3.2 基因工程的基本操作程序(第1课时）-2024-2025学年高二生物同步高效教学课件（人教版2019选择性必修3）

3.2 基因工程的基本操作程序 “抗虫棉之父” 郭三堆 苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白(Bt 抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫(P76) 1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理？ 2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ P77 [相关信息] 培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？ 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡 Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。 从社会中来 培育转基因抗虫棉的简要过程 与载体拼接 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 （有抗虫特性） 导入 抗虫基因 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 表达Bt基因 基因工程的基本操作程序 将目的基因导入受体细胞 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 目的基因的检测与鉴定 有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用 载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化 才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达 （核心） 一.目的基因的筛选与获取 (1)概念： 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物 等的基因。 (2)种类： 与生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。 科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。 目的基因(Bt 抗虫蛋白基因，简称: Bt 基因) 那么，如何筛选目的基因呢？ 1、目的基因 用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害 也对Bt基因的表达产物——Bt 抗虫蛋白有了较为深入的了解 苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关 不仅掌握了Bt 基因的序列信息 Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因 一.目的基因的筛选与获取 2、①筛选合适的目的基因 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 测序技术 测定核酸和蛋白质序列 序列数据库 以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库 序列比对工具 把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能 认识基因结构和功能的技术方法: 随着测序技术的发展，以及序列数据库(GenBank)、序列比对工具(如BLAST)、公共生物医学数据库、分析分子及基因组数据的软件工具NCBI等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 明确了目的基因后，该怎么获得它呢？ 基因1 基因2 基因3 基因通常是有遗传效应的DNA片段 DNA片段 内含子 外显子 非编码区 编码区 启动子 终止子 真核生物基因 放大 启动子 终止子 原核生物基因 非编码区 非编码区 编码区 非编码区 知识链接 ②获取目的基因的方法 利用PCR获取和扩增目的基因 利用PCR获取和扩增目的基因（常用） 人工合成 从基因文库中获取 10 1. 结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？ 2. 总结出PCR的概念、原理、目的、优点。 3. 构建出PCR的大致过程。 4. PCR扩增为什么需要引物？ 5. 如何对产物进行鉴定？ 6. PCR技术与DNA复制过程比较？ 合作探究：请同学们自主阅读教材P76-77，小组合作思考讨论完成问题。 【重温】DNA体内复制的过程及条件 合成子链 解旋 形成新DNA 参与的组分 在DNA复制中的作用 DNA母链 4种脱氧核苷酸 解旋酶 DNA聚合酶 引物 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 打开DNA双链 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 PCR技术： PCR是_______________的缩写，是一项根据________________ 的原理，在_____提供参与DNA复制的_________与_________，对______________________进行_________的技术 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外 各种组分 反应条件 目的基因的核苷酸序列 大量复制 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪/PCR仪） 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 原理 操作环境 目的 全称 PCR扩增仪 3. 利用PCR获取和扩增目的基因 参与的组分 在DNA复制中的作用 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端 开始连接脱氧核苷酸 缓冲液（含Mg2+） DNA母链 4种脱氧核苷酸 90℃以上高温 耐高温的DNA聚合酶 引物 激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 （2种） （Taq 酶） PCR技术 课本P77-79 ①体外复制（PCR）的条件 90 50 72 ℃ 3` 5` 5` 3` 耐高温的DNA聚合酶 引物1 引物2 4种脱氧核苷酸 模板DNA 目的基因 主要是DNA单链或RNA 思考：1、需要引物的原因？需要几种？化学本质？ DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA链。2种。 2、这2种引物的碱基序列有什么要求？ ①能与目的基因的一段碱基序列互补配对，通常为20-30个核苷酸； ②每种引物内部不能发生局部碱基互补配对（防止环化、折叠等），2种引物之间不能发生局部碱基互补配对。 ②PCR过程 90 50 72 ℃ 延伸 90 50 72 ℃ 变性 90 50 72 ℃ 退火 （复性） PCR仪实质上是一台自动调控温度的仪器。 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ ①变性 当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链 ②复性 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 ③延伸 当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ ②PCR过程: 第二轮循环的产物 第三轮的产物 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 第一轮循环的产物 3’ 5’ 3’ 5’ PCR扩增过程中引物、原料需要源源不断的加入。 由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。 即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。 思考: 获取目的基因时至少要经过几次循环才能分离出目的基因？ 复性的过程此时会不会出现DNA解开的两条链结合的情况？如何避免？ PCR可以扩增mRNA吗? 会，但是概率较低。可以加入足够多的引物降低概率。 3次 mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 ①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子； ②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA； ③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA 1、目标片段的DNA分子经PCR反应循环n次，DNA分子有 个。DNA链有_____条 共需要消耗引物的数量为 个。n代后，完整的目的基因有 个 2、运用PCR技术扩增DNA分子时，需经过变性→复性→延伸→重复过程，经过4轮循环后，得到的子代 DNA 分子中，不同时含有两种引物的 DNA 分子占 。 3、利用PCR技术可以扩增目的基因，PCR反应体系中除含缓冲液、模板 DNA、dNTP、耐高温的DNA酶、引物等。其中引物应选用图中的 （填图中标号）。 PCR过程中关于引物的几个问题： 2n+1-2 1/8 A、D 2n 2n+1 2n-2n ②PCR技术扩增过程小结 a、变性(超过90℃):双链DNA模板在热作用下， 断裂，形成 。 b、复性(下降到50℃):系统温度降低，引物与DNA模板通过碱基互补配对， 形成局部 。 c、延伸(上升到72℃):以单链DNA为模板，溶液中的 在 的作用下，根据碱基互补配对原则，合成与模板 互补的 的新的DNA链。 氢键 单链DNA 双链 4种脱氧核苷酸 5′端→3′端 耐高温的DNA聚合酶 ⑤反应的结果：以_______方式扩增，即______（n为扩增循环的次数） 指数 2n ⑥采用 来鉴定PCR的产物。 