以导入vtg - Luc基因重组载体的大肠杆菌能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，不能在含有四环素的培养基中生长，筛选能在氨苄青霉素培养基中生长，不能在四环素培养基中生长的大肠杆菌即为目的菌；水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。因为转基因斑马鱼含有萤火虫荧光素酶基因，该酶可以催化荧光素氧化产生荧光，所以若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加雌激素和荧光素进行检测。 34．（2025·内蒙古阿拉善盟·一模）双乙酰是啤酒中的主要风味物质，含量过高会影响啤酒的品质；谷胱甘肽可以提高啤酒的抗老化能力。研究发现，ILV2基因编码双乙酰合成中的关键酶，GSH1基因编码谷胱甘肽合成中的关键酶。为生产低双乙酰且抗老化的啤酒，科研人员运用基因工程技术制备啤酒酵母工程菌，过程如图，其中CUPI基因的表达产物可使细胞对一定浓度的硫酸铜产生抗性。请分析回答： SalⅠ 5'-G↓TCGAC-3' Kpn Ⅰ 5'-G↓GTACC-3' Sph Ⅰ 5' -GCATG↓C -3 Xba Ⅰ 5'-T↓CTAGA-3'' Bgl Ⅱ 5'-A↓GATCT-3' Pst Ⅰ 5'-CTCC↓AG-3' (1)分析图1可知，需用 （填限制酶名称）切割质粒1以获取CUPI基因。 (2)转化后的啤酒酵母应置于含 的培养基中进行初步筛选。 (3)进一步鉴定需要以转化后啤酒酵母的 为模板，用图示两种引物进行PCR扩增。若扩增产物的大小约为1300bp，则说明 基因已整合到啤酒酵母的染色体上。 (4)将啤酒酵母工程菌与未转化的受体菌分别置于麦芽汁培养基中培养，定期取样检测，结果如图2。    据图2分析，啤酒酵母工程菌抗老化能力 。啤酒酵母工程菌的双乙酰合成量明显 未转化的受体菌，原因是 。 【答案】(1)Bgl Ⅱ 和 Sal Ⅰ (2)一定浓度的硫酸铜 (3) 总DNA CUP1基因和GSH1基因 (4) 增强 低于 啤酒酵母工程菌的ILV2基因被破坏 【分析】基因工程的基本操作程序包括四个步骤：目的基因的获得、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。其中需要用的基本工具有限制性内切核酸酶（简称限制酶）、DNA连接酶和运载体。限制酶能够识别DNA上特定的碱基序列，将DNA从特定的位置切开，用同种的限制酶处理目的DNA和运载体，得到相同的末端，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接起来，形成重组运载体。 【详解】（1）观察图1中质粒1的结构，CUPI基因两端的限制酶切割位点分别为Sal Ⅰ和Bg1Ⅱ，所以要用Sal Ⅰ和Bg1Ⅱ切割质粒1，才能将CUPI基因完整地从质粒1上切割下来； （2）由题意“CUPI基因的表达产物可使细胞对一定浓度的硫酸铜产生抗性”可知，转化后的啤酒酵母应置于含一定浓度的硫酸铜的培养基中进行初步筛选，这样就可以筛选出转化后含有CUPI基因的啤酒酵母，只有成功导入并表达CUPI基因的啤酒酵母才能在含铜离子的培养基中生存； （3）进一步鉴定需要检测目的基因是否整合到啤酒酵母的染色体上，所以应以转化后啤酒酵母的总DNA为模板，因为啤酒酵母的总DNA包含了可能整合进去的CUPI基因等所有遗传物质；由图1可知，用Kpn Ⅰ和Pst Ⅰ处理重组质粒后导入啤酒酵母的片段含有CUPI基因和GSH1基因。已知CUPI基因大小为1028bp，引物1到引物2之间还包含ILV2 -左部分片段（270bp），1028+270=1298，约为1300bp，因此扩增产物的大小约为1300bp则说明CUPI基因导入啤酒酵母的染色体上，也说明CUPI基因和GSH1基因已整合到啤酒酵母的染色体上； （4）由题意可知，谷胱甘肽含量越高，抗老化能力越强。从图2可以看出，工程菌的谷胱甘肽含量高于未转化的受体菌，所以啤酒酵母工程菌抗老化能力增强；由图2可知，啤酒酵母工程菌的双乙酰合成量明显低于未转化的受体菌，由题意可知，ILV2基因是编码双乙酰合成中的关键酶，如果转化的啤酒酵母工程菌的ILV2基因被破坏，就不能编码双乙酰合成中的关键酶，从而使工程菌的双乙酰合成量降低。 35．（2025·河北邯郸·一模）逆转录转座子是真核生物基因组中最丰富的一类可移动基因元件。逆转录转座子经过转录和逆转录后可整合进基因组中达到复制自身的目的，且插入基因组中时表现出精细的插入位点特异性。某研究团队为了研究4.5SRNA逆转录转座子的生物学作用，对4.5SRNA逆转录转座子DNA进行了克隆，部分过程如图1所示。回答下列问题： (1)获取鼠肝细胞总RNA时，使用异硫氰酸胍法提取，从保护RNA完整性的角度推测，异硫氰酸胍的作用是 。过程①和②中需要使用的酶分别是 、 。 (2)过程②获得的DNA补平且磷酸化后形成平末端，电泳鉴定结果如图2所示，优先使用 酶将DNA与pGEM3Zf连接形成重组质粒pGEM3Zf—4.5S．将重组质粒导入大肠杆菌中进行克隆。从大肠杆菌中提取质粒，选择限制酶 和 进行双酶切，酶切产物经过电泳鉴定，出现大小为139bp的条带，说明克隆成功。 (3)将4.5SRNA逆转录转座子DNA接入表达载体的SV40启动子的上游后，脂质体转染法将表达载体导入小鼠骨髓瘤细胞NS—1、SP2/0和人乳腺癌细胞Bca61中，研究4.5SRNA逆转录转座子对荧光素酶基因表达的影响，结果如图3所示，说明 。 (4)请你提出逆转录转座子在基因工程中的应用前景，逆转录转座子可作为 （写出1点即可）。 【答案】(1) 抑制RNA酶的活性 逆转录酶 耐高温的DNA聚合酶 (2) T4DNA连接 EcoR I Hind Ⅲ (3)4.5SRNA逆转录转座子对荧光素酶基因表达的影响与正向接入或反向接入无关，但存在种属的特异性 (4)基因工程技术中的载体 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定 【详解】（1）从保护RNA完整性的角度推测，异硫氰酸胍的作用是抑制RNA酶的活性，因为RNA酶会降解RNA，抑制其活性可保护RNA不被分解。过程①是逆转录过程，需要逆转录酶，过程②是以单链DNA为模板合成双链DNA的过程，需要耐高温的DNA聚合酶。 （2）因为过程②获得的DNA补平且磷酸化后形成平末端，而T4DNA连接酶可连接平末端，所以优先使用T4DNA连接酶将DNA与pGEM3Zf连接形成重组质粒pGEM3Zf-4.5S。要鉴定克隆是否成功，需选择合适的限制酶进行双酶切。观察图1可知，质粒上EcoR I和Hind Ⅲ限制酶切位点之间的片段大小为51bp，结合图2可知，4.5SDNA片段大小为81bp，结合图1中重组质粒可以发现，4.5SDNA插入到了质粒上EcoR I和Sal Ⅰ限制酶切位点之间，若酶切产物经过电泳鉴定，出现大小为139bp的条带，说明选择的限制酶是EcoR I和Hind Ⅲ，表明克隆成功。 （3）观察图3，可以发现将4.5SRNA逆转录转座子DNA接入表达载体后，不论正向接入还是反向接入，基因在NS-1和SP2/0细胞中的活性对荧光素酶基因的表达量没有影响，但不同细胞中荧光素酶基因的表达量不同，说明4.5SRNA逆转录转座子对荧光素酶基因表达的影响与正向接入或反向接入无关，但存在种属的特异性。 （4）逆转录转座子可作为基因工程技术中的载体，因为它可以整合进基因组中，能够携带目的基因进入受体细胞。 36．（2025·河北保定·一模）由P基因编码的P蛋白是一种水通道蛋白，该蛋白在植物调节水分吸收方面发挥着 重要作用。科研人员利用基因工程技术培育出了高表达P蛋白的转基因玉米，图1表示P 基因片段和农杆菌的Ti质粒及几种限制酶的识别序列和切割位点。回答下列问题： (1)若b链为P基因转录的模板链，则扩增P 基因时，应选择的引物是 。构建基因 表达载体时，切割Ti质粒应选用的两种酶为 。 (2)用含重组 Ti质粒的农杆菌侵染玉米后，应在含 的培养基中进行筛选。科研人 员进一步用PCR 验证P基因是否成功导入玉米细胞，电泳结果如图2所示。其中①为 P 基因，作为阳性对照，②为阴性对照，③为检测结果，由此可验证 。 (3)为了验证玉米植株中是否成功表达出P 蛋白，可用 技术进行检测。 (4)侵染后的玉米外植体需要先进行脱分化，然后在含有 （填植物激素）的培养基上诱导生根和生芽。从遗传学的角度看，玉米外植体能形成完整植株的原因是 。 【答案】(1) 引物2和引物3 EcoR I和SpeI (2) 潮霉素 P基因成功导入了玉米细胞 (3)抗原一抗体杂交 (4) 生长素、细胞分裂素 玉米外植体细胞含有发育成完整个体的全部遗传信息 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸；转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 【详解】（1）启动子在基因的左边，b链为P基因转录的模板链，则b链的5'端在右边，3'端在左边；链的5'端在左边，3'端在右边。引物结合在模板链的3'端，所以选择的引物应该为引物2和引物3。 构建基因表达载体时，切割Ti质粒的其中一种限制酶不能选用XbaI，否则会切下终止子，故限制酶只能在EcoR I、SpeI及MunI中选择。MunI在T-DNA的边界序列以外，故应该选择EcoR I和PSeI。 （2）潮霉素抗性基因位于T-DNA内，用含重组Ti质粒的农杆菌侵染玉米后，应在含潮霉素的培养基中筛选出含P基因的玉米细胞。经过电泳图谱比较，③待测玉米细胞中有一条条带与①的阳性对照相同，说明P基因成功导入了玉米细胞。 （3）为了验证玉米植株中是否成功表达出P蛋白，常用抗原一抗体杂交技术进行检测。 （4）侵染后的玉米外植体需要先进行脱分化，然后在含有生长素和细胞分裂素等的培养基上诱导生根和生芽。从遗传学的角度看，玉米外植体能形成完整植株的原因是玉米外植体细胞含有发育成完整个体的全部遗传信息。 37．（2025·河北承德·一模）为解决猪肉中多不饱和脂肪酸（PUFAs）含量不足的问题，研究人员获取了控制PUFAs合成的两个必需酶基因fat2和fat1，并构建pCAG-fat1-fat2融合表达质粒（如图所示），该质粒全长15300 bp（碱基对），CMV启动子启动EGFP基因表达绿色荧光蛋白，CAG启动子启动融合基因fatl-fat2的表达，AflⅡ和DraⅢ为两种限制酶的酶切位点。科研人员将构建好的质粒导入猪胎儿成纤维细胞，并最终获得转fatl-fat2融合基因的转基因猪。请回答下列问题：    (1)启动子是 识别和结合的部位，其作用是 。图中的EGFP起到了 的作用，便于重组DNA分子的筛选。 (2)用DraⅢ酶切如图所示质粒时，可断裂 个磷酸二酯键，且酶切产物是 bp和1700 bp两个片段。 (3)科研人员通过 法将构建好的质粒导入猪胎儿成纤维细胞，可通过 等技术检测目的基因是否进入受体细胞，该技术的原理是 。 (4)将含目的基因的猪胎儿成纤维细胞的细胞核移入 中，通过 法使两细胞融合形成重构胚，并用特定方法激活重构胚，使其发育为转基因猪，该技术属于 （填“有性”或“无性”）繁殖技术。 【答案】(1) RNA聚合酶 驱动基因转录出Mrna 标记基因 (2) 4 13600 (3) 显微注射 PCR DNA半保留复制（和热变性） (4) 去核的卵母细胞 电融合 无性 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，其作用是驱动基因转录出mRNA。图中的EGFP基因控制合成绿色荧光蛋白，起到了标记基因的作用，便于重组DNA分子的筛选。 （2）图中的质粒中有2个DraⅢ酶切位点，因此用DraⅢ酶切图示质粒时，可断裂4个磷酸二酯键，且酶切产物是15300-1700=13600 bp和1700 bp两个片段。 （3）科研人员通过显微注射法将构建好的质粒导入猪胎儿成纤维细胞，可通过PCR等技术检测目的基因是否进入受体细胞，PCR技术的原理是DNA半保留复制（和热变性）。 （4）将含目的基因的猪胎儿成纤维细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，通过电融合法使两细胞融合形成重构胚，并用特定方法激活重构胚，使其发育为转基因猪，该技术属于无性繁殖技术，其涉及的技术手段有转基因技术和核移植技术。 38．（2025·山东青岛·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1中的vtg基因与图2中Luc基因载体连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 注：图1DNA片段不含有图2所示限制酶的识别序列 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶 切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1包含的碱基序列为5′ 3′。（写出已知的所有碱基序列） (2)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含 的培养基中，转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是 。 (3)Luc基因载体上有一段P2A序列，其功能如图所示，据此推测P2A的作用 。 (4)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子含区域1和区域2，为研究E蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1和区域2的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点位于Luc基因的上游，形成两种重组载体。将重组载体分别导入斑马鱼的 ，待发育成熟后，往水体中添加 进行检测。 【答案】(1) Bcl I和Hind Ⅲ 5'-TGATCAAACTAT-3' (2) 卡那霉素 vtg基因在肝脏中特异性表达 (3)有助于序列两侧的基因表达成独立的蛋白质 (4) 受精卵 雌激素和荧光素 【分析】基因工程的步骤： （1）提取目的基因：基因组文库中获取、cDNA文库中获取。 （2）目的基因与运载体结合：将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。 （3）将目的基因导入受体细胞：将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。 （4）目的基因的检测和表达。 【详解】（1）由图可知，限制酶BsrGI会破坏Luc，因此不能选择BsrGI，Luc基因载体上存在两个BamHI识别位点，因此不能选择BamHI，为防止目的基因和载体的自身环化和反向连接，因此需选用两种限制酶，即选择BelI、HindIII切割Luc基因载体可降低“空载”概率。根据启动子的位置和基因载体上限制酶的位置，因此需要在引物1上添加限制酶BelI识别序列，因此引物1包含的碱基序列为5′TGATCAAACTAT3′。 （2）Kanr为卡那霉素抗性基因做为标记基因，供重组DNA的鉴定和选择，因此为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含卡那霉素的培养基中；转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，说明vtg基因只在肝脏中特异性表达。 （3）由图可知2A肽的作用可使两侧基因形成完整蛋白，即P2A有助于序列两侧的基因表达成独立的蛋白质。 （4）可利用显微注射法将目的基因导入动物的受精卵中。由题意可知，在含有雌激素的污水中，转基因斑马鱼可发出荧光，因此可在斑马鱼发育成熟后，往水体中添加雌激素和荧光素检测是否发荧光。 39．（2025·广东湛江·一模）某种野兔的毛色黑色和灰色是一对相对性状，由E、e基因决定。该种野兔的尾巴长尾和短尾是另一对相对性状，由F、f基因决定。将若干纯合的黑色长尾野兔和灰色短尾野兔进行杂交，所得子一代均为黑色长尾野兔。将子一代分别作母本和父本，进行测交，所得后代的表型和数量如图所示。请回答下列问题：    (1)由实验结果推测，两对相对性状的遗传遵循 定律，判定依据是 。 (2)子一代作父本测交后代中黑色长尾野兔的基因型为 ，子一代分别作母本和父本测交结果不同的原因是 。子一代雌雄个体自由交配后代中灰色短尾野兔占比为 。 (3)野兔中染色体上毛色基因两侧MspⅠ限制酶切位点的分布存在如下两种形式。黑色野兔甲和黑色野兔乙经杂交得到子代灰色野兔丙和未知毛色的野兔丁，分别提取甲、乙、丙、丁个体的DNA，经MspⅠ酶切后进行电泳分离，结果如图所示：    乙个体分离出的19kbDNA片段上含有的毛色基因为 （填“E”或“e”），理由是 ，推测野兔丁为杂合子的概率为 。 (4)科学家将某种人类致病基因转入该种野兔中，模拟疾病的发生和发展过程，该实例说明转基因动物的应用有 。 【答案】(1) 自由组合 子一代作母本测交结果出现4种表型且比例为1:1:1:1 (2) EeFf 子一代黑色长尾野兔基因型为EeFf，作母本时产生雌配子种类和比例为EF：Ef：eF：ef=1：1：1：1，但作父本时产生雄配子种类和比例为EF：Ef：eF：ef=3：3：3：1（雄配子中ef 2/3致死），所以测交结果不同（合理即可） 1/40/0.025 (3) E 野兔丙为灰色，基因型为ee，两个e分别来自甲和乙的23kb片段，甲、乙基因型为Ee，则乙的19kb片段中含有E基因 1/2/0.5 (4)作为模式动物，为研究某种人类疾病的致病机制和开发治疗药物提供依据（合理即可） 【分析】自由组合定律的实质是：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或组合是互不干扰的；在减数分裂形成配子的过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合。 【详解】（1）根据亲本纯合的黑色长尾野兔和灰色短尾野兔进行杂交，所得子一代均为黑色长尾野兔且子一代作母本测交结果出现4种表型且比例为1：1：1：1，判定控制两对相对性状的基因可以自由组合，符合自由组合定律。 （2）子一代基因型为EeFf，作母本时产生的雌配子种类和比例为EF：Ef：eF：ef=1：1：1：1，作父本时产生的雄配子种类和比例为EF：Ef：eF：ef=3：3：3：1（雄配子中ef有2/3致死），所以子一代作父本测交后代黑色长尾野兔的基因型为EeFf，因为子一代产生雌雄配子的比例不同所以分别作母本和父本测交结果不同，自由交配后代中灰色短尾eeff占1/10×1/4=1/40。 （3）野兔甲体内含有两条23kb的DNA条带，一条含有E基因，一条含有e基因；野兔丙体内含有两条23kb的DNA条带，都是e基因；一条来自甲，一条来自乙；乙、丁体内含有一条23kb的DNA条带，一条19kb的DNA条带。由此可知，野兔乙体内含有的23kb的DNA条带一定含有e基因，则19kb的DNA条带就含有E基因。野兔丁体内含有的19kb的DNA条带来自野兔乙，就含有E基因，23kb的DNA条带来自野兔甲，所以可能含有e基因，也可能含有E基因，所以野兔丁可为显性纯合子或杂合子，概率各为1/2。 （4）模式动物是标准化的实验动物，指经过人工培育，遗传背景清楚，能相对稳定显现需要研究的生理或病理特征的动物。科学家将某种人类疾病基因转入该种野兔中，模拟疾病的发生和发展过程，该实例说明转基因动物可以作为模式动物，为研究某种人类疾病的致病机制和开发治疗药物提供依据。 40．（2025·宁夏石嘴山·一模）亚洲玉米螟、黏虫是造成我国玉米减产的主要害虫。我国科研人员通过图示过程将Bt基因（能够控制合成Bt毒蛋白）转入玉米细胞培育出了抗虫转基因玉米。回答下列问题： (1)用PCR扩增下面的Bt基因的DNA片段：5'-GACCTGTGGAAGC．.....CATACGGGATTG-3' 3'-CTGGACACCTTCG......GTATGCCCTAAC-5'供选择的引物有：①5'-GACCTGTGGAAGC-3'  ②5'-CTGGACACCTTCG-3'  ③5'-GTTAGGCATAC-3'④5'-CAATCCCGTATG-3'共四种，应选择________（填字母）。 A．①② B．②③ C．③④ D．①④ (2)据图分析，为确保目的基因能够与Ti质粒正确连接，形成含有目的基因的重组Ti质粒，科研人员应选用限制酶 切割Ti质粒和含Bt基因的DNA片段。在获得重组Ti质粒后，可将其加入经 处理的农杆菌；导入重组质粒的玉米细胞经 成为转基因玉米植株。    (3)为检测转基因玉米是否培育成功，科研人员首先利用 法检测Bt基因是否成功翻译：在进行个体生物学水平的鉴定时，科研人员将获得的多株转基因玉米进行自交，发现除少数植株的子代均抗虫外，多数植株的子代中均出现了不抗虫植株，统计这些植株的子代中抗虫与不抗虫的比例，发现有3:1和15:1两种情况。出现15:1的原因是 。 (4)某科研小组在做抗虫棉试验时，虽已经检测出棉花植株中含有抗虫基因，但让棉铃虫食用棉花叶片时，棉铃虫并没有被杀死，这说明 ，为此，科学家对棉花植株中的Bt毒蛋白基因进行了修饰，结果食用了棉叶的棉铃虫中毒死亡了，从变异类型分析，这种对Bt毒蛋白基因的修饰属于 。 【答案】(1)D (2) XbaⅠ和HindⅢ Ca2+ 植物组织培养 (3) 抗原-抗体杂交 在两对同源染色体的各一条染色体上转入了抗虫基因 (4) Bt毒蛋白基因没有成功表达 基因重组 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。目的基因的检测与鉴定包括分子水平上的检测与个体水平上的鉴定两种方式。 【详解】（1）PCR引物应分别与待扩增片段两端的互补链3′端结合，且引物序列与其结合处应保持“正向一致”。Bt基因的DNA片段的上链(5′→3′)是GACCTGTGGAAGC…CATACGGGATTG，对应的下链(3′→5′)是CTGGACACCTTCG…GTATGCCCTAAC。前向引物通常与上链5′端相同序列（①），后向引物则与上链3′端互补且方向为5′→3′（④），应选①和④。 故选D。 （2） 据图分析，在构建目的基因表达载体外，由于BamHⅠ能将目的基因切割，因此不能用BamHⅠ切割，因此对于目的基因的左侧只能用XbaⅠ切割，而右侧HindⅢ和EcoRⅠ是目的基因和终止子近侧共有的限制酶，但目的基因的左侧有EcoRⅠ的识别序列，因此目的基因右侧需要用HindⅢ切割，因此，为确保目的基因能够与Ti质粒正确连接，形成含有目的基因的重组Ti质粒，科研人员应选用限制酶XbaⅠ和HindⅢ切割Ti质粒和含Bt基因的DNA片段；在获得重组Ti质粒后，可将其加入经Ca2+处理（使其处于易于吸收周围环境DNA分子的状态）的农杆菌；导入重组质粒的玉米细胞经植物组织培养成为转基因玉米植株，该操作的原理是植物细胞的全能性。 （3）翻译的产物是蛋白质，由于抗原与抗体的结合具有特异性，故为检测转基因玉米是否培育成功，可在分子水平条件下，科研人员首先利用抗原—抗体杂交法检测Bt基因是否成功翻译；在进行个体生物学水平的鉴定时，科研人员将获得的多株转基因玉米进行自交，发现除少数植株的子代均抗虫外，多数植株的子代中均出现了不抗虫植株，统计这些植株的子代中抗虫与不抗虫的比例，发现有3∶1和15∶1两种情况。其中15∶1为9∶3∶3∶1的变式，说明目的基因转入了两条具有非同源染色体的两条染色体上，即在两对同源染色体的各一条染色体上转入了抗虫基因，进而通过自交产生了性状分离比为15∶1的后代表现。 （4） 科学家最初做抗虫棉试验时，虽已经检测出棉花植株中含有抗虫基因，但让棉铃虫食用棉花叶片时，棉铃虫并没有被杀死，这说明Bt毒蛋白基因没有成功表达；为此，科学家对棉植株中的Bt毒蛋白基因进行了修饰，结果食用了棉叶的棉铃虫中毒死亡了，从变异类型分析，这种对Bt毒蛋白基因的修饰是蛋白质工程的应用，是第二代基因工程，其原理是基因重组。 41．（2025·广东湛江·一模）柑橘树生长过程中易受某种革兰氏阴性菌感染，严重危害柑橘产量。科研人员将M基因转入柑橘中，该基因控制合成的酶可抑制该种革兰氏阴性菌的生长与繁殖。如图是培育转基因柑橘的过程示意图，已知限制酶HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ的识别序列及切割位点分别为5'-A↓AGCTT-3′、5′-G↓GATCC-3′、5-G↓TCGAC-3'。请回答下列问题：    (1)构建的基因表达载体，除了含有目的基因外，还必须含有 （回答2点）等。据图分析，在基因表达载体构建过程中，应使用 对M基因和质粒进行切割，原因是 。 (2)利用PCR技术克隆M基因时，应选择下图中的引物 （填序号），引物的作用是 。    (3)将图中农杆菌先后置于含 的培养基中培养，从而筛选出含重组质粒的农杆菌。为检测转基因柑橘幼苗是否可以抵抗革兰氏阴性菌的感染，在个体生物学水平上，操作方法是 。 (4)图中由柑橘细胞培育成转基因柑橘幼苗采用了 技术，该技术的原理是 ，由柑橘细胞获得愈伤组织的过程称为 。 【答案】(1) 标记基因、启动子、终止子、复制原点 SalⅠ和HindⅢ 切割后的目的基因完整，和质粒具有相同的黏性末端可以连接且可以防止目的基因和质粒自身环化 (2) 2和3 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (3) 氨苄青霉素、四环素 对柑橘幼苗接种该种革兰氏阴性菌，观察幼苗生长情况 (4) 植物组织培养 植物细胞的全能性 脱分化 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）基因表达载体必须包括目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等；据图分析，用限制酶BamHⅠ会破坏M基因，因此应使用SalⅠ和HindⅢ对M基因和质粒进行切割；因为目的基因和质粒用的是相同的两种限制酶切割，所以具有相同的黏性末端可以连接在一起构成重组质粒且使用两种限制酶切割可以防止目的基因和载体自身环化。 （2）根据子链延伸方向为5'→3'，引物需要与模版的3'端结合，可判断出扩增M基因应选择引物2和引物3；引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 （3）用限制酶SalⅠ和HindⅢ对质粒进行切割时，破坏了抗四环素基因，在重组质粒上只有抗氨苄青霉素基因，因此应先将农杆菌置于含氨苄青霉素的培养基中培养，此时导入空质粒和重组质粒的农杆菌均可存活，再将存活的农杆菌接种于含四环素的培养基中，此时导入重组质粒的农杆菌由于没有四环素抗性而死亡，从原来含氨苄青霉素的培养基中原位置可筛选出含重组质粒的农杆菌；在个体生物学水平上，通过对柑橘幼苗接种该种革兰氏阴性菌，观察幼苗生长情况，可以检测转基因柑橘幼苗是否可以抵抗革兰氏阴性菌的感染。 （4）由柑橘细胞培育成转基因柑橘幼苗采用了植物组织培养技术，该技术的原理是植物细胞的全能性，其中由柑橘细胞获得愈伤组织的过程称为脱分化。 42．（2025·广东深圳·一模）在植物基因组中天然存在着一类自私的基因或遗传元件，能够使得自身传递给后代的比例大大提高，被称为基因驱动元件。受天然基因驱动元件的启发，我国研究团队开发了一种名为CAIN的基因驱动系统，如图。 CRISPR/ Cas9能够靶向切割NPG1基因的编辑工具；NPG1表示花粉萌发所必需的基因 回答下列问题： (1)CRISPR/Cas9由人工合成的短链RNA和一种来自细菌的核酸酶Cas9。短链RNA作为“向导”；核酸酶Cas9切割目的DNA，使DNA双链断裂。短链RNA作为“导向”作用的具体原理是 。 (2)CAIN系统基于“毒药—解药”机制，据图分析，通过 的作用在植物花粉中产生毒药效应；再以 作为解药，让花粉正常萌发。图中重新编码后的NPG1需要具备的条件是 ，为实现这一目的，研究人员利用了密码子的 现象对NPGI进行重新编码，最终实现了 的花粉能够正常萌发。 (3)研究人员选用了自交繁殖的拟南芥作为材料，研究结果如下图。 ①若是双剪切，基因驱动工具CAIN系统在人工杂交世代中表现出了显著的高效遗传，理论上后代带有CAIN个体为100%，远高于孟德尔遗传的期望比例 。 ②若是单剪切，如下图所示，则可以产生 种雄配子，理论上后代带有CAIN个体的比例为 。 【答案】(1)部分序列通过碱基互补配对原则，与目的基因中希望被编辑的DNA序列相结合 (2) CRISPR/Cas9 重新编码的NPG1 使花粉重新萌发且不受CRISPR/Cas9切割 简并性 携带CAIN系统 (3) 50% 3 67%/2/3/66.7% 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。 4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR检测等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR检测等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）短链RNA作为“导向”作用是部分序列通过碱基互补配对原则，与目的基因中希望被编辑的DNA序列相结合。 （2）CRISPR/Cas9是能够靶向切割NPG1基因的编辑工具，NPG1表示花粉萌发所必需的基因，CAIN系统是通过CRISPR/Cas9的作用将NPG1基因切除，从而在植物花粉中产生毒药效应。CAIN系统可以编辑NPG1基因，该基因是花粉形成必需的基因，再将重新编辑的NPG1基因导入到细胞中，重新编辑后的NPG1需要具备的条件是使花粉重新萌发且不受CRISPR/Cas9切割；重新编辑后的NPG1基因功能是一样的，碱基序列上有差异，主要是利用同义编辑，也就是利用密码子的简并性，最后使携带CAIN系统可以形成成熟花粉，即实现了携带CAIN系统的花粉能够正常萌发。 （3）①若是如图中CAIN系统导入到一条染色体上，这样与野生型杂交后代，只有50%个体后代携带CAIN系统； ②若是单剪切则可以产生3种类型花粉，其中有一种不可育（无法形成），带有CAIN系统的花粉是两种，所以后代有该系统的占了2/3，约为67%。 43．（2025·广西·一模）塑料的主要成分为聚氯乙烯（PVC）、聚乙烯（PE）和聚丙烯（PP）等，会造成难以降解的“白色污染”。自然界有多种细菌可以降解塑料的不同成分，研究人员欲通过筛选，并利用基因工程技术培育能降解多种塑料成分的“超级菌”。 (1)研究人员欲比较大肠杆菌YT1和芽孢杆菌YP1两类细菌降解PE塑料的能力，配置固体培养基，接种菌株后表层覆盖0.1 mm厚的PE塑料。分组实验结果如表所示： 培养基及接种菌株 培养基1 培养基2 培养基3 单独培养并接种YT1 单独培养并接种YP1 提取YT1和YP1的核酸，并与YT1和YP1混合，培养一段时间后选取YP1接种 降解圈（直径D/mm） 3.5 1.8 4.2 ①筛选能分解PE塑料的菌株时，应将菌株接种到以 为唯一碳源的培养基，从功能上讲，属于 培养基。 ②培养基3中接种混合培养后的YP1，其降解圈直径明显加大，其原因可能是 。 (2)研究人员发现一种胞外酶基因A，有降解PVC塑料的功能。对A基因测序可知，其调节功能区增加一个碱基对A/T，可增强其表达能力。通过PCR定点诱变技术在体外改造A基因（如图1），然后构建表达载体（如图2），导入受体菌培育“超级菌”。 注：LacZ基因编码产生的酶能分解β-半乳糖苷，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色 ①图1所示，大引物②是指以 （选填“引物1”或“诱变引物”）延伸得到的DNA链为模板， （选填“引物1”或“诱变引物”）与之结合延伸得到的DNA子链。获得图1中的改良A基因至少需要 个PCR循环。 ②图2中要实现质粒和改良A基因的正确连接，应选用的限制酶是 。将构建的表达载体导入受体菌后，在含氨苄青霉素和β-半乳糖苷的平板上培养，长出的 （选填“蓝色”或“白色”）菌落是成功导入重组质粒的菌株，依据是 。 【答案】(1) PE/聚乙烯 选择 混合培养过程中发生了转化，YT1的对PE塑料分解能力更高的基因整合到了YP1菌株中 (2) 诱变引物 引物1 4/四 XmaI和BgIⅡ 白色 含有改良基因A的重组质粒上LacZ基因被破坏，受体菌不能产生相应的酶，无法分解β-半乳糖苷，不能产生蓝色物质 【分析】1、PCR技术的原理是模拟生物体内DNA分子复制的过程，利用DNA分子热变性原理，通过控制温度控制控制DNA分子的解聚和结合，过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 2、基因工程技术的基本步骤：(1) 目的基因的筛选和获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。(2) 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子.终止子和标记基因等。(3) 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4) 目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因：DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA：分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原抗体杂交技术。个体水平上的鉴定:抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）①在筛选分解PE塑料能力大小的菌株时，应将两类菌株接种到以PE塑料为唯一碳源的培养基，不能分解PE塑料的细菌，因为缺少营养物质碳源死亡；该培养基属筛选出能分解PE塑料类的细菌，所以从功能上讲属于选择培养基。 ②原本YP1对PE塑料的分解能力弱于YT1，而培养基3中接种混合培养后的YP1，其降解圈直径明显加大，其原因可能是YP1菌株整合了YT1的对PE塑料高分解力的基因，发生了转化。 （2）①观察图1，根据大引物的方向，PCR1大引物②是指以引物1延伸得到的DNA链为模板，诱变引物与之结合延伸得到的DNA子链；经过PCR1得到大引物需要2次PCR，再利用大引物和引物2至少2个PCR循环才能获得完整的改良A基因，共需经过4次PCR。 ②构建改良基因表达载体时，为实现质粒和改良基因的准确连接，应选用的限制酶是XmaⅠ和BglⅡ，酶切位点在目的基因两侧，且在质粒中这两个酶切位点在启动子和终止子之间，不破坏氨苄青霉素抗性基因，复制原点等重要原件，两种限制酶，形成的黏性末端不同，所以不会出现目的基因和质粒的自我环化以及目的基因的反向连接；在含氨苄青霉素和β半乳糖苷的平板上培养一段时间后，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是含有改良基因A的重组质粒不含有完整的LacZ基因，受体菌不能分泌分解β-半乳糖苷而使培养基变蓝的酶。 44．（2025·江西赣州·一模）二化螟的幼虫主要危害水稻的叶和茎，转Bt基因水稻能一定程度抵抗二化螟的侵害。科研人员构建了GAL4/UAS基因调控系统的转基因水稻，过程如图1所示：GAL4/UAS系统调控基因表达的机理如图2所示：UAS序列可抑制靶基因表达，GAL4蛋白是一种转录活性因子，可特异性地识别并结合UAS序列，激活UAS下游基因的转录。    (1)图1中①②操作过程涉及到的酶有 。③④过程除了要进行目的基因的检测和鉴定外，还需要进行 才能将细胞培养成转基因个体。 (2)现已获得crylC基因、Bt基因和绿色荧光蛋白GFP基因，crylC基因能促进Bt基因的表达。若要以GFP基因为标记基因筛选受体细胞，在构建UAS-靶基因表达载体时，应将crylC、Bt、GFP三个基因插入到图3（Ti质粒的T-DNA片段示意图）中的位置分别是 （用序号①②③作答）。    (3)将GAL4转基因个体与UAS-Bt转基因个体杂交得，中出现了抗虫植株，其表现抗虫性状的原因是 。利用中抗虫个体自交得，若中表型及其比例为 ，则GAL4基因和Bt基因插入同一对同源染色体上；若中表型及其比例为 ，则GAL4基因和Bt基因插入两对同源染色体上（假设插入的基因均有效，个体的存活率相等）。 (4)采用在水稻叶片和茎鞘中特异性表达的GAL4基因的启动子，构建表达载体，得到转基因抗虫水稻，在食品安全方面的意义是 。 