2.2.2 动物细胞工程——动物细胞融合技术与单克隆抗体-【省心备课】2024-2025学年高二生物同步教学精优课件（人教版2019选择性必修3）

第2节 动物细胞工程 ——动物细胞融合技术与单克隆抗体 贺老师 第2章 细胞工程 1 ……. 由血清中提取的抗体是由不同浆细胞产生的多种抗体的混合物，可达百万种以上。 ……. 每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 抗体1 抗原1 B细胞1 刺激 抗体2 抗体3 抗体4 抗原2 抗原3 抗原4 B细胞2 B细胞3 B细胞4 刺激 刺激 刺激 产量低、 特异性差 需要 获得 获得大量的B细胞1 问题:若我们只需要大量抗体1，有什么办法吗？ 早期获得抗体的方法及缺陷 (2)缺陷: 纯度低、 向动物体内反复注射某种抗原 (1)方法: 动物体内产生的特异性抗体的种类超过百万种 2 每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 单一B淋巴细胞 单一B淋巴细胞群 选择 克隆 产生 大量纯度高特异性强的抗体（单克隆抗体） 单克隆抗体 克隆单一的B淋巴细胞，形成B淋巴细胞群，由细胞群产生大量的纯度高的抗体 一个正常的B淋巴细胞不可能无限增殖的。 怎样才能使B细胞在产生抗体的同时，具备无限增殖能力呢？ 大量制备单一抗体的思路： 单个细胞 无性繁殖 化学性质单一，特异性强 单： 克隆： 抗体： 如何获得大量、单一的抗体？ 【细胞克隆】是一种无性繁殖技术，通过将单个细胞从群体内 能否培养出一种能分泌抗体且增殖能力强的细胞？ 请你尝试利用“拆词法分析“单克隆抗体”一词中“单”和“克隆”的含义。 分离出来单独培养，使其重新繁衍成一个新的细胞群。 3 动物细胞融合 动物细胞培养 单克隆抗体 【资料3】1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒在前人工作的基础上，充分发挥想象力，设计了一个极富创造性的实验方案： 一种B淋巴细胞（只分泌一种特异性抗体） 骨髓瘤细胞（癌细胞）能在体外无限增殖 杂交瘤细胞 单克隆抗体 既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体 4 思考：19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？ 病人体内的病毒诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。 动物细胞融合技术 如何让两个不同的来源动物细胞融合为杂种细胞？ 灭活病毒诱导法 肺结核病人病理切片 5 动物细胞融合技术 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合 1.“灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？ 2.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？ 细胞核的融合 融合完成的标志： 某种病毒 紫外线 灭活 丧失感染活性(不感染细胞) 保留抗原结构(诱导细胞融合) 用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构 6 动物细胞融合技术 1.概念： 指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。 2.原理： 细胞膜具有一定的流动性 3.结果： 形成杂交细胞 4.诱导方法： 与植物原生质体融合的方法相同 物理法 电融合法等 化学法 聚乙二醇（PEG）融合法 生物法 灭活病毒诱导法 动物细胞融合特有 细胞核的融合 →具有原来两个或多个细胞的遗传信息。 6. 意义： 突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。 至今，种间、属间、科间、甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得了成功。 5.融合实质及完成的标志： 7 单克隆抗体的制备 注射特定抗原 从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养 多种已免疫的B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 诱导融合 小鼠的脾脏中获取 多种杂交细胞 获得产生特定抗体的B淋巴细胞 阶段一：动物细胞融合 8 思考：只考虑两两融合，B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞经诱导融合后，培养基中共出现几类细胞？其中融合的细胞有几类？ 阶段二：筛选杂交瘤细胞 杂交瘤细胞（多种） 第一次筛选 B细胞 自身融合 未融合的 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 自身融合 未融合的 骨髓瘤细胞 B1-瘤 B2-瘤 B3-瘤 单克隆抗体的制备 原因：融合后得到多种杂交细胞和未融合的细胞 目的: 得到的是多种杂交瘤细胞 方法：用特定的选择培养基，只有融合的杂交瘤细胞才能生长 共有5类细胞。其中融合的细胞有3类。 9 阶段二：筛选杂交瘤细胞（第一次筛选） 单克隆抗体的制备 【资料4】细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。 筛选出杂交瘤细胞方法？ 培养基中加入氨基喋呤（HAT选择培养基） B淋巴细胞 合成DNA S途径 D途径 不能无限分裂增殖 骨髓瘤细胞 合成DNA D途径 能无限增殖 B淋巴细胞及同型融合细胞 不能无限增殖，死亡 骨髓瘤细胞及同型融合细胞 不能合成DNA，死亡 杂交瘤细胞 能无限增殖，生长 B1-瘤 B2-瘤 B3-瘤 ……. 骨髓瘤细胞是经过人工筛选的基因缺陷型细胞，缺乏HGPRT、TK。 