琼脂糖凝胶电泳 凝胶电泳原理与结果图 比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术 区别 解旋方式 场所 酶 温度 结果 联系 解旋酶催化 主要在细胞核内 解旋酶、DNA聚合酶等 细胞内温和条件 合成整个DNA分子 ①模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料：均为四种脱氧核苷酸 ③酶：均需DNA聚合酶 ④引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成 DNA在高温下变性解旋 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 耐高温的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶） 控制温度，需在不同温度下进行 扩增特定的DNA片段或基因 在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可提供合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量 脱氧核苷三磷酸 PCR技术扩增时需要能量，所需要的能量可由dNTP提供，无需添加ATP PCR技术与细胞内DNA复制的比较 PCR不需解旋酶、 可在短时间内大量扩增目的基因（高效快速）、易于操作 (1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应 （　 　） (2)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚 （　 　） (3)PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温 （　 　） (4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高 （　 ） (5)PCR扩增过程中，需要添加ATP为新链合成提供能量（ ） (6)PCR扩增过程中，通过温度变化的控制为变性、复性和延伸等过程提供能量（ ） 1.判断常考语句，澄清易混易错 温度不能为变性、复性和延伸等过程提供能量 PCR技术扩增时需要能量，所需要的能量可由dNTP提供 1.下图表示利用PCR技术扩增目的 基因的部分过程，其原理与细胞内 DNA复制类似。下列叙述错误的 是（ ） A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端 B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因 D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4 D 7/8 2.(2021·湖北卷)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　) A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度 D 3（2021·全国甲卷·高考真题）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作： ①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA； ③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题： （1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是 （用数字序号表示）。 （2）操作③中使用的酶是____________________________。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、 三步，其中复性的结果是 。 （3）PCR（多聚酶链式反应）技术是指________________________________________________________________________________________________________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______________。 一项根据DNA半保留复制的原理，在体外参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术 ④②③① Taq酶(耐高温的DNA聚合酶） 延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 复性(或退火) 获得足量的目的基因后，能否直接将目的基因导入受体细胞呢？ 思考讨论 就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解 不能原因 那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？ 确保基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代； 使目的基因能够表达和发挥作用。 1、目的： ——基因工程的核心 P80 思考：要想目的基因实现以上功能，载体还需要哪些结构？ 2、基因表达载体的组成 思考：各个元件有什么作用？ 二.基因表达载体的构建 ①目的基因： ③启动子： ④终止子： ②标记基因： 控制特定性状或表达特定产物。 位于基因的首端, 是RNA聚合酶结合位点，启动转录 位于基因的末端，终止转录。 用来鉴别或筛选含有重组DNA分子的细胞 ⑤复制原点：DNA聚合酶结合位点。 二.基因表达载体的构建 目的基因该插入什么位置？ 启动子和终止子之间的部位 启动子与终止子位于DNA分子中， 作用：起始和终止转录过程。 启动密码子与终止密码子位于mRNA分子中， 作用：起始和终止翻译过程。 问题：辨析“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子” 小组活动：请文字和箭头表示基因表达载体的构建过程？ 载体 （质粒） DNA分子 （含目的基因） 或产生相同黏性末端的限制酶处理 质粒带有黏性末端或平末端的切口 带有相同的黏性末端或平末端的目的基因片段 DNA连接酶 重组DNA分子 （重组质粒） 同一种 问题：使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到一种重组DNA？有何缺点？怎么改进？ 3、基因表达载体的构建过程 使用一种限制酶进行切割Bt基因和pBI121质粒，共有几种连接情况？ 请大家尝试用胶带模拟DNA连接酶进行操作。 探究‧活动： 载体与目的基因反向连接 载体与目的基 因正向连接 目的基因与目的基因之间的连接 目的基因自身环化 载体 自身环化 载体与载体之间的连接 二.基因表达载体的构建 载体 目的基因 自连 两个片段间的连接 目的基因自连 质粒自连 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 正向连接 反向连接 1 1’ 2 2’ 1 2 2’ 1’ 2 2’ 1’ 1 选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割 GATCT- A- AATTC- G- 如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？ -A -TCTAG -G -CTTAA 1.某目基因两侧的 DNA序列所含的限制酶酶切位点如图所示,下列可作该目的基因最佳载体的是 (　　) 　　　　　　　　 A　　　　 B C　　　　　　 　D A 2.构建基因表达载体：为使目的基因与载体正确连接，应用_______________两种不同限制酶的来分别切割载体和目的基因。 Pvit Ⅱ和EcoR Ⅰ 3.(2021·全国乙卷，38)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 回答下列问题： (1)常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中________ 酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中 酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是__________。 EcoR Ⅰ、 Pst Ⅰ EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ 磷酸二酯键 (3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能 ，质粒DNA分子上有________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是很长横线？ 自我复制 限制酶切割位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 4.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，Amp R表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是 (　 　) A．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA B．在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因 C．若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接 D．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长 D (4)表达载体含有启动子，启动子是指_____________________________________ ____________。 RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一 段DNA序列 课堂小结 Lavf58.29.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 $$