【答案】(1) 限制酶、DNA连接酶 植物组织培养 (2)②③① (3) F1同时含有GAL4基因和 UAS-Bt基因，GAL4基因表达产生的GAL4蛋白与UAS结合激活Bt基因的表达 抗虫：不抗虫=1：1 抗虫：不抗虫=9：7 (4)利用GAL/UAS调控系统，使目的基因只在特定部位表达，而在人食用的部位不表达 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1） 图1中①②操作过程为将目的基因导入受体细胞，该过程涉及的酶有限制酶和DNA连接酶（用于切割和连接目的基因与载体，构建基因表达载体）。③④过程除了要进行目的基因的检测和鉴定外还需要进行植物组织培养（原理为植物细胞的全能性）才能将细胞培养成转基因个体。 （2）结合题干，若要以GFP基因为标记基因筛选受体细胞，通过特异性启动子-GALA调控UAS-靶基因的表达，且crylC基因能促进Bt基因的表达，结合图3，①处应该插入标记基因（GFP基因），②③处插入cry1C、Bt基因，即应将cry1C、Bt、GFP三个基因插入到图3所示T-DNA中的位置分别是②③①。 （3） 结合题干“转Bt基因水稻能一定程度抵抗二化螟的侵害，cryIC基因能促进Bt基因的表达”，推知将GAL4转基因个体与UAS-Bt转基因个体杂交得F1，F1全表现为抗虫，F1自交得F2，F1植株表现抗虫性状的原因是F1同时含有GAL4基因和 UAS-Bt基因，GAL4基因表达产生的GAL4蛋白与UAS结合激活Bt基因的表达。若GAL4基因（表示为G）和Bt基因（表示为B）插入一对同源染色体上，遵循基因的分离定律，F1为GB，F1自交得到1GG（不抗虫）、2GB（抗虫）、1BB（不抗虫），即F2中表型及其比例为抗虫：不抗虫=1：1；若GAL4基因（表示为G）和Bt基因（表示为B）插入两对同源染色体上，遵循基因的自由组合定律，F1基因型为GOBO，F1自交得到9GB ，其余7份要么只含有G或B或均不含，都表现为不抗虫，即F2中表型及其比例为抗虫：不抗虫=9：7。 （4）结合题干信息，启动子具有特异性，构建GAL4基因表达载体时采用叶片和茎鞘中特异性表达基因的启动子，可使靶基因只在植株叶片和茎鞘中表达，故该技术在提高食品安全方面可能存在一定的意义，具体表现为利用GAL/UAS调控系统，使目的基因只在特定部位表达，而在人食用的部位不表达。 45．（2025·天津武清·一模）非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染家猪和野猪引起的一种高致病性传染病。科研人员在病毒ASFV的K基因（大小为790bp）中间插入荧光素酶基因（Gluc基因）和增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP基因），从而构建可以进行快速观察及定量检测酶活性的重组病毒（ASFV-Gluc-EGFP）体系，如图1所示。回答下列问题：    (1)构建出图1所示的融合基因，需要借助的工具酶有 。Gluc基因和EGFP基因有助于重组病毒的筛选，起到基因表达载体中 （填结构）的作用。 (2)为了初步鉴定重组病毒是否构建成功，科研人员提取相应病毒的DNA，选用图1中的一对引物 进行PCR扩增，扩增结果有1、2两种类型，如图2所示。该实验结果表明Gluc基因和EGFP基因 （填“有”或“没有”）插入病毒ASFV的K基因. (3)若要验证重组病毒中Gluc基因和EGFP基因是否成功表达，科研人员可将猪肺泡巨噬细胞（PAMS）培养一段时间后，平均分成A、B两组，其中A组接种病毒ASFV，B组接种 ，过一段时间后检测两组是否发出绿色荧光及 。 (4)同时科研人员又分别测定了A、B两组的病毒数量变化，发现两者无显著差异，该结果表明 。因此，该重组病毒体系的构建可为后续研究ASFV的致病机制及药物治疗奠定基础。 【答案】(1) 限制酶（HindIII和BamHI）和DNA连接酶 标记基因 (2) 引物1和引物4 有 (3) 重组病毒 荧光素酶活性 (4)Gluc基因和EGFP基因的插入不影响病毒的复制或繁殖或生命活动 【分析】基因工程表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 【详解】（1）构建融合基因时，需要使用限制酶切割目的基因和载体，使其产生相同的黏性末端或平末端，再用DNA连接酶将目的基因和载体连接起来，所以构建图1所示的融合基因，需要借助的工具酶有限制酶和DNA连接酶。 标记基因可以用来筛选含有重组载体的细胞，Gluc基因和EGFP基因有助于重组病毒的筛选，起到基因表达载体中标记基因的作用。 （2）为了鉴定重组病毒是否构建成功，需要扩增出包含插入基因的片段，应选用引物1和引物4进行PCR扩增。 从图2中可以看出，病毒ASFV的PCR产物长度为790bp，重组病毒的PCR产物长度为1758bp，说明重组病毒的片段长度增加，表明Gluc基因和EGFP基因有插入病毒ASFV的K基因。 （3）若要验证重组病毒中Gluc基因和EGFP基因是否成功表达，A组接种病毒ASFV作为对照，B组应接种重组病毒（ASFV-Gluc-EGFP）。 由于Gluc基因表达的荧光素酶可催化荧光素发光，EGFP基因表达增强型绿色荧光蛋白可发出绿色荧光，所以过一段时间后检测两组是否发出绿色荧光及荧光素酶活性。 （4）科研人员测定A、B两组的病毒数量变化，发现两者无显著差异，该结果表明插入的Gluc基因和EGFP基因不影响病毒的增殖。 46．（2025·福建龙岩·一模）科研人员采用重叠延伸PCR技术，成功构建了突变的IKBA基因（以下称IKBAm），使IKBA蛋白中第32、36位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸，阻断了IKBA蛋白的磷酸化，IKBA蛋白磷酸化与哺乳动物组织中广泛存在的某种转录因子的功能有关。该技术采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，获得定点突变的新基因，原理如图，回答下列问题： (1)利用重叠延伸PCR技术诱变IKBA基因时，将预期的突变碱基设计在PCR的引物3和引物4中，分别进行PCR体系1和PCR体系2的扩增。PCR体系1中加入的引物是 。PCR体系1和PCR体系2必须分开进行的原因是 。 (2)将PCR体系1、2的产物（图中a、b和c、d）混合后，继续进行下一次PCR反应。在该PCR反应体系中经过高温变性后，当温度下降到55℃，能够互补配对的DNA链相互结合，理论上有 种结合的可能，其中能进行进一步延伸的是 组合的DNA片段。 (3)质粒A上有限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ的识别序列，为将IKBAm与质粒A正确连接，在设计IKBAm的扩增引物时，需在引物 的端分别添加相应的限制酶的识别序列。下表为重叠延伸PCR引物序列表，引物3的①位置上有关的碱基序列是 （填写出6个碱基）。 名称 引物序列 备注 引物1 GATCGGATCCCGTTCCAGGCGGCCGAGCGCCCCCA BamH I的识别序列： G↓GATCC 引物2 TCCTGAATTCTCATAACGTCAGACGCTGGCC EcoR I的识别序列： G↓AATTC 引物3 ①_____TTCATGGCGTCCAGGCCGGCGTCGTGGCG 引物4 CGCCACGAC……ATGAAAGACGA “…”表示省略的碱基 (4)已知IKBA基因的部分序列为： 数字94、95、96、106表示碱基位置，丙氨酸的密码子：GCU、GCC、GCA、GCG，则突变引物4中省略的碱基是 （选填①、②、③、④）。 ①AGC、GGC、CTG、GAC、GCC ②UCG、GGC、CTG、GAC、ACC ③GCC、GGC、CTG、GAC、GCC ④TCG、CCG、GAC、CTG、AGG 【答案】(1) 引物1和引物3 引物3和引物4存在碱基互补配对片段，置于同一反应体系会导致引物失效（或若将两个体系混合扩增，引物1和引物2同时存在，会扩增出IKBA基因） (2) 4 a和d (3) 1和2 TCGTCT (4)③ 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】（1）为了获得定点突变的新基因，采用PCR扩增时需要改变引物的部分碱基，引物是与目的基因复制起始端互补配对的单链DNA，结合图示和题干信息分析，PCR体系1需要引物1和引物3，PCR体系2需要引物2和引物4。引物3和DNA一条链互补配对，引物4和DNA对应部位的另一条链互补配对，即引物3和引物4碱基互补配对，若PCR体系1和PCR体系2混合进行，两种引物结合形成双链，引物失效则无法高效的进行PCR扩增，因此必须分开进行扩增。 （2）由于引物3和引物4碱基序列互补配对，PCR扩增产物经过高温变性后会形成a、b、c、d四种单链，当温度下降到55℃，能够互补配对的DNA链相互结合，a和b结合，a和d结合，b和c结合，c和d结合，共四种结合方式。 a和b结合以及c和d结合没有突出的单链部分，不能延伸，b和c结合有突出的单链部分，但是DNA延伸方向必须是从自身的5'→3'，b和c结合也不能延伸，能进行进一步延伸的是a和d组合的DNA片段。 （3）由于引物3和引物4是和目的基因的中间碱基序列互补配对的，要将目的基因和质粒连接形成重组的DNA分子，则需要在目的基因的两端增加限制酶识别序列，因此需要在引物1和2的端分别添加相应的限制酶的识别序列。由于引物3和4是碱基互补配对的，引物4的3'的前6个碱基是AGCAGA，则引物引物3的①位置上有关的碱基序列是TCGTCT。 （4）结合引物4的已知序列和IKBA基因的部分序列可知，引物4的碱基序列和图示中的IKBA基因的单链部分序列基本相同（除突变位点外），已知第32位氨基酸需要时丙氨酸，根据丙氨酸对应的密码子分析，94、95、96对应的碱基是GCC，96和106号碱基之间的序列和图示相同，为GGCCTGGAC，第36为氨基酸也需要是丙氨酸，因此TCC改变为GCC，综合分析，突变引物4中省略的碱基是③GCC、GGC、CTG、GAC、GCC。 47．（2025·福建龙岩·一模）油菜花是两性花，其雄蕊的育性由位于同源染色体相同位置上的3个基因（、、）决定。研究人员为培育具有杂种优势的油菜新品种，利用品系1（，雄性不育）、品系2（，育性正常）、品系3（，育性正常），进行如下实验： 实验一：将品系1与品系2杂交，均为雄性不育植株，将与亲本回交获得； 实验二：将品系1与品系3杂交，均育性正常，将与品系1回交获得． (1)上述杂交实验中，在授粉前必须对品系1采取的操作是 。 (2)若、、基因中碱基数目不同，原因是基因突变时发生了 。根据杂交一、二的结果判断、、之间的显隐性关系是 。 (3)SNP是指基因组中由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性。当SNP位点与某基因非常接近时，它们在后代中往往保持连锁状态，使得SNP可以作为特定基因的遗传标记。研究人员提取实验一中亲本、、若干植株DNA，利用PCR扩增不同样本的SNP遗传标记，电泳结果如下图：    ①染色体互换通常发生在 时期，其引起的变异属于 。 ②据图推测， 序列与雄性不育基因紧密连锁，可作为雄性不育基因的分子标记，理由是 。 ③为进一步验证上述结论，研究人员提取实验二中亲本、、各植株DNA，并将表现型一致的植株DNA混合，利用PCR扩增不同样本的SNP遗传标记，请在下图画出支持上述结论的电泳结果 。    【答案】(1)套袋 (2) 碱基对的增添、缺失 对、为显性，对为显性 (3) 减数第一次分裂前期（减数分裂Ⅰ前期） 基因重组 SNPe 不育植株均检测出SNPe序列    【分析】基因的分离定律的实质是：在杂合子的细胞中，位于一 对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性；在减数分 裂形成配子的过程中，等位基因会随同源染色体的分开而分 离，分别进入两个配子中，独立地随配子遗传给后代。 基因的自由组合定律的实质是：位于非同源染色体上 的非等位基因的分离或组合是互不干扰的；在减数分裂过 程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源 染色体上的非等位基因自由组合。 【详解】（1）两性花的杂交实验步骤是母本去雄（人工去雄）➡套袋➡人工授粉➡套袋；上述杂交实验中，在授粉前必须对品系1采取的操作是套袋。 （2）DNA分子中发生碱基的替换、增添或缺失，而引起的基因碱基序列的改变，叫作基因突变；若、、基因中碱基数目不同，原因是基因突变时发生了碱基对的增添、缺失；根据杂交一、二的结果判断、、之间的显隐性关系是对、为显性，对为显性。 （3）①在减 数第一次分裂前期过程中，同源染色体两两配对的现象叫作联会，联会后的每对 同源染色体含有四条染色单体，叫作四分体。四分体中的非姐 妹染色单体之间经常发生缠绕，并交换相应的片段，可见染色体互换通常发生在减数第一次分裂前期（减数分裂Ⅰ前期），其引起的变异属于基因重组。 ②据图推测，F1雄性不育植株样本均检测出SNPe序列，可见SNPe序列与雄性不育基因紧密连锁。 ③进一步验证上述结论，研究人员提取实验二中亲本、、各植株DNA，并将表现型一致的植株DNA混合，利用PCR扩增不同样本的SNP遗传标记，电泳结果如下图所示，表明了SNPe序列与雄性不育基因紧密连锁：    48．（2025·天津河东·一模）植物为了适应干旱胁迫，在长期的进化过程中形成了从分子到表型的一系列复杂的抗旱调控机制，其中沉积于植物表面的外角质层蜡质是防止水分散失、减轻干旱胁迫危害的重要屏障。明确角质层蜡质调控关键基因，解析蜡质形成机理，能够为抗旱作物新品种培育提供基因资源和理论依据。科研人员通过EMS诱变获得一个大麦突变体Cer1（纯合体），其颖壳蜡质合成有缺陷（本题假设完全无蜡质）。初步研究表明，突变表型是因为C基因突变为c，使棕榈酸转化为16-羟基棕榈酸受阻所致（本题假设完全阻断），符合孟德尔遗传规律，回答下列问题。 (1)在C基因两侧设计引物，PCR扩增，电泳检测PCR产物。如图泳道1和2分别是突变体Cer1与野生型（WT，纯合体）。据图判断，C基因突变成c基因的原因是 。 (2)将突变体Cer1与纯合野生型杂交，全为野生型，与突变体Cer1杂交，获得若干个后代，利用上述引物PCR扩增这些后代的基因组DNA，电泳检测PCR产物，可以分别得到与如图泳道 和泳道 （从1~5中选择）中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为 。 (3)进一步研究意外发现，16-羟基棕榈酸合成蜡质过程中必需的D基因（位于另一条染色体上）也发生了突变，产生了基因，其编码多肽链的DNA序列中有1个碱基由G变为T，但氨基酸序列没有发生变化，原因是 。 (4)假设诱变过程中突变体Cer1中的D基因发生了使其丧失功能的突变，产生基因。CCDD与个体杂交，的表型为野生型，自交，野生型与突变型的比例为 ；完善以下表格： 部分个体基因型 棕榈酸 16-羟基棕榈酸 颖壳蜡质 有 ① 无 有 有 ② 【答案】(1)碱基对的缺失 (2) 3 1 1：1 (3)密码子具有简并性 (4) 9：7 有 有 【分析】基因分离定律的实质：在杂合的细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性；减数分裂形成配子的过程中，等位基因会随同源染色体的分开而分离，分别进入两个配子中，独立地随配子遗传给子代。 【详解】（1）由图可知，泳道1是突变体Cer1（纯合体），泳道2是野生型（WT，纯合体），c基因比C基因长度变短，说明C基因突变成c基因的原因是碱基对的缺失。 （2）突变体Cer1为cc（1100kb），纯合野生型为CC（1960kb），则F1为Cc（1100kb、1960kb），F1与突变体Cer1杂交后代中Cc：cc=1：1，电泳检测PCR产物，可以分别得到与如图泳道3和泳道1中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为1：1。 （3）编码多肽链的DNA序列中有1个碱基由G变为T，即发生了碱基对的替换，但氨基酸序列没有发生变化，原因可能是密码子具有简并性。 （4）由题意可知，C/c、D/d2基因遵循基因的自由组合定律，因此CCDD与ccd2d2个体杂交，F1为CcDd2，表型为野生型，F1（CcDd2）自交，F2野生型与突变型的比例为C_D_：（ccD_+C_d2d2+ccd2d2）=9：7。Ccd2d2含有C基因无D基因，有16-羟基棕榈酸，由于不含D基因，因为16-羟基棕榈酸合成蜡质过程中必需有D基因，故无颖壳蜡质；CCDd2含有C基因和D基因，有16-羟基棕榈酸，也有颖壳蜡质。 49．（2025·天津河东·一模）温度是影响微生物生长的重要因素，科研人员应用基因工程以实现通过温度控制工程菌合成所需物质。 (1)大肠杆菌是一种常见的微生物，常被改造为基因工程菌，其原因包括 （写出2点）。 (2)为实现温度控制蛋白质合成，科研人员设计了方案1，构建表达载体（见图1），将其导入大肠杆菌，获得转基因工程菌。大肠杆菌在30℃和37℃均可生长和繁殖，当培养温度为30℃时，C基因编码的C蛋白形成二聚体， ，因而大肠杆菌表达 荧光蛋白。    (3)为更精准调控荧光蛋白表达，将上述表达载体改造为方案2中的载体（见图2）。与方案1相比，方案2的主要优势是 。    (4)为检测方案2，科研人员将该方案中的工程菌稀释涂布在固体培养基上，形成单菌落，培养温度周期控制见图3。依据方案2，每个菌落生长2天后可出现4个不同的荧光环带，请预测图4所示菌落每个环带的工程菌中荧光蛋白表达情况，在下面表格中按时间顺序，依次写出所表达荧光蛋白的颜色（注：环带1形成时间为0-48小时，以此类推）。        菌落环带 1 2 3 4 所表达荧光蛋白的颜色 绿、红、绿 (5)聚羟基脂肪酸酯（PHA）常用于制备可降解的塑料包装材料。PHA是一种生物大分子，可由单体分子3HB和4HB随机聚合，或通过分段聚合形成嵌段共聚物（见图5），其中嵌段共聚物性能更优。共聚物的合成过程如图5，请完善以下表格，通过改造方案2以实现应用工程菌大规模生产优质PHA（不考虑各种酶在不同温度下的活性差异）。    操作 目的 对方案2表达载体的改造为：① 。 