2025届高三生物二轮复习课件第38讲 基因工程（第1课时）微专题5PCR

第38讲 基因工程 课标要求 1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的 2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具 3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤 重组DNA技术的基本工具 考点一 限制酶、DNA连接酶、运载体 1.基因工程 (1)概念理解 必 备 知 识 基因重组 分子 受体 目的基因 遗传性状 3 (2)理论基础 必 备 知 识 4 2.重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀” 必 备 知 识 原核生物 数千 特定核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性末端 大多数由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他 5 EcoR I 5' 5' 3' 3' 黏性末端 只能识别5’-GAATTC-3’序列，并在G和A之间切开 5’—GAATTC— 3’ 3’—CTTAAG— 5’ 5’—G 3’—CTTAA AATTC— 3’ G— 5’ 限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时产生的末端。 5’—AATT— 3’ Sma I 5' 5' 3' 3' 只能识别5’-CCCGGG-3’序列，并在C和G之间切开。 5’—CCCGGG— 3’ 3’—GGGCCC— 5’ 5’—CCC 3’—GGG GGG— 3’ CCC— 5’ 平末端 限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时产生的末端。 思考·讨论 1.根据下列限制酶切割形成的黏性末端，回答问题： (1)用限制酶切1个切口时，断开几个磷酸二酯键？可形成几个黏性末端？又产生几个磷酸基团？ 1.根据下列限制酶切割形成的黏性末端，回答问题： (2)同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？ (3)不同限制酶切割产生的黏性末端一定不同吗？ 思考·讨论 2.请判断：以下黏性末端是由 种限制酶作用产生的。 思考·讨论 知能必备 【教材拾遗】 (1)[选择性必修3 P71旁栏]原核生物中限制酶的作用是 。 (2)[选择性必修3 P74拓展应用T1]限制酶来源于原核生物,不切割自己的DNA分子 的原因是 。 必 备 知 识 切割外源 DNA 以保证自身安全,防止外来病原物的危害 原核生物 DNA 分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰 限制酶的选择原则 (1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 ①不破坏目的基因原则:如图甲中可选择Pst Ⅰ,而不选择Sma Ⅰ。 ②保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则:质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中不选择Sma Ⅰ。 ③确保出现相同黏性末端原则:通常选择与切割目的基因相同的限制酶,如图甲中Pst Ⅰ;为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶。 重 点 难 点 防止目的基因和载体自身环化； 防止目的基因与载体反向连接； 双酶切优点： (2)根据常规质粒的结构确定限制酶的种类 重 点 难 点 (3)若质粒上标出T-DNA片段,则所选限制酶切割位点应位于T-DNA片段中。设切割目的基因的限制酶为Xba Ⅰ和Sac Ⅰ,则下图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,而丙Ti质粒宜选取,分析如下: 重 点 难 点 切开的黏性末端或平末端如何连接起来呢？ (2)DNA连接酶——“分子缝合针” 必 备 知 识 黏性末端 限制酶 17 知能必备 【教材拾遗】 [选择性必修3 P72旁栏]DNA连接酶和DNA聚合酶　　　(填“是”或“不是”) 一回事。原因是①DNA连接酶连接的是 　　　　　　　　 ,而DNA聚合酶是 把　　　　　　　　　　连接到已有的DNA片段上。 ② 起作用时需要以一条DNA链为模板,而　　　　　　　起作用 时不需要模板。 必 备 知 识 不是 两个 DNA 片段 单个的脱氧核苷酸 DNA 聚合酶 DNA 连接酶 (3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 必 备 知 识 质粒 限制酶切割位点 启动子、终止子、复制原点、标记基因等 在天然质粒的基础上进行人工改造 eg四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等 基因工程的基本操作程序 考点二 1.目的基因的筛选和获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 (1)筛选合适的目的基因 ①目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变　　　　　　 或获得 　　 等的基因。主要是指　　　　　　的基因。 ②筛选目的基因的方法: a.从相关的已知　　　　　　　　　的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 b.利用　　　　　　　　　　　　　进行筛选。 1.目的基因的筛选与获取 必 备 知 识 受体细胞性状 预期表达产物 编码蛋白质 结构和功能清晰 序列数据库和序列比对工具 21 (2)目的基因的获取—— 利用PCR获取和扩增目的基因 ① 必 备 知 识 引物 脱氧核苷酸 耐高温 温度 两种引物 耐高温的DNA 聚合酶 琼脂糖凝胶电泳 指数形式 22 必 备 知 识 ②引物 a.