将构建好的表达载体导入大肠杆菌，获得工程菌。 获得可以合成PHA的工程菌。 以葡萄糖为原料配置培养基，灭菌后加入上述工程菌。 配制培养基、接种。 控制发酵条件：② 。 发酵48小时，获得3HB比例为25%的嵌段共聚物。 【答案】(1)遗传背景清晰、转基因操作简单、繁殖速度快、易于培养等 (2) 抑制启动子R，F蛋白不表达，解除F蛋白对启动子N的抑制 绿色 (3)30℃条件下减弱红色荧光蛋白表达带来的荧光干扰，且降低对绿色荧光蛋白表达的抑制 (4) 红、绿、红、绿 红、绿 绿 (5) 将GFP基因替换为A、B酶基因，RFP基因替换为D、E酶基因，加入持续表达启动子连接的X酶基因 30℃发酵12小时，随后切换至37℃发酵36小时 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选与获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）大肠杆菌是一种常见菌种，其结构简单，生理生化和遗传背景知识，尤其是其基因表达调控机制有了清楚的了解；大肠杆菌质粒又是最常用的质粒，基因克隆表达系统成熟完善，转基因操作简单；大肠杆菌繁殖速度快，易于大规模培养等。 （2）据图1分析可知，当培养温度为30°C时，C基因编码的C蛋白形成二聚体，抑制启动子R，使F基因无法表达出F蛋白，进而解除F蛋白对启动子N的抑制，使其发生转录促进GFP基因编码绿色荧光蛋白。 （3）据图2分析可知，在N启动子之后增加了L蛋白基因，使其编码出L蛋白，进一步抑制启动子R，因此在30℃条件下，RFP基因无法表达出红色荧光蛋白，减弱因红色荧光蛋白表达带来的荧光干扰，且进一步抑制启动子R，使F基因无法表达出F蛋白，解除F蛋白对启动子N的抑制，使其发生转录促进GFP基因编码绿色荧光蛋白，降低对绿色荧光蛋白表达的抑制。 （4）据图分析可知，将工程菌稀释涂布在固体培养基上， 形成单菌落，培养温度周期控制为37℃培养10小时，随后切换至30℃发酵14小时， 每个菌落生长2天后可出现4个不同的荧光环带。培养温度为37℃时，C基因编码的C蛋白没有形成二聚体，启动子R正常启动转录，F基因表达出F蛋白对启动子N的抑制，使L蛋白基因、GFP基因表达受抑制，同时RFP基因表达出红色荧光蛋白，培养温度为30℃时，培养温度为30°C时，C基因编码的C蛋白形成二聚体，抑制启动子R，使F基因无法表达出F蛋白，进而解除F蛋白对启动子N的抑制，使其发生转录促进GFP基因编码绿色荧光蛋白，所以菌落生长2天后出现4个不同的荧光环带颜色为：环带1：红、绿、红、绿，环带2：绿、红、绿，环带3：红、绿，环带4：绿。 （5）据图分析获知，4HB由D酶、E酶催化合成，3HB由A酶、B酶催化合成，再经X酶催化合成嵌段共聚物，要想发酵48小时， 获得3HB比例为25%的嵌段共聚物。对方案2表达载体的改造为：将GFP基因替换为A、B酶基因，RFP基因替换为D、E酶基因，加入持续表达启动子连接的X酶基因构建表达载体并导入大肠杆菌， 获得工程菌，以葡萄糖为原料配置培养基，灭菌后加入获得的工程菌，将接种后的培养基在30℃发酵12小时，随后切换至37℃发酵36小时，最后分离获取代谢产物。 50．（2025·黑龙江吉林·一模）实验室某小组新发现一个调控水稻种子活力的基因Oshipll，并通过基因编辑获得含有其突变基因a、b、c的三种水稻，来鉴定该基因作用机制。利用CRISPR/Cas9复合体进行基因编辑时，复合体首先会定位目标序列（非模板链）的5´-NGG-3´位点（N表示任意一种碱基），然后利用自身所含的一段20bp长度的向导RNA，与该位点5´端相连的序列互补配对，若能够互补，复合物会切割互补序列某位点，使该位点插入或丢失部分碱基，可能导致基因突变失活。下图表示相应基因的非模板链部分序列和编码的肽链的部分氨基酸序列。回答下列问题。    相应基因合成的肽链的氨基酸序列为 Oshipll         MANSKSLLLCWCSLLLL……*73    a           MANSKSLLLLLVLAPPP……*64    b            MANSKSLLL*9    c            MANSKSLLLLAAAAPPAL……*85 注：各个英文大写字母表示不同的氨基酸；*后面的数字表示肽链氨基酸个数；终止密码子为UAA、UAG、UGA (1)该复合物与基因工程基本操作工具中 酶作用相似，作用的化学键为 。 (2)若分析基因a、b、c的突变位点，应设计 ，扩增相应基因，然后测序，并利用 分析比较得出突变位点。 (3)该复合物所含的向导RNA的序列为5´- ...-3´（只填5´端前6个碱基），b基因所编码肽链的氨基酸数目比Oshipll减少的原因是 。 (4)下图图1为携带基因Oshipll及突变基因a、b、c的水稻萌发处理后发芽率比较。图2为用不同浓度ABA浸泡5天后，携带基因Oshipll及突变基因a、b的水稻发芽指数（发芽指数可反映种子萌发的速度，发芽指数越高种子萌发速度越快）比较。从图中数据可以得出基因Oshipll对于水稻萌发的作用为 ；出现图2结果的作用机制可能是 。    【答案】(1) 限制酶 磷酸二酯键 (2) 特异性引物 序列比对工具（BLAST） (3) GCAGAG 基因b的基因编辑位点增加了一个碱基，使终止密码子提前出现，翻译出多肽链变短 (4) 提高了发芽率，缩短了发芽时间 Oshipll抵抗ABA的作用来促进萌发 【分析】限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 【详解】（1）由题意可知，CRISPR/Cas9复合体进行基因编辑时，会切割互补序列某位点，与基因工程中限制酶作用相似，作用的化学键为磷酸二酯键。 （2）PCR技术可以特异性地扩增目的基因。若分析基因a、b、c的突变位点，应设计特异性引物，扩增相应基因，然后测序，并利用序列比对工具（如BLAST）等分析比较得出突变位点。 （3）CRISPR/Cas9复合体含有的向导RNA定位目标序列的5´-NGG-3´位点（N表示任意一种碱基），与该位点5´端相连的序列互补配对，故向导RNA的序列为5´-GCAGAG-3´，对比Oshipll和突变基因b的序列可知，基因b的基因编辑位点增加了一个碱基A，使终止密码子提前出现，导致翻译提前终止，翻译出多肽链变短。 （4）由图1可知，携带基因Oshipll水稻的发芽率高于携带突变基因a、b、c的水稻。由图2可知，在3种ABA浓度下，携带基因Oshipll水稻的发芽指数高于携带突变基因a、b的水稻，即种子萌发速度快。综上所述，基因Oshipll对于水稻萌发的作用为提高水稻种子的发芽率和发芽速率，缩短了发芽时间。图2中，携带突变基因a、b的水稻随着ABA浓度升高，发芽指数下降程度大于携带基因Oshipll水稻，可能是由于基因Oshipll抵抗ABA的作用来促进萌发。 51．（2025·山东聊城·一模）现发现一株叶色为黄绿色且雄性不育的双突变体两性植物（既可以自花传粉又可以异花传粉），其野生型表型为叶色绿色且雄性可育。已知叶色和雄蕊的育性分别受A/a和B/b控制。科研人员以该突变株（）和野生型（）进行了杂交，50%为绿色雄性可育，50%为黄绿色雄性可育，选取中黄绿色雄性可育植株自交，所得中绿色雄性可育：黄绿色雄性可育：绿色雄性不育：黄绿色雄性不育=3：6：1：2．回答下列问题： (1)结合实验分析，亲本和的基因型分别为 。 (2)中绿色雄性可育中纯合子所占的比例为 ，让中所有的黄绿色雄性可育植株间随机受粉，获得的子代中绿色雄性不育植株的概率为 (3)如果将中所有的绿色雄性可育株与绿色雄性不育株间行种植，则在绿色雄性不育株上收获的种子将来发育成绿色雄性不育株的概率为 ，绿色雄性可育株上收获的种子将来发育成绿色雄性不育株的概率为 (4)SSR是DNA中的简单重复序列，非同源染色体上、不同品种的同源染色体上的SSR重复次数不同，故常用于染色体特异性标记。科研人员提取出亲本、亲本及中50株雄性不育株叶肉细胞的核DNA，利用6号、8号染色体上特异的SSR进行PCR扩增，电泳结果如图2。 ①据图分析，控制雄性不育性状的基因可能位于 号染色体上。 ②2号不育株6号染色体SSR扩增结果出现的原因是 。 ③请在图3中画出植株8号染色体SSR扩增后的电泳结果 。 【答案】(1)aaBB、Aabb (2) 1/3 1/27 (3) 1/3 1/9 (4) 6 F1在减数分裂产生配子过程中，6号同源染色体的非姐妹染色单体发生 交换，形成了同时含雄性不育基因和P1亲本SSR标记的配子，并与含有雄性不育基因和P1亲本SSR标记的配子结合，发育成的子代同时具有两条条带 【分析】基因分离定律和自由组合定律的实质：进行有性生殖的生物在进行减数分裂形成配子的过程中，位于同源染色体上的等位基因随同源染色体分离而分离，分别进入不同的配子中，随配子独立遗传给后代，同时位于非同源染色体上的非等位基因进行自由组合。 【详解】（1）由实验一可知，绿色雄性可育（P1）与黄绿色雄性不育（P2）杂交，F1全为雄性可育，说明雄性可育为显性性状，由实验二可知，F1黄绿色雄性可育植株自交，F2出现绿色个体，说明黄绿色对绿色为显性，且绿色雄性可育（P1）与黄绿色雄性不育（P2）杂交F1中绿色雄性可育：黄绿色雄性可育=1：1，可推断出亲本中绿色雄性可育（P1）的基因型为aaBB，黄绿色雄性不育（P2）的基因型为Aabb。 （2）由（1）可知，F1黄绿色雄性可育植株的基因型为AaBb，F2中黄绿色雄性可育（A_B_）：黄绿色雄性不育（A_bb）：绿色雄性可育（aaB_）：绿色雄性不育（aabb）=6：2：3：1，与9：3：3：1相比可知，AA基因纯合致死，因此实验二F2中绿色雄性可育中纯合子（aaBB）所占的比例为1/3；F2中所有的黄绿色雄性可育的基因型及比例为AaBB：AaBb=1：2，产生的配子及比例是2/6AB、2/6aB、1/6Ab、1/6ab，F2中所有的黄绿色雄性可育自交，由于AA纯合致死，据棋盘法可知，后代中绿色雄性不育（aabb）的概率为1/27。 （3）实验二F2中所有的绿色雄性可育株的基因型及比例为aaBB：aaBb=1：2，绿色雄性不育株的基因型为aabb，将所有的绿色雄性可育株与绿色雄性不育株间行种植，由于绿色雄性不育株只能作母本，因此在绿色雄性不育株上收获的种子将来发育成绿色雄性不育株（aabb）的概率为2/3（aa）×1/2（bb）=1/3；绿色雄性可育株（aaBB：aaBb=1：2）上收获的种子将来发育成绿色雄性不育株（aabb）的概率为1/3×1/3=1/9。 （4）①据图分析，F2中50株雄性不育株叶肉细胞的核DNA的SSR中，所有的不育植株6号染色体SSR均有条带，故控制雄性不育性状的基因可能位于6号染色体上。 ②2号不育株6号染色体SSR扩增结果是含有双亲的SSR，原因可能是F1在减数分裂产生配子过程中，6号同源染色体的非姐妹染色单体发生 交换，形成了同时含雄性不育基因和P1亲本SSR标记的配子，并与含有雄性不育基因和P1亲本SSR标记的配子结合，发育成的子代同时具有两条条带。 ③F1植株8号染色体SSR应同时含有双亲的SSR，即有两个条带，故绘制图形如下： 52．（2025·广东梅州·一模）苯丙酮尿症是由于患者体内苯丙氨酸代谢途径中的酶发生缺陷，使得苯丙氨酸及其代谢物酮酸在血液和组织中大量累积，进而阻碍脑的发育。研究发现，苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因可在大肠杆菌中表达并降解苯丙氨酸。科学家将PAL基因导入到肠道益生菌Nissle1917大肠杆菌（EcN）中，构建工程菌EcN-PAL，用于治疗苯丙酮尿症。图1为2.7Kb的质粒，其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，EcoRⅠ和PvuⅠ两种限制酶的酶切位点与复制原点之间的距离分别为0.6Kb和0.8Kb。图2为含PAL基因的DNA片段。 回答下列问题： (1)PAL是一种胞内酶，据此推测EcN-PAL的细胞膜上应具有 功能的蛋白质与PAL协同工作，完成EcN-PAL的预期作用。 (2)利用PCR技术扩增PAL基因，若该基因编码区其中一条链的序列为5'-AGCCCTCC……GAACCAGC-3'，下列可选用的一对引物是______。 A．5'-CCTCCCCA-3' B．5'-AGCCCTCC-3' C．5'-GCTGGTTC-3' D．5'-GAACCAGC-3' (3)据图分析，选用 酶切割PAL基因和质粒，构建重组表达载体。为确保目的基因正确插入质粒中，使用EcoRⅠ对重组DNA分子完全酶切后，进行凝胶电泳分析。若电泳图谱中出现长度为 Kb的条带，则说明是符合要求的重组质粒。 (4)研究表明EcN菌株不会在人体肠道中定殖，一段时间后会从胃肠道全部清除。据此推测，若服用EcN-PAL治疗苯丙酮尿症，需 （答出一点即可）。 【答案】(1)转运苯丙氨酸 (2)BC (3) PvuI 1.2kb和5.5kb (4)持续服用足够剂量 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的筛选与获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于重组DNA分子的筛选； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA—PCR技术；②检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）由于PAL是一种胞内酶，它需要在细胞内发挥作用，而EcN-PAL要完成其预期作用，即降解苯丙氨酸，就需要将苯丙氨酸从细胞外运输到细胞内。因此，EcN-PAL膜上应存在具有转运苯丙氨酸功能的蛋白质，这些蛋白质能与PAL协同工作，确保苯丙氨酸能够顺利进入细胞内并被PAL降解。 （2）PCR技术中，引物是与目的基因两端互补配对的一段短单链DNA，用于引导DNA聚合酶进行DNA的合成。已知该基因编码区其中一条链的序列为5'-AGCCCTCC……GAACCAGC-3' 。引物需要与模板链的3'端互补配对，这样才能保证DNA聚合酶沿着5'到3'的方向进行DNA合成。 A、5'-CCTCCCA - 3' ，与已知序列的部分反向互补，但扩增范围向左，不可作为引物； B、5'-AGCCCTCC - 3' ，与已知序列有部分相同，不能作为引物； C、5'-GCTGGTTC - 3' ，与已知序列的3'端反向互补，可作为引物； D、5'-GAACCA - 3' ，与已知序列有部分相同，不能作为引物。 综上所述，可选用的一对引物是BC。 （3）PAL基因的两端只含PvuI限制酶切割位点，且质粒上也有PvuI限制酶切割位点，所以应选用PvuI酶切割PAL基因和质粒构建重组表达载体。经过限制酶切割后，PAL基因两端的黏性末端相同，有可能和质粒正向连接，也可以和质粒反向连接。由于EcoRI在目的基因和质粒上都有酶切位点，为选出正向连接的重组质粒，使用EcoRI对质粒完全酶切后，进行电泳分析。质粒中EcoRI酶切位点与Pvul酶切位点之间的距离为0.2Kb，若是正向连接载体，重组质粒中2个EcoRI酶切点之间的距离是0.2+1.0=1.2Kb ，重组质粒长度为：2.7+4=6.7Kb，故EcoRI酶切后，正向连接载体的情况下，电泳图谱中出现长度为1.2kb和5.5kb两条带。 （4）研究表明EcN菌株不会在人体肠道中定殖，一段时候后会从胃肠道全部清除。据此推测，服用EcN-PAL治疗苯丙酮尿症时需注意持续服用足够剂量以维持治疗效果，因为一旦停止服用，工程菌就会从肠道中清除出去，无法继续发挥降解苯丙氨酸的作用。 53．（2025·山东济宁·一模）为筛选出能与SARS病毒的S蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员利用基因工程技术，在S蛋白末端添加TAP标签（能特异性地与人和哺乳动物体内IgG类抗体结合）形成S-TAP融合蛋白，再利用该标签在病毒敏感细胞中纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，部分过程如图。回答下列问题。    注：XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI表示限制酶识别序列，各限制酶识别序列及切割后产生的DNA末端均不同；F、R表示引物；T7表示启动子；Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列。 (1)为成功构建重组质粒pcDNA3．1-S-TAP，在利用PCR扩增S基因时，需在F引物的5'端外侧依次添加 序列。PCR时新合成链的延伸方向是 （填“5′→3′”或“3′→5′”）。 (2)使用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，DNA分子的迁移速率与 有关。 (3)在该重组质粒pcDNA3.1-S-TAP中，T7的作用是 ，重组质粒中还应该有的结构有 。 (4)为检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，科研人员将转染细胞置于载玻片，洗涤、固定后，滴加带有荧光标记的 稀释液，荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。 【答案】(1) Kozak和SmaⅠ酶 5′→3′ (2)凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象 (3) RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 终止子、标记基因、复制原点 (4)IgG类抗体 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。基因工程包括四个基本步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）依题意，Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列，T7表示启动子，根据构建的重组质粒图示可分析，在S基因的上游加入了Kozak序列以调控S基因表达，故要在F引物的5'端外侧添加Kozak序列；目的基因和质粒要连接构成表达载体，根据T7启动子的方向及质粒上的酶切位点可知，S基因上游不能用XhoI（S基因会被XhoI酶切），应该有用Smal酶切，故F引物的5'端外侧还要添加SmaI酶识别序列；PCR是体外DNA复制技术，DNA复制的方向是新链的5′→3′，故PCR时新合成链的延伸方向是5′→3′。 （2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 （3）依题意，T7表示启动子，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。基因表达载体是载体的一种，包含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等。结合图示可知，基因表达载体中已有启动子、目的基因，还应有的结构是终止子、标记基因、复制原点。 （4）依题意，S蛋白末端添加TAP标签能特异性地与人和哺乳动物体内IgG类抗体结合，若要检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，可滴加带有荧光标记的IgG类抗体稀释液，置荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。 54．（2025·安徽滁州·一模）滁菊是菊花中花瓣最为紧密的一种，素有“金心玉瓣，翠蒂天香”之美誉，名列“四大名菊”之首。在滁菊的生长过程中，常常会受蚜虫的危害，使茎叶粘连、叶片卷缩等。研究发现雪花莲凝集素（GNA）和尾穗苋凝集素（ACA）可以有效抑制蚜虫生长和繁殖，并且对蚜虫天敌的生长无害，所以研究人员利用转基因技术获得了抗蚜虫滁菊的新品种。下图表示培育滁菊新品种的过程，图中的α、β、γ、δ均为限制酶。    回答下列问题。 (1)获得GNA-ACA融合基因的过程中，可以使用β、γ两种不同限制酶的原因是 。过程①是基因工程的核心步骤，其目的是 ，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)重组质粒导入大肠杆菌时，需要使用Ca2+处理大肠杆菌，其目的是 。 (3)图中过程②是 ，过程③要进行光照培养，其作用是有利于 和植物光合作用。 (4)在上述培育滁菊新品种的过程中没有出现操作错误，但在对所得到的乙中的滁菊植株进行抗虫性检查时，发现有许多滁菊植株没有抗虫性。请你分析出现以上结果的原因可能是 （答出一点即可）。 【答案】(1) β、γ两种不同限制酶切割所得的末端相同（答案合理即可） 让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代 (2)使大肠杆菌处于容易从外界环境吸收DNA的状态 (3) 脱分化 诱导叶绿素形成 (4)导入大肠杆菌的质粒中可能不含有GNA-ACA融合基因（或选取甲植株中的某些细胞没有导入重组质粒；答案合理即可） 【分析】基因工程需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定；构建基因表达载体就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使目的基因能够表达和发挥作用，这一步是基因工程的核心工作。 【详解】（1）获得GNA−ACA融合基因的过程中，可以使用β、γ两种不同限制酶的原因是这两种限制酶切割DNA分子产生的黏性末端相同，因此它们可以识别并切割不同的DNA分子，但产生的末端可以互补连接，从而形成融合基因。过程①是基因工程的核心步骤，即构建基因表达载体，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 （2） 重组质粒导入大肠杆菌时，需要使用Ca2+处理大肠杆菌，其目的是使其成为感受态细胞，即处于易于接受外源DNA分子的状态，从而方便重组质粒的导入。 （3）图中过程②是外植体形成愈伤组织的过程，表示脱分化过程。过程③表示愈伤组织再分化形成芽，此过程要进行光照培养，其作用是有利于诱导叶绿素形成和植物光合作用，从而确保转基因滁菊植株的正常生长和发育。 （4）在上述培育滁菊新品种的过程中，即使没有出现操作错误，但在对所得到的乙中的滁菊植株进行抗虫性检查时，仍可能发现有许多滁菊植株没有抗虫性。这可能是由于目的基因（GNA−ACA融合基因）没有成功导入受体细胞，或者导入的受体细胞的染色体DNA上不含目的基因（即导入的受体细胞不是转基因细胞），或者导入的目的基因没有转录或翻译（即目的基因在受体细胞中未能正常表达）等原因导致的。因此，在转基因生物的培育过程中，需要进行严格的检测和鉴定工作，以确保转基因生物具有预期的性状和表现。 55．（2025·安徽·一模）某些植物凝集素如雪花莲凝集素和尾穗苋凝集素对一部分昆虫有毒性，可用作抗虫转基因植物的目的基因。研究人员将雪花莲凝集素基因（GNA）和尾穗苋凝集素基因（ACA）与载体（pBI121）结合，然后导入棉花细胞，获得转基因抗虫棉。部分过程如图所示，图中KpnⅠ及XhoⅠ为载体上限制酶的识别位点。回答下列问题： (1)限制酶SmaⅠ的识别序列为，可使用SmaⅠ处理GNA及ACA，然后用 DNA连接酶处理可获得二者的融合基因。若图1中融合基因的①链为模板链，使用限制酶KpnⅠ及XhoⅠ构建基因表达载体时，需在融合基因的ACA侧添加限制酶 的识别序列。 (2)将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是 （答出两种）。取一部分在添加了卡那霉素的培养基上正常生长的棉花细胞，通过 技术获得的棉花植株不一定具有抗虫性状的原因是 （答出两点）。 (3)图2是重组质粒的部分结构放大示意图，对单独使用KpnⅠ处理融合基因和载体得到的转基因棉花细胞需要进行进一步鉴定：获得棉花细胞的DNA，再用图2中的引物 进行PCR，并利用 技术对PCR产物进行鉴定。 【答案】(1) T4 KpnⅠ (2) 农杆菌转化法、花粉管通道法 植物组织培养 导入棉花细胞的是空质粒或目的基因不能成功转录和翻译（合理即可） (3) 1和3或2和4 琼脂糖凝胶电泳 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）根据限制酶SmaⅠ的识别序列，用SmaⅠ处理GNA及ACA后，形成平末端，用T4DNA连接酶处理可获得二者的融合基因。 图1中融合基因的①链为模板链，转录时RNA聚合酶从模板链的3'至5'端移动，所以先转录ACA，再转录GNA，根据启动子的方向，所以应该在融合基因的ACA侧添加限制酶KpnⅠ的识别序列。 （2）将基因表达载体导入植物细胞常用的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法等，再通过植物组织培养技术获得棉花植株，但不一定具有抗虫性状，可能的原因是导入棉花细胞的是空质粒或目的基因不能成功转录和翻译。 （3）对单独使用Kpnl处理融合基因和载体得到的转基因棉花细胞进行鉴定，获得棉花细胞的DNA后，可以用图2中的引物1和引物3或引物2和引物4进行PCR，这样可以扩增出包含融合基因的片段。对PCR技术产物鉴定用琼脂糖凝胶电泳技术。 56．（2025·安徽·一模）香蕉在生长过程中常因感染病原体而减产。为了增加香蕉的抗病能力，从某生物中提取mRNA通过逆转录获得抗病基因，构建表达载体、通过农杆菌转化法获得转基因抗病香蕉，过程如图1。回答下列问题：    (1)DNA在扩增的过程中需要引物，引物是指 。由mRNA逆转录获得抗病基因时，不但需要引物，且需在引物 端添加相应的限制酶序列。 (2)在构建重组质粒时，需要加入相应的限制酶，请写出被限制酶切制后抗病基因两端的黏性末端序列：    (3)用农杆菌侵染香蕉组织块，其目的是 。 (4)图1中①②过程培养基中生长素和细胞分裂素的 等都会影响植物细胞的发育方向。 (5)植物组织培养获得的转基因抗病香蕉需要进行个体生物学水平的鉴定。欲从个体生物学水平来鉴定抗病基因是否赋予香蕉抗病特性的操作是 。 【答案】(1) 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 5' (2)   (3)通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞并整合到染色体DNA上 (4)浓度、比例 (5)进行抗病香蕉的接种实验（或用病原体来感染该转基因香蕉，观察其抗病特性及抗性的程度） 【分析】对限制酶选择条件：不能破坏目的基因和启动子、终止子，以便于目的基因和载体正确连接。 【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，因此添加限制酶序列只能连接在5'端。 （2）根据质粒上的限制酶切割位点可知，XbaⅠ和SpeⅠ会破坏抗性基因和终止子，只能选择HindⅢ和EcoRⅠ两种限制酶对抗病基因和质粒载体进行切割，且抗病基因的转录方向从右往左，所以抗病基因靠近启动子一端用HindⅢ切割，另一端用EcoRⅠ切割，故抗病基因左端产生EcoRⅠ的黏性末端，右端产生HindⅢ的黏性末端。 （3）用农杆菌侵染香蕉组织块，其目的是通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞并整合到染色体DNA上，获得转基因植株。 （4）植物组织培养需添加生长素和细胞分裂素两种关键性激素，它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向。 （5）植物组织培养获得的转基因抗病香蕉需要进行个体生物学水平的鉴定，其做法是对培养的转基因抗病香蕉进行病原体接种实验，以确定导入的抗病基因是否赋予了香蕉抗病特性及抗性的程度。 57．（2025·上海·一模）重组人纤溶酶原激活剂（hPA）能够高效特异性地溶解血栓，目前已培育成功rhPA转基因兔，作为乳腺生物反应器批量生产药物。 某科研团队构建重组质粒PCL25/rhPA如图1所示（该质粒以β﹣casein作为调控序列，以CMV为启动子，其中SalⅠ、XhoⅠ、NotⅠ所在位置表示相关限制酶切点）。    (1)重组质粒PCL25/rhPA如图1所示。rhPA基因上游的CMV能被 结合，从而开启转录过程。在PCL25质粒的 限制酶切位点处插入化学合成的rhPA﹣cDNA片段。 (2)氨苄西林抗性基因是ampr，能否用只含有氨苄西林的培养基筛选出导入重组质粒的细胞？ 。原因是 。 (3)为筛选出含有重组质粒P3（图2）的菌落，tetr代表四环素抗性基因，采用含有不同抗生素的平板进行筛选后得到A、B、C三类菌落，其生长情况如表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的目标菌落是 （填表中字母）类，另外两类菌落的质粒导入情况分别是 。 平板类型 菌落类型 A B C 无抗生素 + + + 氨苄西林 + + ﹣ 四环素 + ﹣ ﹣ 氨苄西林+四环素 + ﹣ ﹣ 【答案】(1) RNA聚合酶 XhoⅠ (2) 不能 导入普通质粒或重组质粒细胞都具有氨苄西林抗性，都能正常生长 (3) B A类菌落含有P0质粒，C类菌落未转入质粒 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）由题意可知，rhPA基因上游的CMV为启动子，启动子能被RNA聚合酶识别并结合，从而开启转录过程。在构建图1中的重组质粒时要保证目的基因（rhPA﹣cDNA片段）被连接在质粒（PCL25质粒）上特定的启动子和终止子之间才能保证目的基因在受体细胞中被成功转录，而启动子和终止子之间只有XhoⅠ识别序列，据此推测，PCL25/rhPA重组质粒是在PCL25质粒的XhoⅠ限制酶切位点处插入化学合成的rhPA﹣cDNA片段构建而成。 （2）由于空质粒也含有氨苄西林抗性基因，导入了空质粒的细菌也可以在只含有氨苄西林的培养基上存活，所以不能用只含有氨苄西林的培养基筛选出导入重组质粒的细胞。 （3）B菌落为含有重组质粒P3的菌落，没有四环素抗性基因，但含有氨苄西林抗性基因，因此在无抗生素培养基以及氨苄西林的培养基可以生存，但无法在四环素以及氨苄西林+四环素培养基生存，因此，为筛选出含有重组质粒P3的菌落，应选择的菌落是B。A菌落质粒未导入目的基因，导入了空质粒P0，因此可以在四种平板上生存。C菌落未导入质粒，因此只能在无抗生素平板生存。 58．（2025·贵州·一模）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。    (1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是 。 (2)SgRNA可识别并特异性结合目标DNA序列，二者结合所遵循的原则是 。Cas9蛋白相当于 酶，可催化 键断裂，可在受体细胞中特定的基因位点进行切割，导致 （填变异类型），改变基因结构。 (3)构建完成CRISPR/Cas9重组质粒后，需要对其进行扩增，扩增的原理是 。 (4)CRISPR/Cas9基因编辑技术可通过改变 的碱基序列，从而可以任意编辑基因组上的各种靶序列。若要将目标基因从目标DNA上切除下来，一般需要设计 种不同的SgRNA。 (5)CRISRP/Cas9基因编辑技术中常用的SgRNA长度为20个碱基左右。某SgRNA因细胞内其他DNA序列也含有与其相对应的序列，造成该SgRNA错误结合而脱靶，解决的具体措施是 。 【答案】(1)DNA连接酶 (2) 碱基互补配对原则 限制酶 磷酸二酯键 基因突变 (3)DNA的半保留复制 (4) SgRNA的引导序列（或SgRNA） 2/两 (5)适当增加SgRNA的长度，提高其与靶基因识别的特异性 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。 （2）SgRNA可识别并特异性结合目标DNA序列，其结合过程遵循碱基互补配对原则。Cas9蛋白相当于限制酶，因而可在相应的部位实现切割，可催化磷酸二酯键断裂，可在受体细胞中特定的基因位点进行切割，使基因的碱基序列改变，从而导致基因突变，进而实现基因结构的改变。 （3）构建完成CRISPR/Cas9重组质粒后，需要采用PCR技术对其进行扩增，PCR原理是DNA的半保留复制。 （4）CRISPR/Cas9基因编辑技术可通过改变SgRNA的引导序列的碱基序列，从而可以任意编辑基因组上的各种靶序列。若要将目标基因从目标DNA上切除下来，需要在目标基因的两侧进行切割，使其从DNA片段上脱落，因此一般需要设计2种不同的SgRNA，进而将目的基因切割下来。 （5）CRISRP/Cas9基因编辑技术中常用的SgRNA长度为20个碱基左右。某SgRNA因细胞内其他DNA序列也含有与其相对应的序列，造成该SgRNA错误结合而导致无法将目标基因切割下来，表现为脱靶，为了避免脱靶则需要适当增加SgRNA的长度，提高其与靶基因识别的特异性，提高剪切的准确率。 59．（2025·海南·一模）抗性淀粉是指在小肠中不能被消化吸收但能够作为肠道中某些消化细菌的底物。由于其不能被快速分解，相比于其他淀粉来说具有较低的升糖指数，在饮食上可一定程度地缓解糖尿病。除此之外，抗性淀粉还有降低胰岛素反应、调节肠道功能、能防止脂肪堆积等生理功能，因此其作为一种新型的膳食纤维，正在被广泛追崇。抗性淀粉（RS）的含量与直链淀粉与支链淀粉的含量比呈显著相关。可以通过提高直链淀粉的含量来提高 RS 的比例。 水稻是我国的主要粮食作物，是人体淀粉的重要来源。研究者设想特异性编辑水稻品种“嘉花 1 号”的淀粉分支酶基因，通过降低或抑制该基因的正常表达，从而影响该酶功能，减少支链淀粉的合成，升高直链淀粉和支链淀粉之间的比例，达到抗性淀粉上升的目的。 (1)如图1是水稻中淀粉的转化情况。分析可知，淀粉分支酶 （填“SSS”“GBSS”或“SBE”）是支链淀粉形成过程中的关键酶。 (2)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除或破坏目标基因（靶基因）其工作原理如图2所示。     研究发现CRISPR-Cas9系统广泛存在于细菌细胞内，从功能上看，细菌体内的Cas9类似于基因工程中的 ，推测细菌中Cas9存在的意义： 。 (3)自然界中的水稻不存在CRISPR/Cas9系统，可以利用基因工程技术。为了导入CRISPR/Cas9系统需要获取哪些基因？ 。 科研团队选择利用农杆菌转化法将含CRISPR/Cas9系统导入水稻细胞内。 这里所用的载体是 ，选择它的原因是 。 基因工程操作流程如下： 获取目的基因→构建重组质粒→转入 →导入水稻叶细胞→筛选得到含CRISPR/Cas9系统的水稻细胞→ 得到目标水稻植株，可从哪些方面去检测和鉴定得到的水稻是否达标？ （写1点即可）。 【答案】(1)SBE (2) 限制酶 切割外源DNA使之失效，以保证自身安全 (3) 编码Cas9的基因和SgRNA的基因 Ti质粒 Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞染色体的DNA上 农杆菌 植物组织培养 对基因工程水稻与原始“嘉花 1 号水稻的淀粉分支酶基因（SBE基因）的序列进行测序判断是否产生有意义的突变；比较基因工程水稻与原始“嘉花 1 号水稻 SBE基因的表达情况；比较基因工程水稻与原始“嘉花 1 号水稻植株直链淀粉与直链淀粉的比例 【分析】基因编辑依赖于经过基因工程改造的核酸酶，也称“分子剪刀”，基因编辑以其能够高效率地进行定点基因组编辑，在基因研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。 【详解】（1）由图分析可知支链淀粉的形成需要从ADP-葡萄糖在SSS作用下形成可溶性直链淀粉，在SBE的作用下转化为支链淀粉，所以淀粉分支酶SBE是支链淀粉形成过程中的关键酶。 （2）题中描述Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除或破坏目标基因，所以它是类似于基因工程中的限制酶。细菌是原核生物，没有复杂系统抵御外来进入的核酸，所以靠Cas9可切割外源DNA使之失效，以保证自身安全。 （3）CRISPR/Cas9系统由向导RNA和Cas9蛋白两部分构成，所以需获取编码Cas9的基因和SgRNA的基因，才能在受体细胞内合成CRISPR/Cas9系统。农杆菌转化用的是Ti质粒， Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞染色体的DNA上。