定义:是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的　　　　 　　。 b.类型:自然引物——细胞内DNA复制主要为RNA单链;人工引物——主要是单链DNA,其次是RNA。 c.长度:一般为 20~30个核苷酸,若引物长度过短,则引物与模板链结合的特异性较差。 d.作用:　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 短单链核酸 使 DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 23 ③PCR技术和体内DNA复制的比较 必 备 知 识 24 【教材拓展】 (1)[选择性必修3 P77“相关信息”]真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要　 激活,因此,PCR反应缓冲液中一般要添加　　　。 (2)由细胞中提取出的mRNA经逆转录形成的DNA,称为cDNA。由真核细胞中获得的cDNA与直接提取得到的DNA均可以作为PCR的模板,但两者序列会有差异。因为在真核细胞中,由内含子转录出的RNA会被剪切,只保留外显子转录出的RN-A并拼接成成熟的mRNA。原核细胞中没有此差异。 必 备 知 识 Mg2+ Mg2+ 2.基因表达载体的构建—核心 (1)构建基因表达载体的目的 ①使目的基因在受体细胞中　　　　　,并且　　 给下一代。 ②使目的基因能够　　　　　　　　。 (2)基因表达载体的组成 有时为了满足应用需 要,会在载体中人工构 建　　　　　　 , 当　　　 存在时,可 以　　　　　 目的基 因的表达。 必 备 知 识 稳定存在 表达和发挥作用 遗传 RNA 聚合酶 转录 诱导型启动子 诱导物 激活或抑制 26 (3)基因表达载体的构建过程 必 备 知 识 [提醒]启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别 27 3.将目的基因导入受体细胞 必 备 知 识 常用方法 导入植物细胞 农杆菌转化法 花粉管通道法 —— 显微注射法 —— Ca2+处理法 我国科学家独创 导入动物细胞 导入微生物细胞 28 3.将目的基因导入受体细胞 (1)将目的基因导入植物细胞 ①花粉管通道法——我国独创 a.用微量注射器将含　　　　　　　　　　直接注入　　 中; b.在植物　　　后一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴在　　　　　,使目的基因通过　　　　　　进入胚囊。 ②农杆菌转化法 转化:指目的基因进入受体细胞内,并在受体细胞内　　　　　　　 的过程。 a.农杆菌特点:能在自然条件下侵染　　　　　　　　 　　,而对大多数　 　　　没有侵染能力。 必 备 知 识 目的基因的 DNA 溶液 受粉 子房 花粉管通道 花柱切面 稳定维持和表达 双子叶植物和裸子植物 单子叶植物 29 b.农杆菌的优势与缺点:农杆菌细胞内的Ti质粒上的　　　 可携带目的基因整合到受体细胞的　　　　　　上;但存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中,造成“基因污染”。 c.农杆菌转化法的两次拼接和两次导入: 第一次拼接:　　　　　　　　　　　　　　　　　　; 第二次拼接(非人工操作):指______________________________________________ 　　　　; 第一次导入:　　　　　　　　　　　　　　　　; 第二次导入(非人工操作):指　　　　　　　　　　　　　　　 　。 必 备 知 识 T-DNA 染色体 DNA 将目的基因拼接到Ti质粒的 T-DNA 上 插入目的基因的 T-DNA 拼接到受体细胞的染色体 DNA 上 将含目的基因的 Ti 质粒导入农杆菌 含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞 30 d.转化方法: 可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与　　　　　　　,然后　　　　　　　,并再生成植株;受体细胞是　　　　。 也可以将花序直接浸没在　　　　　　　的溶液中一段时间,然后培养植株并获得　　　 ,再进行　　　　　 　等;受体细胞是　　　　。 (2)将目的基因导入动物细胞 ①方法:常用　　　　　 。 ②选择受精卵作为受体细胞的理由: a.　　　　,易操作。 b.　　　　　,易培养成完整个体。 必 备 知 识 农杆菌共培养 筛选转化细胞 体细胞 含有农杆菌 种子 筛选、鉴定 受精卵 显微注射法 受精卵 体积大 全能性高 31 (3)将目的基因导入原核细胞 ①方法:Ca2+处理法 ②原理:使用Ca2+处理可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 ③过程: ④优点与缺点: 优点:生理结构和遗传物质简单、生长繁殖快、对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作; 缺点:原核细胞作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性,需要在体外进行再加工。 必 备 知 识 32 4.目的基因的检测与鉴定 必 备 知 识 类型 检测与鉴定内容 方法 分子水 平检测 目的基因是否插入转基因生物的DNA上 利用PCR技术、抗原—抗体杂交等 目的基因是否转录出mRNA 目的基因是否翻译成蛋白质 个体生 物学水 平鉴定 是否具有抗性及抗性程度 对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验 基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同 比较基因工程产品与天然产品的功能活性 33 微专题5 PCR中的引物和计算 引物 a.定义:是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 b.类型:自然引物——细胞内DNA复制主要为RNA单链; 人工引物——主要是单链DNA,其次是RNA。 c.长度:一般为 20~30个核苷酸,若引物长度过短,则引物与模板链结合的特异性较差。 d.作用:使 DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 e.设计： 已知一段目的基因的碱基序列来设计引物。 (或者依据目的基因两端的部分核苷酸序列来设计引物) 引物需连接在DNA模板链的3'’端 f.连接： [方法总结] 1.设计引物的主要原则 ①引物长度通常为20~30个核苷酸,可防止随机结合。 ②两个引物之间不能有连续4个碱基的互补配对,否则加入的引物自身形成双链以至于得不到目的基因片段。 ③某一引物自身不能有大于4个碱基的反向重复序列或自身互补序列的存在,否则自身折叠出现局部碱基互补配对。 ④为构建合适酶切位点,常常需要在2种引物的5'端添加不同的限制酶的识别序列。 引物太短，错配几率大，特异性弱 36 [跟踪训练] 6.[2023·山东青岛一模] (1)测序技术通常需要用PCR技术扩增待测分子。下表是某研究小组设计的两组引物,其中不合理的是　　　　　,原因是________________________________________。 引物 序列 A 5'—GCCCTCTACTCCCCGGTCTTG—3' 5'—GCCCATCTGCAAGTTATCCTA—3' B 5'—GGGATT—3' 5'—AATCCC'3' 特异性弱;两个引物会互补结合 B　 引物太短、 37 (2)图中是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接,在设计PCR引物时可添加限制酶_________ ______的识别序列。通过上述方法获得人的胰岛素基因后,需要通过PCR技术进行扩增,已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为5'—CCTTTCAGCTCA—3',则其中一种引物设计的序列是5’—　 —3'。  CTCGAGCCTTTCAGCTCA XhoⅠ和 MunⅠ　 38 [方法总结] 1.设计引物的主要原则 ⑤设计的引物在合成之前,要在DNA数据库中进行BLAST检测,以确保引物中的序列只在所扩增的基因中出现,而与其他基因不具有互补性。 ⑥PCR反应时复性温度和时间均与引物的序列有关,长度相同,但G、C含量高,需设定较高的复性温度。 生物大分子序列比对搜索工具 注意： 当复性温度过低时，引物与模板的结合位点会增加，导致引物与模板错配的机会增多，特异性降低。 若复性温度过高，引物与模版无法结合 39 8.请回答PCR扩增时与复性温度、延伸温度、延伸时间有关的问题: (1)如果 PCR反应得不到任何扩增产物,可采取的改进措施有　　　　(填序号)。  ①升高复性温度;②降低复性温度;③重新设计引物。 (2)某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异性条带(引物和模板不完全配对)。为 了减少反应中非特异性条带的产生,以下措施中有效的有　　　　。  A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度 ②③　 D 40 (3)在体外选择性扩增eGFP目的基因片段。PCR反应一般由90 ℃热变性、55~60 ℃引物和模板配对、72 ℃延伸3个步骤,经过多次循环完成。延伸阶段选用72 ℃是综合考虑了哪些因素?_________________________________________(答出两条即可)。  防止DNA变性;保持Taq酶活性所需温度条件 41 引物不能重复利用 PCR过程是先解旋，后复制 2.PCR过程中的数量问题 PCR过程利用高温解旋，不需要解旋酶 第 一 次 循 环 90℃以上，DNA双链解开 50℃左右，引物与DNA结合 72℃左右，新DNA合成 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 第 二次 循 环 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 高温变性、 中温延伸 低温复性、 第 三次 循 环 3’ 5’ 高温变性 中温延伸 低温复性 第 一 次 循 环 90℃以上，DNA双链解开 50℃左右，引物与DNA结合 72℃左右，新DNA合成 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 第 二次 循 环 3’ 5’ 高温变性、 中温延伸 低温复性、 ①目的基因在DNA分子中间：PCR技术获取目的基因时至少要经过3次循环才能从DNA分子中分离出目的基因； ②目的基因在DNA分子端部：PCR技术获取目的基因时至少要经过2次循环才能从DNA分子中分离出目的基因 2.PCR过程中的数量问题 (1)规律 循环次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物A(或B)的 DNA分子数 1 3 7 2n − 1 同时含引物A、B的DNA分子数 0=21−2 2=22 − 2 6=23 − 2 2n − 2 共消耗的引物数量 2=21+1−2 6=22+1 − 2 14=23+1 − 2 2n+1 − 2 两条链等长的DNA 分子数 0 0 2=23 − 2×3 2n − 2×n DNA分子种类 2 4 5=4+1 5 (2)PCR中的其他数量关系(假设两种引物均在模板DNA的中段) 49 [方法总结]熟悉PCR的过程图 50 三、PCR扩增过程中的数量问题 9.玉米是重要的粮食作物,其叶片细胞中的P蛋白是一种水通道蛋白,由P基因编码;科研人员成功培育出超量表达P蛋白的转基因玉米,回答下列问题。 (1)利用PCR技术以图中的DNA片段为模板扩增P基因,需要的引物有　 (从A、B、C、D中选择)。上述过程中,至少经过　　　　次循环后会产生双链等长的P基因片段,循环4次共需要的引物数为　　　　。  30 B、C　 3　 51 (2)从理论上推测,第四轮循环产物中含有两种引物的 DNA 片段所占的比例为　　　　　　。经4轮循环后产物中有　　　　种不同种类的DNA分子,其中只含等长目的基因的DNA分子有　　　　个。  7/8　 8 5　 52 $$