用农杆菌转化法要先将重组质粒导入农杆菌，再用农杆菌去侵染植物细胞；由水稻叶细胞得到植株需进行植物组织培养。目标植株的检测可以从基因角度，看编辑后的SBE基因有没有被破坏或敲除，即发生有效突变；还可以检测基因的表达情况，看编辑后的SBE基因与原基因相比，其转录的mRNA或翻译的SBE酶含量是否下降；还可以检测转基因植株的直链淀粉与直链淀粉的比例，因此若要鉴定水稻是否达标，可对基因工程水稻与原始“嘉花 1 号水稻的淀粉分支酶基因（SBE基因）的序列进行测序判断是否产生有意义的突变；比较基因工程水稻与原始“嘉花 1 号水稻 SBE基因的表达情况；比较基因工程水稻与原始“嘉花 1 号水稻植株直链淀粉与直链淀粉的比例。 60．（2025·黑龙江辽宁·一模）植物中的光敏蛋白Р可以感受红光和远红光，在活化状态下可以与核输入蛋白（F）结合形成复合体，并被转运到细胞核中起作用；在失活状态下则与F蛋白分离。研究人员利用光敏蛋白的性质设计了转基因表达系统（REDMAP系统）。回答下列问题：    (1)糖尿病是一种常见的代谢类疾病，主要通过注射胰岛素进行治疗。研究人员利用图1所示的REDMAP系统治疗糖尿病小鼠。当使用 （选填“红光”或“远红光”）照射时，启动子UAS激活并顺利表达胰岛素基因。这种治疗方式的优势在于 。研究人员用腺相关病毒（AAV）作为基因载体将该REDMAP系统导入糖尿病小鼠体内。使用前需要对AAV中编码病毒蛋白的部分进行 ，以减少感染时机体的 ，使其能在体内长期存在；同时基因载体上必须保留 ，使外源基因在细胞内能自主复制。 (2)为检验REDMAP系统治疗糖尿病的效果，研究人员使用链脲佐菌素（诱导糖尿病的物质）注射正常小鼠，观察到小鼠出现 症状后，均分成三组在适宜条件下进行不同的实验处理。实验结果如图2所示，A、B、C三组的处理分别为注射空载病毒AVV溶液、 、 。实验结果显示，REDMAP系统 。 【答案】(1) 红光 通过光照定时定点表达胰岛素，减少注射给药带来的不适 基因敲除 免疫应答/特异性免疫 复制起点/复制原点 (2) 尿糖 注射携带REDMAP系统的AVV溶液并黑暗处理 注射携带REDMAP系统的AVV溶液并定时红光照射 在黑暗下不起作用，在红光照射下激活并稳定表达胰岛素 【分析】复制原点是DNA分子上的特定区域，它是DNA复制开始的起始点。在这个位点上，各种复制相关的蛋白质和酶会结合并启动复制过程。 【详解】（1）光敏蛋白感受红光后转变为活化状态，感受远红光转变为非活化状态，结合图2所示，当使用红光照射时，Ga14 -VP64结合到启动子UAS上，启动子UAS激活并顺利表达基因，因此当使用红光照射时，启动子UAS激活并顺利表达胰岛素基因。这种治疗方式的优势在于可以通过光照定时定点表达胰岛素，减少注射给药带来的不适，避免了传统注射胰岛素的不便和可能的副作用。使用前需要对AAV中编码病毒蛋白的部分进行基因敲除，这样不会编码出病毒蛋白，可以减少感染时机体的免疫应答/特异性免疫，使其能在体内长期存在。复制起点/复制原点对于外源基因在细胞内能否自主复制至关重要，因此基因载体上必须保留复制起点/复制原点，使外源基因在细胞内能自主复制。 （2）链脲佐菌素可诱导小鼠产生糖尿病，因此研究人员使用链脲佐菌素（诱导糖尿病的物质）注射正常小鼠，观察到小鼠出现尿糖症状。利用REDMAP系统治疗糖尿病小鼠时，红光照射可激活胰岛素基因的表达，因此为检验REDMAP系统治疗糖尿病的效果，A、B、C三组的处理分别为注射空载病毒AVV溶液、注射携带REDMAP系统的AVV溶液并黑暗处理、注射携带REDMAP系统的AVV溶液并定时红光照射。根据图3可知，B组的胰岛素浓度与A组接近，C组的胰岛素浓度高于A组，因此实验结果显示REDMAP系统在黑暗下不起作用，在红光照射下激活并稳定表达胰岛素。 61．（2025·黑龙江哈尔滨·一模）金黄色葡萄球菌（简称Sa）可能引发从轻微皮肤感染到严重的全身感染，尤其对免疫力低下者危害更大。预防感染的关键在于良好的卫生习惯和合理使用抗生素。但不规范使用抗生素易出现抗药性Sa。推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以下图中R基因的上、下游片段及质粒1共同构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。 (1)操作步骤如下： ①根据图1信息，质粒2的构建过程中用引物 （填数字）进行PCR扩增，每次循环一般可以分为 三步，n次循环后可以得到等长的目的基因 个。然后选择限制酶 对扩增产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含氯霉素的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将步骤②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的概率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落中分别挑取少许菌体，依次接种到含 的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因可能被敲除。 (2)以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，产物一般通过 （技术名称）来鉴定。检测结果如下图所示，表明R基因已被敲除的是 。 【答案】(1) 1、4 变性、复性、延伸 2n-2n Sac Ⅱ 和 EcoRI 脱水四环素 头孢霉素 (2) (琼脂糖凝胶)电泳 D 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】（1）①由图1可知，质粒2上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点，而质粒1上只有SacⅡ酶切位点，R基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用引物1和4进行PCR扩增可得到整个R基因，PCR反应过程是：变性→复性→延伸，n次循环后可以得到等长的目的基因2n-2n。用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，因为重组的质粒2上含有氯霉素抗性基因，所以可以将重组后的含质粒2的菌落涂布在含氯霉素的平板上，能生存下来的菌落就是，含质粒2的Sa单菌落。 ③为验证该推测需要敲除R基因，因为质粒2上含有Y可被脱水四环素诱导表达的Sa致死基因，所以将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含脱水四环素的平板上，可诱导R基因死亡，推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关，因此可从这些菌落中分别挑取少许菌体，依次接种到含头孢霉素的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 （2）以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是D组，由图1可知，R基因两侧含有的引物为2和3，所以扩增后含有引物2或3，或者2和3的可能含有R基因，所以表明R基因已被敲除的是D组。 62．（2025·江西·一模）研究人员以酵母菌为受体细胞，运用酵母双杂技术找到了柑橘黄龙病致病菌分泌的SDE19蛋白在柑橘中发挥作用的靶蛋白。酵母双杂技术原理如下，酵母菌的转录激活因子包括DNA结合域（BD）和转录激活域（AD），这两个结构单独存在时不能激活转录。将待测蛋白X与BD融合，蛋白质Y与AD融合，蛋白X和Y有相互作用时，两结构域能呈现转录因子活性，激活报告基因的表达，如图1所示。请回答下列问题： AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TRP、LEU分别编码合成Trp、Leu两种氨基酸的酶；Sal I、Nde I、EcoR I，BamH I，Not I，HindIII为酶切位点。 (1)研究人员将编码SDE19蛋白基因连接到含有编码BD多肽基因的质粒PBD中，获得BD-SDE19融合表达载体。通过PCR获取SDE19蛋白基因时，需在引物1和引物2的 （“3′或5′”）端分别添加酶切位点 和 。 (2)为寻找SDE19在柑橘中的靶蛋白，需要提取柑橘细胞的RNA，通过 ，再将其插入含有编码AD多肽的基因质粒pAD中，构建AD-Yn表达载体（Yn表示不同cDNA表达的蛋白质）。 (3)研究人员选用Trp、Leu氨基酸合成缺陷型酵母菌进行实验，原因是 ，若报告基因为LacZ（LacZ编码的物质可以降解X-Gal使菌落呈蓝色，否则为白色），培养基中添加X-Gal，含有靶蛋白的酵母菌菌落会表现为 色。 (4)酵母双杂技术在研究和鉴定蛋白质互作方面有重要作用，以下适合采用此技术进行的是______。 A．判断控制某一性状的两对基因能否独立遗传 B．筛选宿主细胞上能与新冠病毒S蛋白特异性结合的受体 C．判断RNA聚合酶和某启动子的结合是否具有特异性 【答案】(1) 5′ SalI NdeI (2)逆转录得到cDNA（一定需要答到“逆转录”，“cDNA”写成“目的基因”、“DNA”也合理） (3) 只有同时获得BD-SDE19和AD-Yn基因表达载体的酵母菌才能在不含Trp、Leu氨基酸的培养基上生长 蓝 (4)B 【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）引物的3′端需与模板链严格配对，可以在5′端引入酶切位点；为获得BD-SDE19融合表达载体，可基于pBD质粒，在BD序列下游插入SDE19基因序列，选用EcoRI会破坏目的基因，已知SDE19模板链，需确保转录的方向与BD基因一致，因此分别在引物1和引物2的5′端引入SalI、NdeI酶切位点； （2）为获得靶蛋白编码序列，需提取柑橘细胞的RNA，通过反转录获得cDNA。 （3）为寻找SDE19在柑橘细胞的靶蛋白，需将BD-SDE19融合表达载体和AD-Yn融合表达载体（Yn表示不同cDNA表达的蛋白质）均导入酵母细胞，两个载体分别含有编码合成Trp、Leu氨基酸的酶，选用Trp、Leu氨基酸合成缺陷型酵母菌为受体菌，并且培养基中不添加Trp、Leu两种氨基酸，只有成功获得两个载体的酵母菌才能在该培养基上存活；靶蛋白可以和SDE19相互作用，使AD和BD相互靠近，驱动报告基因的表达，实验选用的是LacZ报告基因，LacZ编码的物质可以降解X-Gal使菌落呈蓝色，菌落成蓝色，说明报告基因进行表达，存在靶蛋白。 （4）A、酵母双杂技术是用来研究和鉴定蛋白质间的相互作用，不能推断基因在染色体上的排列，因此不能判断控制某一性状的两对基因能否独立遗传，A错误； B、新冠病毒入侵宿主细胞，其表面的S蛋白会与宿主细胞表面受体特异性结合，可利用酵母双杂原理寻找相应受体，B正确； C、启动子是一段DNA序列，不能用酵母双杂原理检测RNA聚合酶和启动子的结合是否具有特异性，C错误。 故选B。 63．（2025·山西吕梁·一模）苯丙酮尿症是单基因遗传病，科学家将正常基因D导入该病患者的细胞，以治疗该病。图甲为A、B、C三种质粒，图乙为含有目的基因D的DNA片段，图丙为重组载体的示意图。Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，LacZ为蓝色显色基因，其表达产物可以将无色化合物Xgal转化为蓝色物质，使菌落呈蓝色，EcoRⅠ（0.6Kb）、PvuⅠ（0.8Kb）为限制酶及其切割位点与复制原点之间的距离。回答下列问题： (1)科学家将正常基因D导入该病患者的细胞中常用的方法是 。图甲中三种质粒适宜作为载体的是质粒 （填字母），与另外两种质粒相比，其优点是 。 (2)获取目的基因D时应选择乙图中 限制酶对其所在的DNA进行切割。如果仅知道D基因首尾的部分核苷酸序列，可根据D基因已知核苷酸序列合成引物，利用 技术扩增目的基因。 (3)将目的基因D和甲图中相应质粒连接后，得到图丙中三种重组质粒。为选出正向连接的重组质粒，使用 限制酶对重组质粒完全酶切后，进行电泳分析，若电泳图谱中出现长度为 Kb的两条带，则为正向连接的重组质粒。 (4)利用自身不含LacZ基因且对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，若要在已转化的含重组质粒、已转化的含空质粒的受体细胞和未转化成功的细胞中筛选出已转化的含重组质粒的受体细胞的方法是 。 【答案】(1) 显微注射法 B 有标记基因，复制原点不会被限制酶切割 (2) PvuI PCR (3) EcoRI 1.2kb和5.5kb (4)在含有氨苄青霉素和X-gal的培养基上培养，形成白色菌落的为导入重组质粒的受体细胞 【分析】分析题图可知，目的基因只能用PvuⅠ进行切割，质粒A上有复制原点以及EcoRⅠ、PvuⅠ两种限制酶限制酶切位点，无标记基因，不能进行目的基因的检测；质粒B含有EcoRⅠ、PvuⅠ两种酶切位点、氨苄青霉素抗性基因和蓝色显色基因，而且相应的限制酶切割后，可以保留氨苄青霉素抗性基因的完整性；质粒C中含有氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因以及EcoRⅠ、PvuⅠ两种限制酶限制酶切位点，但是PvuⅠ的酶切位点位于复制原点，目的基因插入会导致重组质粒不能进行复制。 【详解】（1）科学家将正常基因D导入该病患者的细胞中常用的方法是显微注射法，基因工程操作的核心步骤是基因表达载体的构建。图甲中三种质粒适宜作为运载体的是质粒B，因为质粒B含有EcoRⅠ、PvuⅠ两种酶切位点、氨苄青霉素抗性基因和蓝色显色基因，而且相应的限制酶切割后，可以保留氨苄青霉素抗性基因的完整性。与另外两种质粒相比，其作为载体的优点是有标记基因，复制原点不会被限制酶切割。 （2）获取目的基因D时应选择乙图中的PvuI对其所在的DNA进行切割，因为目的基因两端存在酶切位点。如果仅知道D基因首尾的部分核苷酸序列，根据D基因已知核苷酸序列合成引物，利用PCR扩增目的基因。 （3）由于EcoRI在目的基因和质粒上都有酶切位点，为选出正向连接的重组质粒，使用EcoRI对质粒完全酶切后，进行电泳分析。质粒B中EcoRⅠ酶切位点与PvuⅠ酶切位点之间的距离为0.2Kb，若是正向连接载体，重组质粒中2个EcoRⅠ酶切点之间的距离是0.2+1=1.2Kb，重组质粒长度为：2.7+4=6.7Kb，故EcoRⅠ酶切后，正向连接载体的情况下，电泳图谱中出现长度为1.2kb和5.5kb两条带。 （4）要筛选出已转化的含重组质粒的受体细胞的方法是在含有氨苄青霉素和X-gal的培养基上培养，形成白色菌落的为导入重组质粒的受体细胞。 64．（2025·山东菏泽·一模）北京紫眼果蝇（基因型hh）是从野生型红眼果蝇（基因型HH）中分离出来的隐性突变体。对控制果蝇眼色的H、h基因进行了相关研究。F1、F2、F3、P1、P2、P3这六种引物及H基因结构如图1所示。    (1)为获取h基因，以北京紫眼果蝇体细胞的总DNA作为 ，用图1中F1、P1作为引物进行PCR，推测这对引物中与α链结合的引物碱基序列为5’- -3'（写出前6个碱基），扩增得到的DNA片段长度超过7000bp，说明北京紫眼的h基因是由于H基因中插入外来片段形成的。 (2)根据图1，运用PCR继续探究突变位点在H基因上的大致位置，简要写出实验思路： 。 (3)为验证H基因突变是北京紫眼性状产生的原因，运用UAS-GAL4转基因体系将H基因导入北京紫眼果蝇中，流程如图2。GAL4基因的表达产物是一种转录因子，UAS是一段特殊的具有调控功能的DNA片段。UAS上有GAL4蛋白的结合位点，只有当GAL4和UAS存在于同一个体时，GAL4才能激活与UAS相连接的下游基因的转录。 ①H基因在品系1、2中均不表达，只在两个品系杂交的后代中表达，H基因应该插入到位点 （填“a”、“b”或“c”）。 ②若受体中只有其中一条常染色体上导入一个外来基因，品系1和品系2杂交的F1代中红眼果蝇所占比例为 ，F1代红眼果蝇雌雄杂交得到的F2代中红眼所占比例可能为 。 【答案】(1) 模板 GAACCT (2)分别用引物P1和F3、P2和F2、P3和F1，以北京紫眼果蝇体细胞的总DNA为模板进行PCR，在通过电泳检测产物片段的长度 (3) b 1/4/25% 1/2或9/16 【分析】1、基因的分离定律实质上是指减数分裂产生配子时，一对等位基因随着同源染色体的分离而分离，进入不同的配子，随配子遗传给后代。 2、基因自由组合定律实质上是指减数分裂产生配子时，随着同源染色体携带等位基因分离，非同源染色体携带着非等位基因自由组合。 【详解】（1）为获取h基因，PCR技术中，以北京紫眼果蝇体细胞的总DNA作为模板，以图中的P1、P1作为引物进行PCR扩增，根据引物P1对应的α链的羟基端可推知，与α链结合的引物碱基序列为5'-GAACCT-3'。 （2）由图，结合题意可知，h基因是H基因中插入外来片段形成的，欲探究突变位点在H基因上的位置，可分别用引物P1和F3、P2和F2、P3和F1，以北京紫眼果蝇体细胞的全DNA为模板进行PCR，分段扩增出H基因的相关片段，再通过电泳检测产物片段的长度，若出现长度与H基因的长度不同片段，即不是1200bp、2400bp、3785bp，则对应片段为H基因的突变位点。 （3）①由题意可知，UAS 上有 GAL4 蛋白的结合位点，只有当 GAL4 和 UAS 存在于同一个个体中时，GAL4才能激活与UAS 相连接的下游基因的转录，H基因在品系1、2中均不表达，只在两个品系杂交的后代中表达，则H基因应该插入到位点b，品系1、2的杂交后代同时含有GAL4 和 UAS ，且b位点位于UAS的下游，才能正常表达。 ②若受体中只有其中一条常染色体上导入一个外来基因，在UAS-GAL4系统中，红眼性状表现需要GAL4和UAS同时存在于同一果蝇中才能激活H基因的表达。假设品系1携带GAL4基因，品系2携带UAS-H基因，则在F1代杂交中，同时获得这两部分的比例为1/2（GAL4）×1/2（UAS-H）=1/4。因此F₁代中红眼果蝇比例为1/4。若GAL4与UAS-H在一对同源染色体上（GAL4位于其中一条染色体上，UAS-H位于另一染色体上），则F1杂交产生的F2中红眼为GAL4-UAS-H的概率为1/2，若GAL4与UAS-H位于非同源染色体上，要同时含有GAL4 、UAS和H才能表现出红眼，则杂交得到的F₂代中红眼GAL4-UAS-H比例为9/16。 65．（2025·广东深圳·一模）乳糖操纵子是大肠杆菌中一个经典的基因表达调控系统，该系统在生物工程和分子生物学中有广泛应用。如图表示乳糖操纵子调控结构基因表达的过程，回答下列问题： (1)大肠杆菌会优先利用葡萄糖，同时添加葡萄糖和乳糖的培养基培养大肠杆菌，早期大肠杆菌主要是利用 （填“①”或“②”）途径调控结构基因。当培养基中的葡萄糖消耗完，大肠杆菌开始利用乳糖进行自身代谢，此时乳糖作为 为大肠杆菌提供营养，阻遏蛋白主要与 结合，从而调控结构基因表达。 (2)研究人员对传统乳糖操纵子的阻遏蛋白进行分子内的光控化改造，利用蓝光可以改变阻遏蛋白的结构，如图1。用蓝光照射时，GFP基因的表达情况是 。根据该原理，研究人员构建了如图2基因表达载体，除未标出终止子外，该表达载体缺少的结构是 。 (3)为验证阻遏蛋白光控化改造后的调控效果，研究人员用野生型大肠杆菌、IPTG（诱导物）、光控化改造后的大肠杆菌进行验证实验，请完成以下表格中4组实验的设置情况，表格里填“－”和“+”分别表示不处理和处理。 处理 组别 1 2 3 4 野生型大肠杆菌 光控化改造后的大肠杆菌 IPTG 蓝光 (4)为验证阻遏蛋白光控化改造后的空间控制效果，将光控化改造后的大肠杆菌涂布在培养基上，蓝光环境下用三角形遮光板遮挡培养基（如图），适宜温度下培养一段时间后，描述紫外灯下培养基的实验现象 。若用成功转化后的大肠杆菌构建其他形状的荧光图案，需要进行的调控是 。 培养基遮光示意图（黑色区域为退光区） 【答案】(1) ① 碳源 诱导物（乳糖、别乳糖） (2) GFP基因不表达 光控化改造后的调节基因（表达光控化改造后的阻遏蛋白的基因） (3) 处理 组别 1 2 3 4 野生型大肠杆菌 光控化改造后的大肠杆菌 IPTG － + － － 蓝光 － － + － (4) 显示三角形的荧光区域 用相应图案的遮光板遮盖培养基并用蓝光照射 【分析】转录过程中，需要以DNA的一条链为模板合成mRNA；翻译过程中，需要以mRNA为模板，tRNA运送氨基酸，从而合成多肽链，多肽链经盘曲折叠变成具有一定空间结构的蛋白质。 【详解】（1）根据图示，①途径中调节基因表达的阻遏蛋白阻断了乳糖代谢相关基因的表达。大肠杆菌会优先利用葡萄糖，在同时添加葡萄糖和乳糖的培养基中，早期由于有葡萄糖存在，大肠杆菌主要利用①途径调控结构基因，从而抑制结构基因的表达，优先利用葡萄糖。而利用乳糖需要阻遏蛋白失活等一系列过程（即②途径），在葡萄糖存在时会受到一定抑制。所以早期主要是利用①途径调控结构基因。 当葡萄糖消耗完后，乳糖作为碳源为大肠杆菌提供营养。 阻遏蛋白主要与操纵序列（O序列）结合，当阻遏蛋白结合在O序列上时，会阻碍RNA聚合酶与启动子（P序列）结合，从而抑制结构基因的转录。当有乳糖存在时，乳糖的代谢产物别乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象改变，从O序列上解离下来，结构基因得以表达。 （2）由图1可知，用蓝光照射时，表达受阻，使GFP基因不表达，一个完整的基因表达载体应包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等。图中除未标出终止子外，还缺少光控化改造后的调节基因（表达光控化改造后的阻遏蛋白的基因）。 （3）对于野生型大肠杆菌，只有在有IPTG诱导时才会大量表达相关基因（因为野生型乳糖操纵子需要IPTG等诱导物解除阻遏蛋白对结构基因的抑制），所以在野生型大肠杆菌对应的IPTG列填“+”，蓝光列填“ - ”。 对于光控化改造后的大肠杆菌，在有蓝光照射时，阻遏蛋白构象改变，结构基因可表达，所以蓝光列填“+”；IPTG对其不是必需的，这里可以不处理，即IPTG列填“ - ”。整理如下：用蓝光照射光控化改造后的大肠杆菌，在蓝光环境下用三角形遮光板遮挡培养基，那么被遮光的部分（三角形内部）没有蓝光照射，阻遏蛋白正常结合操纵序列，结构基因不表达；未被遮光的部分有蓝光照射，阻遏蛋白构象改变，结构基因表达产生荧光蛋白。所以在紫外灯下培养基上会出现三角形亮斑（未遮光处有荧光），周围无荧光的实验现象。 若用成功转化后的大肠杆菌构建其他形状的荧光图案，需要进行的调控是根据所需图案设计相应的遮光装置，通过控制蓝光的照射区域来实现对不同部位大肠杆菌基因表达的调控，从而使大肠杆菌在不同区域按预期表达荧光蛋白形成特定形状。 66．（2025·广东汕头·一模）水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器(下图)，为环境污染治理提供新方法。 回答下列问题： (1)Pc和Ps启动子可被 酶识别并结合后驱动基因的模板链沿3′→5′方向转录出mRNA。分析图上图可知，当环境中存在水杨酸时， 可激活PS启动子，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。 (2)研究人员改造重组质粒，选择激活能力更强的蛋白的基因nahR1替代nahR，实现在相同浓度的水杨酸条件下荧光强度扩大为原来的2倍，提高传感器的灵敏度。该改造过程需要用到的工具酶是 。请提出另一种改造重组质粒以提高传感器灵敏度的思路： 。 (3)水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基因与mrfp基因连接成融合基因，则工程菌可同时实现对水杨酸的动态检测和清除。现欲通过PCR判定融合基因已准确连接，应选择如图中的引物组合是 。 (4)工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdB两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdA、ccdB分别插入下图中的 、 位点。 【答案】(1) RNA聚合酶 水杨酸-调控蛋白复合物 (2) 限制酶和DNA连接酶 ①选择灵敏度更高的启动子替代PS；②在mrfp基因前插入提高表达效率的DNA序列 (3)引物1和3 (4) E(或F) B(或C) 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，所以Pc和Ps启动子可被RNA聚合酶识别并结合后驱动基因的模板链沿3'→5' 方向转录出mRNA。从图中可知，当环境中存在水杨酸时，水杨酸-调控蛋白复合物可激活PS启动子，启动基因表达红色荧光蛋白，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。 （2）基因工程中用到的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶，改造重组质粒，用基nahR1因替代nahR，需要先用限制性核酸内切酶切割质粒和基因，再用 DNA 连接酶将基因连接到质粒上，所以该改造过程需要用到的工具酶是限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶。另一种改造重组质粒以提高传感器灵敏度的思路可以是：选择灵敏度更高的启动子替代PS，在mrfp基因前插入提高表达效率的DNA序列，使启动子能更高效地启动下游基因表达，从而提高红色荧光蛋白的表达量，增强荧光强度。 （3）PCR 技术要求引物与模板链的 3' 端互补配对，且 DNA 聚合酶从引物的 3' 端开始延伸子链。要判定水杨酸羟化酶基因与基因连接成的融合基因已准确连接，需要选择能扩增出融合基因的引物组合。引物1 和引物3可以分别与融合基因中水杨酸羟化酶基因的 3' 端和基因的 3' 端互补配对，从而扩增出融合基因，所以应选择的引物组合是引物1和引物3。 （4）ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，为了保证在水杨酸存在时工程菌正常生存，ccdA应插入在Ps启动子之后，即图中的E（或F）位点，这样在水杨酸存在时，Ps启动子启动，ccdA基因表达抗毒素蛋白；ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，当水杨酸被耗尽时，Ps启动子不再启动，此时要让工程菌启动“自亡”，ccdB应插入在Pc启动子控制的区域，所以应插入Pc启动子之后，即图中的B（或C）位点。 67．（2025·四川巴中·一模）草甘膦是一种应用广泛、高毒高效且可生物降解的除草剂。研究人员在施加草甘膦的土壤中发现某种细菌体内存在抗草甘膦的EPSPS基因，并利用农杆菌转化法将该基因转入匍匐剪股颖(一种常用于高尔夫球场的草坪草)，从而获得对草甘膦具有抗性的转基因匍匐剪股颖。EPSPS基因编码区的非模板链序列为5′-ACTATG……GCTGCC-3′，针对该序列设计的一对引物FP和RP可用于EPSPS基因的PCR扩增。获得转基因匍匐剪股颖的过程如图所示。请回答下列问题：    (1)研究人员利用Ti质粒构建基因表达载体时，需在EPSPS基因的上游导入有特殊序列结构的启动子，启动子的作用是 ；图中引物FP的序列为5′- -3′(只写出前6位碱基)。 (2)图中的选择培养基需添加 从而只允许从农杆菌中获得了T-DNA的植物细胞增殖，SIM培养基通常具有较高浓度的 ，能够促进植物体芽的形成。 (3)抗草甘膦的转基因作物可能由于基因流动影响生态安全。研究人员将一高尔夫球场作为控制区，种入抗草甘膦匍匐剪股颖，在控制区外不同位点(如图所示)种植了若干株非转基因的匍匐剪股颖和亲缘物种作为哨兵植物。为确定转基因作物向其同种或亲缘物种转移EPSPS基因的情况，一段时间后需将用于监测的哨兵植物的种子收集并培育成幼苗，请写出从分子水平上检测EPSPS基因是否流入幼苗的方法： (答出一种即可)；经检测后发现EPSPS基因流动的最大距离在匍匐剪股颖和亲缘物种中分别为21公里和14公里，请推测哨兵植物主要放置在顺风向的原因是： ；基于上述分析，提出一条有效防止转基因污染的策略： 。    【答案】(1) RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录过程 ACTATG (2) 草甘膦 细胞分裂素 (3) 提取幼苗叶片中的DNA为模板，利用针对EPSPS基因设计的特定引物进行PCR并电泳(其他合理答案均可) 花粉可以随风传播到较远的距离，从而造成基因流动 将玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，由于α-淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，从而防止转基因花粉的传播(或通过设置隔离带来防止转基因花粉传播到其他植物) 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）基因表达载体除了目的基因、标记基因外，还必须有启动子，启动子是有一段特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。转录产生的mRNA序列与模板链序列配对，已知EPSPS基因编码区的非模板链序列为5′-ACTATG……GCTGCC-3′，图中FP引物位于启动子一侧，引物的方向为5′3′，故FP引物的序列与非模板链序列一致，前6位碱基为ACTATG。 （2）为了筛选出经转基因技术获得的对草甘膦具有抗性的转基因匍匐剪股颖细胞，图中的选择培养基需添加草甘膦；培养基中一般含有生长素和细胞分裂素，其中高浓度的细胞分裂素（细胞分裂素与生长素比值大于1）能诱导植物体芽的形成。 （3）若要从分子水平上检测EPSPS基因是否流入幼苗，则应以EPSPS基因为检测对象，提取幼苗叶片中的DNA为模板，利用针对EPSPS基因设计的特定引物进行PCR并电泳，若出现特异性条带，则说明待测幼苗存在EPSPS基因。实验目的是要检测EPSPS基因流动的最大距离，故应将哨兵植物主要放置在顺风向，这样花粉可以随风传播到较远的距离，从而造成基因流动。若要有效防止转基因污染，则需要阻断转基因植物的花粉传播，一是使花粉败育，二是阻断花粉传播，方法如：将玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，由于α-淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，从而防止转基因花粉的传播(或通过设置隔离带来防止转基因花粉传播到其他植物)。 68．（2025·山西·一模）碱基编辑系统是一种新型基因修饰技术，通过在双链造成单切口后对碱基进行单一碱基的精准替换，提高单碱基编辑的精确性及效率，为家畜育种的精确基因修饰提供了一种更简单、更有效的方法。胞嘧啶碱基编辑器（CBE）能将G-C碱基对替换为A-T碱基对，作用模式如图。请回答下列问题：    (1)CBE的作用原理是 。欲将G-C碱基对最终替换为A-T碱基对，丙还需要复制 次。 (2)肌肉生长抑制素（MSTN）可抑制肌细胞的增殖与分化。科研人员利用碱基编辑工具成功改变哈萨克羊MSTN基因，使终止密码子提前出现，显著增加了肌肉纤维的直径和数量，获得改良品种。 ①用改造后的基因构建表达载体时，还需要在该基因的上游和下游分别添加 和 ，使用的工具酶有 ；构建的表达载体通过 的方式导入哈萨克羊的 中。 ②改造后的MSTW基因表达的蛋白质肽链比MSTN要 （填“长”或“短”），失去其应有的功能。 【答案】(1) 基因突变 2 (2) 启动子 终止子 限制酶和DNA连接酶 显微注射 受精卵 短 【分析】1、动物细胞培养：在动物细胞的培养液中需加入有机盐、无机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸及血清（两盐、两素、两酸、一血清 ），以保证细胞的正常生命活动。 2、胚胎移植：一般将胚胎培养到桑葚胚或囊胚时期即可进行移植，在移植之前可以进行胚胎性别鉴定确定胚胎性别，也可以进行胚胎分割，增加胚胎数目，但是注意在分割时需要将胚胎的内细胞团均等分割，保证分割后胚胎发育正常。 【详解】（1）依据题意可知，胞嘧啶碱基编辑器（CBE）将G-C碱基对替换为A-T碱基对，说明在基因结构中发生了碱基对的替换，属于基因突变；CBE精准替换时，先将G-C碱基对中的C置换成U，即丙图所示，接着进行复制时，碱基U对应碱基A，再复制一次，碱基A对应碱基T，最终将G-C碱基对彻底替换为A-T碱基对，所以还需要复制2次。 （2）①通过CBE改造的基因即为目的基因，构建基因表达载体时，需要在目的基因的上游添加启动子和下游添加终止子，需要使用的工具酶有限制酶和DNA连接酶。基因表达载体导入动物体内常用显微注射法导入受精卵中。 ②利用碱基编辑工具成功改造了哈萨克羊MSTN基因，结果使该基因转录来的mRNA在翻译时提前遇到终止密码子，导致其表达蛋白的肽链变短，蛋白结构发生改变，导致哈萨克羊的肌肉纤维的直径和肌纤维数量增加，获得改良哈萨克羊新品种。 69．（2025·吉林延边·一模）药物A是从某植物体叶肉细胞中提取的一种蛋白质，对治疗糖尿病具有良好的疗效。某研究团队运用生物工程相关技术，利用大肠杆菌来生产这种药物。回答下列问题。 (1)科学家根据药物A的氨基酸序列人工合成DNA片段，由于 ，该方法得到的DNA片段有多种可能，也可以用PCR技术从植物细胞中扩增出药物A基因，该技术的原理为 。 (2)下图表示制备工程菌时所使用的质粒、目的基因的结构及其相关限制酶识别位点（限制酶的识别序列和切割位点如表所示），其中lacZ基因表达的产物可将无色物质X-gal催化为蓝色物质，从而使菌落呈现蓝色。回答下列问题。    注：kb代表碱基对，Kanr基因为卡那霉素抗性基因 限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ Sau3AⅠ SmaⅠ XmaⅠ 识别序列和切割位点 -G↓GATCC- -G↓AATTC- -↓GATC- -CCC↓GGG- -C↓CCGGG- ①利用PCR技术获取和扩增目的基因，已知待扩增的目的基因两侧相关序列如下，扩增时选用的两种引物碱基序列为（注明序列的5′和3′端） 、 。    ②分析上图，为将目的基因准确插入质粒中，最好选用 酶切割目的基因，酶切处理后的目的基因和质粒需使用 （填“T4”、“E.coli”或“T4或E.coli”）DNA连接酶处理，才能得到重组质粒。 ③将目的基因导入受体菌时，若要准确筛选出含重组质粒的受体菌，需要将其培养在添加了 的培养基上。 ④若将重组质粒用EcoRⅠ充分酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离，可得到长度为 bp的条带。对于琼脂糖凝胶电泳结果符合预期的PCR产物条带，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。 【答案】(1) 一种氨基酸可能有多种密码子编码（密码子具有简并性） DNA半保留复制 (2) 5′-TCTGTT-3′ 5′-CTTGGA-3′ BamH Ⅰ和Xma Ⅰ T4或E.coli 卡那霉素和X-gal 1700bp和260bp 琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待测DNA分子大小，无法确定待测DNA分子碱基序列。 【分析】基因工程是指按照人们的原望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。基因工程的基本操作程序：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）由于密码子具有简并性，即同一种氨基酸可以对应多种密码子，因此，根据药物A的氨基酸序列人工合成DNA片段的方法得到的DNA片段有多种可能。PCR技术是体外扩增DNA的技术，该技术的原理是DNA的半保留复制。 （2）①由于DNA复制时子链的延伸是从5′端向3′端延伸，含磷酸基团的一端为5′端，含羟基的一端为3′端，因此两个引物的设计需要分别根据模板DNA两条链的3′端进行设计，因此，依据图中目的基因两侧相关序列，扩增时选用的引物碱基序列为5′-TCTGTT-3′和5′-CTTGGA-3′。 ②目的基因与质粒形成重组分子要有相同的末端，且目的基因应插入启动子和终止子之间才能在受体细胞中表达。终止子与启动子之间有三种限制酶识别序列：EcoR I、Xma I和BamH I。据图可知，EcoR I会破坏目的基因，故为将目的基因准确插入质粒中，最好选用Xma I和BamH I切割目的基因。Xma I和BamH I切割得到的是黏性末端，用T4或E.coli DNA连接酶处理均可，都可以得到重组质粒。 ③由图可知，质粒中含有LacZ基因和卡那霉素抗性基因，在构建基因表达载体时LacZ基因被破坏，无法使无色的X-ga1变为蓝色。因此，在培养基中应加入的物质有卡那霉素和X-gal，只有成功导入目的基因的重组质粒的细菌才能不被卡那霉素杀死，同时表现为无色菌落。 ④根据质粒和目的基因中EcoR Ⅰ的酶切位点可知，正向连接后用EcoR Ⅰ切割，可以得到两个片段分别为400+700+600=1700bp，10+50+200=260bp，故通过琼脂糖凝胶电泳分离后，可得到长度为1700bp和260bp的条带。对于电泳结果符合预期的PCR产物条带，通常需进一步通过基因测序确认，这是因为琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此需要对目标DNA进行碱基序列的确认。 70．（2025·四川·一模）构建可降解多环芳烃的转基因大肠杆菌是解决在石油及页岩油开采过程中多环芳烃污染的手段之一。科研人员利用从石油中分离得到的石油降解菌，通过 PCR 扩增的方法得到邻苯二酚1，2 双加氧酶(C12O)基因片段，再将C12O基因连接到载体pET-28a转入大肠杆菌中，期望获得可降解多环芳烃的转基因大肠杆菌。相关信息如图所示。    (1)从石油降解菌基因组 DNA中PCR 扩增目标基因 C12O时，每次循环的步骤一般可以分为 。PCR扩增时，图示中四种引物可以扩增 种不同长度的目标基因片段。 (2)为将扩增后的目标基因C12O插入载体pET-28a.后与卡拉霉素抗性基因读取方向一致，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在R1、R2 和R3末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在Rx末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从C12O基因扩增到载体pET-28a构建完成的整个过程除了需要多种限制酶以外还需要 酶。 (3)与图中载体pET-28a上卡拉霉素抗性基因的启动子结合的酶是 。将构建的载体pET-28a成功导入大肠杆菌后，含R1、R2与 Rx扩增产物的大肠杆菌能够有效降解多环芳烃，含R3与 Rx扩增产物的大肠杆菌不能降解多环芳烃。含 R3与 Rx扩增产物的大肠杆菌不能降解多环芳烃的原因可能是 。 【答案】(1) 变性、复性和延伸 3 (2) EcoR Ⅰ Sal Ⅰ TaqDNA聚合酶和DNA连接 (3) RNA聚合酶 引物R3与引物Rx扩增出的目标基因序列丢失了C12O基因正常表达的调控及启动子的关键序列，导致目标基因C12O无法正常表达 【分析】①PCR技术每次循环的步骤一般分为变性、复性和延伸；变性是使DNA双链解开为单链；复性是引物与单链DNA结合；延伸是以引物为起点，在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链； ②基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）①PCR技术每次循环的步骤一般分为变性、复性和延伸；变性是使DNA双链解开为单链；复性是引物与单链DNA结合；延伸是以引物为起点，在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。 ②根据图中引物的位置和方向，四种引物可以扩增出3种不同长度的目标基因片段，分别是R1与Rx、R2与Rx、R3与Rx扩增产物。 （2）①②据题意可知，为将扩增后从目标基因C12O插入载体pET-28a后与卡拉霉素抗性基因读取方向一致，扩增后的产物中Rx端与与卡拉霉素抗性基因的启动子一端连接，要做到定向插入，则需要在引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别切割后，两端的黏性末端不能相同；据图可知，扩增后的目的基因产物中可能含有Mun Ⅰ和Xho Ⅰ的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶Mun Ⅰ和Xho Ⅰ所识别，因此应该选择添加限制酶EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ的识别序列；对载体使用限制酶EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ切割，Rx末端添加的序列所对应的限制酶是Sal Ⅰ，在R1、R2和R3末端添加的序列所对应的限制酶是EcoR Ⅰ，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体； ③本实验中，从C12O基因扩增到载体pET-28a构建完成的整个过程中，除了需要多种限制酶切割目的基因和载体外，还需要TaqDNA聚合酶进行PCR扩增，以及DNA连接酶将目的基因和载体连接起来。 （3）①与启动子结合的酶是RNA聚合酶，它能以DNA为模板合成RNA，启动基因的转录过程； ②含R3与Rx扩增产物的大肠杆菌不能降解多环芳烃的原因可能是引物R3与引物Rx扩增出的目标基因序列丢失了C12O基因正常表达的调控及启动子的关键序列，导致目标基因C12O无法在大肠杆菌内正常表达，从而细胞不能合成邻苯二酚1，2 双加氧酶，无法降解多环芳烃。 71．（2025·陕西西安·一模）某科研人员将甜蛋白基因导入番茄，可提高番茄甜味，改善果实品质。如图为甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切位点示意图。回答下列相关问题： (1)利用PCR技术扩增甜蛋白基因时，为了特异性扩增甜蛋白基因序列，需根据 设计引物；每次循环一般可以分为 、 、 三步。 (2)用限制酶切割含有甜蛋白基因的DNA片段时，不用限制酶BamHⅠ的原因是 。科研人员最终选择了限制酶XbaⅠ和HindⅢ切割质粒和含有甜蛋白基因的DNA片段，而不是选择限制酶XbaⅠ和EcoRⅠ的理由是 。 (3)为了让甜蛋白基因进入受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上，可以将甜蛋白基因插入Ti质粒的 中。将基因表达载体导入农杆菌前，需用Ca2+处理农杆菌，其目的是 。为了确定农杆菌中是否导入基因表达载体，需将农杆菌置于含 的培养基中进行培养，然后用筛选出来的农杆菌去侵染番茄细胞。 【答案】(1) 甜蛋白基因两端的碱基序列 变性 复性 延伸 (2) 会破坏甜蛋白基因 会导致甜蛋白基因与质粒反向连接，不能表达出甜蛋白 (3) T-DNA 使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 卡那霉素 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）利用PCR扩增目的基因时，需要根据目的基因两端的碱基序列设计引物，因此为了特异性扩增甜蛋白基因序列，需根据甜蛋白基因两端的碱基序列设计引物。 通过PCR技术可扩增目的基因，PCR的每次循环一般可以分为变性、复性、延伸三步。 （2）由图可知，限制酶BamH I切割会破坏甜蛋白基因，不宜使用。在Ti质粒中，EcoR I位于Xba I的左侧，根据甜蛋白基因转录的方向和Ti质粒启动子到终止子的方向，应选择限制酶Xba I和Hind Ⅲ切割质粒和含有甜蛋白基因的DNA片段，选择限制酶Xba I和EcoR I会导致甜蛋白基因与质粒反向连接，不能表达出甜蛋白。 （3）Ti质粒的T-DNA是可转移的DNA，能够携带目的基因进入受体细胞并将其整合到受体细胞的染色体的DNA上。将基因表达载体导入农杆菌，需用Ca2+处理，使其成为感受态细胞，提高转化率。分析图形，质粒中存在卡那霉素抗性基因，因此需在培养基中加入卡那霉素，筛选出成功导入目的基因的农杆菌。 72．（2025·江西新余·一模）土壤盐分过高对植物的伤害作用称为盐胁迫。SOS信号转导途径是介导盐胁迫下细胞外排Na+，维持Na-/K+平衡的重要调节机制。盐胁迫出现后，磷脂分子（PA）在质膜迅速聚集并与能催化底物磷酸化的蛋白激酶SOS2结合，致使SOS2接触激活钠氢转运蛋白SOS1，并使钙结合蛋白SCaBP8磷酸化，具体调节机制如图所示。请回答下列问题： (1)盐胁迫下，通过SOS信号转导途径，细胞内的Na+/K+比值 （填“升高”或“降低”），据图推测磷酸化的SCaBP8的作用机理 。 (2)科学家通过基因工程在水稻中过量表达SOS1蛋白，以期增强水稻抗盐能力。 ①为获得编码SOS1蛋白的基因，可提取野生型水稻总RNA，通过 获得模板DNA，再经PCR获得SOS1基因片段。 ②测序表明，SOS1基因中A+T含量占53%，模板链中C的含量为26%，那么编码链（非模板链）中C的含量为 %。 ③构建表达载体时，在下图所示载体含有的限制酶识别位点插入SOS1基因。序列分析发现SOS1基因内部有XbaⅠ的识别序列，为使载体中SOS1基因和绿色荧光蛋白基因正确表达，应在SOS1基因两端分别添加 两种限制酶的识别序列，将SOS1基因插入载体前，应选用 两种限制酶对载体酶切。 【答案】(1) 降低 减缓了对AKT1的抑制作用，使得细胞内K+浓度增大 (2) 逆转录 21 Spe Ⅰ、EcoR Ⅰ Xba Ⅰ、EcoR Ⅰ 【分析】转运蛋白可以分为载体蛋白和通道蛋白两种类型： （1）载体蛋白只容许与自身结合部位相适应的分子或离子通过而且每次转运时都会发生自身构象的改变； （2）通道蛋白只容许与自身通道的直径和形状相适配、大小和电荷相适宜的分子或离子通过。分子或离子通过通道蛋白时，不需要与通道蛋白结合。 【详解】（1）盐胁迫下，通过SOS信号转导途径，排出Na+，排入K+，细胞内的Na+/K+比值降低，磷酸化的SCaBP8减缓了对AKT1的抑制作用，使得细胞内K+浓度增大。 （2）①为获得编码SOS1蛋白的基因，可提取野生型水稻总RNA，通过逆转录获得模板DNA，再经PCR获得SOSI基因片段。 ②SOSI基因中A+T含量占53%，则模板链中A+T含量也占53%，模板链中C的含量为26%，则模板链中G的含量为21%，则编码链（非模板链）中C的含量也为21%。 ③由图可知，荧光蛋白基因内部存在Spe Ⅰ和BamH Ⅰ两种限制酶切序列，因此对载体酶切时不能选择这两种酶，并且不能选择限制酶SmaⅠ，否者会导致载体中SOS1基因和绿色荧光蛋白基因不能正确表达，故选择Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶对载体酶切，由于SOS1基因内部有Xba I的识别序列，故不能选择限制酶Xba I对目的基因酶切，但需要目的基因有与载体相同的黏性末端，故可在SOSⅠ基因两端分别添加Spe Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶两种限制酶的识别序列。 生物技术的伦理和安全考点02 一、单选题 1．（2025·宁夏银川·一模）生物技术就像一把“双刃剑”，它既可以造福人类，也可能在使用不当时给人类带来潜在的危害。下列叙述错误的是（    ） A．研究转基因农作物时应采取多种方法防止转基因花粉的传播，避免基因污染 B．干细胞培养在临床医学等领域前景广泛，但也可能面临一些问题，如存在导致肿瘤发生的风险 C．生物武器是用病毒类、干扰素及生化毒剂类等来形成杀伤力 D．反对设计试管婴儿的原因之一是避免有人滥用此技术选择性设计婴儿 【答案】C 【分析】1、生物技术安全性问题包括食物安全、生物安全、环境安全三个方面。 2、伦理问题主要在克隆人的问题上出现争议。 【详解】A、研究转基因农作物时应采取多种方法防止转基因花粉的传播，避免基因污染，符合生物技术的安全与伦理规范，A正确； B、干细胞培养在临床医学等领域前景广泛，比如用于治疗一些疑难疾病，但由于干细胞的分化和增殖等特性，也可能面临安全性问题，如免疫排斥、肿瘤形成等，B正确； C、生物武器是指利用致病菌类、病毒类和生化毒剂类等作为战争武器，危害极大，干扰素不是生物武器，C错误； D、为了防止有人滥用设计试管婴儿技术选择性设计婴儿性别，我国反对设计试管婴儿，D正确。 故选C。 2．（2025·安徽马鞍山·一模）为提高水稻的产量，科研人员将四种基因（EcCAT、OsGLO1、EcGCL、TSR）与叶绿体转运肽基因连接，构建多基因表达载体，引导合成的蛋白质定向运输至叶绿体，从而在水稻叶绿体内构建了一条新的代谢途径。下列说法正确的是（　　） A．T-DNA插入到水稻的染色体DNA中可能会影响水稻自身基因的表达 B．含卡那霉素的培养基上不能存活的水稻细胞未成功导入四种目的基因 C．限制酶识别特定的序列具有专一性，DNA连接酶不具有专一性 D．目的基因产物转运至叶绿体，避免了目的基因通过花粉转移到近缘植物 【答案】A 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建（核心）；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、T-DNA插入到水稻染色体DNA中的位置是随机的，可能会破坏原有基因结构，影响该基因表达，A正确； B、含卡那霉素的培养基上不能存活的植物受体细胞可能未成功导入载体，但不能确定未成功导入四种目的基因，据图可知卡那霉素抗性基因在载体的非T-DNA区域，即使T-DNA携带目的基因导入成功，卡那霉素抗性基因也不会导入，B错误； C、酶都具有专一性，DNA连接酶只能连接两个DNA片段，催化形成磷酸二酯键，因此具有专一性，C错误； D、目的基因借助叶绿体转运肽转运到叶绿体中，避免了目的基因通过花粉（有细胞核，不含叶绿体）转移到近缘植物，D错误。 故选A。 3．（2025·安徽黄山·一模）抗虫和耐除草剂玉米“双抗12-5”是我国自主研发的转基因品种。在转基因产品的研发、生产、销售等环节，可采用PCR技术进行基因监测，为转基因生物安全监管提供依据。下列叙述错误的是（    ） A．PCR开始阶段的预变性可使模板DNA变性更充分 B．PCR循环过程中，复性的目的是使DNA聚合酶与模板相结合 C．进行PCR基因监测时，应使用待检目的基因的特征序列作为引物 D．安全监管中，应阻止检测出转基因扩增产物的非转基因标识农产品上市 【答案】B 【分析】PCR过程为：①变性，当温度上升到90℃以上时，氢键断裂，双链DNA解旋为单链；②复性，当温度降低到50℃左右是，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸，温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【详解】A、预变性是使模板DNA充分变性，在变性过程中氢键断裂，双链DNA解旋为单链，A正确； B、PCR循环过程中，复性的目的是使引物与模板相结合，B错误； C、进行PCR基因监测时，应使用待检目的基因的特征序列作为引物，保证能获得目的基因，C正确； D、转基因产品需要进行安全评估才能上市，所以安全监管中，应阻止检测出转基因扩增产物的非转基因标识农产品上市，D正确。 故选B。 4．（2025·浙江温州·一模）下列关于生物技术安全与伦理问题的叙述，错误的是（   ） A．我国禁止进行任何生殖性克隆人实验 B．治疗性克隆不会产生道德、伦理问题 C．我国反对生物武器的研发、生产和扩散 D．转基因食品存在引发过敏的风险 【答案】B 【分析】转基因生物的安全性问题：食物安全（滞后效应、过敏源、营养成分改变）、生物安全（对生物多样性的影响）、环境安全（对生态系统稳定性的影响）。 【详解】A、中国政府的态度是禁止生殖性克隆，坚持四不原则（不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验），A正确； B、治疗性克隆处于某种目的进行生殖性克隆，但仍可能产生道德、伦理问题，B错误； C、生物武器危害大，我国反对生物武器及其技术和设备扩散，C正确； D、转基因食品会产生过敏原，可能存在存在引发过敏的风险，D正确。 故选B。 二、多选题 5．（2025·江西·一模）除草剂有效成分草甘膦的作用机理是和PEP竞争性结合EPSP合酶，从而扰乱生物体的正常氮代谢。但作为一种非选择性除草剂，草甘膦对农作物同样具有杀伤作用，这大大限制了其在农业生产中的应用，培育抗草甘膦作物将会解决这一难题。下列说法错误的是（    ） A．长期使用草甘膦除草剂，会导致杂草产生抗除草剂突变，降低除草剂的效果 B．根据草甘膦的作用机理，可通过导入强启动子使EPSP合酶过量表达获得抗草甘膦作物 C．可通过蛋白质工程直接替换EPSP合酶个别氨基酸，使草甘膦无法与EPSP酶结合 D．在培育抗草甘膦作物时，为避免外源基因流入杂草，最好将外源基因插入细胞核基因组 【答案】ACD 【分析】1、蛋白质工程的基本原理：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 2、现代生物进化理论的内容：适应是自然选择的结果;种群是生物进化的基本单位；突变和基因重组提供进化的原材料，自然选择导致种群基因频率的定向改变，进而通过隔离形成新的物种；生物进化的过程实际上是生物与生物、生物与无机环境协同进化的过程；生物多样性是协同进化的结果。 【详解】A、杂草中原本存在抗除草剂突变，除草剂起选择作用，长期使用除草剂，抗除草剂个体数量增多，表现为抗药性下降，A错误； B、草甘膦的作用机理是和PEP竞争性结合EPSP合酶，通过导入强启动子使EPSP合酶过量表达，可以和草甘膦结合，并且有足够的酶满足自身代谢需要，B正确； C、可利用蛋白质工程改造EPSP合酶的基因，使其表达产物与草甘膦无法结合，但是可以和PEP结合，达到抗草甘膦的效果，不能直接替换氨基酸，C错误； D、在培育抗草甘膦作物时，为避免外源基因流入杂草，最好将外源基因插入细胞质基因组，D错误。 故选ACD。 试卷第1页，共3页 1 / 105 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$