这些杂交瘤细胞都能产生所需的特定抗体吗？由于小鼠在生活中还受到许多其他抗原的刺激，所以经第一次筛选之后获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的杂交瘤细胞 细胞无增殖能力的细胞在培养基中存活仅5-7天，细胞的多聚体也容易死去。 10 阶段三：筛选分泌专一抗体的杂交瘤细胞（第二次筛选） 方法： 用培养液 稀释培养 杂交瘤细胞(多种) 每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞 抗原—抗体杂交 抗原—抗体特异性结合 原理： 抗体检测呈 阳性的杂交瘤细胞 多孔细胞培养板 阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。 使用96孔板培养和筛选杂交瘤细胞，每一个孔尽量只接种一个杂交瘤细胞，即将单个杂交瘤细胞单独培养，通过克隆化培养和抗体检测，即可获得大量能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。【原理】将杂交瘤细胞培养液稀释后滴入多孔板，如果稀释度足够高，多孔板的一个孔里就可能只有1个杂交瘤细胞，培养之后(即克隆化培养)，用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）。这样经过多次克隆化培养以及有限稀释法的筛选，就能选出需要的那种杂交瘤细胞。 11 植物体细胞杂交 动物细胞融合 原理 细胞融合前的 处理方法 诱导细胞融合 的方法 细胞融合成功 的标志 意义 主要用途 细胞膜具有一定的流动性 植物细胞的全能性 细胞膜具有一定的流动性 用果胶酶和纤维素酶去壁 用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞 电融合法、高Ca2+-高pH融合法； 离心法、聚乙二醇（PEG）融合法 聚乙二醇（PEG）融合法、 电融合法、灭活病毒诱导法 再生出细胞壁 细胞核的融合 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种 突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能 获得完整的杂种植株 主要用于制造单克隆抗体 植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较 12 单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较 项目 第一次筛选 第二次筛选 筛选 原因 目的 筛选 方法 筛选出杂交瘤细胞 筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞 用特定的选择培养基（HAT培养基）筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 克隆培养、抗体检测：用多孔细胞培养板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。 诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞 13 阶段四：动物细胞培养 抗体检测呈阳性 的杂交瘤细胞 体外培养 体内培养 (注射到小鼠腹腔内) 单克隆抗体 从细胞培养液中提取 从小鼠腹水中提取 优点：可大规模培养，大量生产 缺点：需要人为控制培养条件，成本相对较高 优点：易于控制培养条件，成本较低 缺点：规模小，产量少 ——获得大量单克隆抗体 单克隆抗体的制备 培养杂交瘤细胞的方法有哪些？从哪里收集产物？方法的优缺点？ 14 单克隆抗体 第二次筛选 杂交细胞 杂交瘤细胞 体外或 体内培养 第一次筛选 骨髓瘤细胞 诱导融合 分泌特异抗体的杂交瘤细胞 杂交瘤细胞群 提取 已免疫的B淋巴细胞 动物细胞融合技术 动物细胞培养技术 既能大量繁殖 又能产生抗体 注射抗原 单克隆抗体制备的过程中，应用到的技术手段 单克隆抗体的制备 细胞膜的流动性 细胞增殖 小结： 单克隆抗体制备过程的原理 用到哪些技术？ 15 【拓展】 抗体的人源化 利用小鼠获得的单克隆抗体，能直接用于人体吗？为什么？ 不能，单克隆抗体会被人体当做抗原，发生免疫反应。 将非人源（如鼠源）抗体的关键功能区域移植到人类抗体框架中，以降低免疫原性并提高治疗效果。 16 讨论： 1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？ 抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞。 药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。 单克隆抗体的应用 抗体—药物偶联物（antibody-drug conjugate，ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。 17 讨论： 2.除了细胞毒素外，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？ 可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗； 一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。 单克隆抗体的应用 18 单克隆抗体的应用 1 运载药物 ——“生物导弹”--靶向运输药物治疗疾病 年销售量近百亿美金 19 单克隆抗体的应用 1 运载药物 抗体—药物偶联物（ADC）的局限性： （1）成本高 （2）抗体与药物的连接可能分开，导致药物作用于健康细胞 （3）脱靶效应：药物不仅结合到目标靶点，还意外结合到其他非预期的分子上，导致副作用或其他不良反应。 ——“生物导弹”--靶向运输药物治疗疾病 20 单克隆抗体的应用 2 诊断试剂 如何鉴定血型？ A型 B型 AB型 O型 红细胞 抗原（凝集原） 抗体 A抗原 B抗原 A和B抗原 无 B抗体 A抗体 无 A和B抗体 A型血 B型血 O型血 AB型 21 单克隆抗体的应用 2 诊断试剂 怀孕后，人体内的激素会发生较大改变，如绒毛膜促性腺激素的含量会大大增加，可否利用激素含量的变化来检测是否怀孕？如何检测？原理是什么？ 制备抗人绒毛膜促性腺激素的单克隆抗体来检测其尿液判断是否怀孕 原理：抗原和抗体能够特异性结合 优势：在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。 新冠病毒抗原检测试剂盒 【资料5】用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。 22 甲胎蛋白（AFP）是一种特异性较强的肿瘤标志物，用甲胎蛋白作为______免疫小鼠，制备____________________，并与含有放射性同位素的标记物连接，单克隆抗体携带放射性标记物通过血液可到达全身几乎所有组织。由于肿瘤细胞表面的______会和单克隆抗体特异性的结合，所以放射性同位素标记物就不断积累在______上。通过一定的显影技术就可以发现肿瘤所在。 抗原 抗AFP单克隆抗体 AFP 肿瘤 结合同位素的单抗 荧光标记的单抗 2 诊断试剂 单克隆抗体的应用 利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术， 可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。 23 单克隆抗体的应用 3 作为药物治疗疾病 单克隆抗体单独使用，也可直接用于治疗疾病 如果被毒蛇咬伤，如何快速治疗？ 抗毒血清的主要作用成分是相应的抗体 狂犬病免疫球蛋白 24 单克隆抗体制备过程相关知识点检测 （1）该过程中应用到的技术_______________________________________ （2）原理_______________________________________ （3）注射特定抗原的目的______________________________________________ （4）诱导融合的方法______________________________________ 动物细胞特有的诱导融合方法为_______________________ （5）第一次筛选的目的______________________ 第一次如何筛选___________________________ 筛选原理____________________________________________________ （6）杂交瘤细胞的特点__________________________________ 动物细胞融合、动物细胞培养 细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖 用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞 PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法 灭活病毒诱导法 筛选获得杂交瘤细胞 用特定的选择培养基进行筛选 在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长 既能迅速大量增殖，又能产生抗体 25 （7）第二次筛选的目的________________________________________________ 如何筛选________________________________________________________ 选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即__________________________________ （8）抗体检测原理_______________________________________ （9）如何获取大量所需杂交瘤细胞__________________________________________ （10）如何获取单克隆抗体 ①体外培养___________________________ ②小鼠腹腔内培养_________________________ （11）单克隆抗体的优点_____________________________ 获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选） 分泌的抗体能与特定的抗原结合 抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定） 在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖 从细胞培养液中获取 从小鼠腹水中获取 能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备 阳 单克隆抗体制备过程相关知识点检测 26 单克隆抗体的应用 讨论： 3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？ 单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原发生反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。 ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。 27 一、概念检测 1. 下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ） A. 它们的原理都涉及细胞膜的流动性 B. 都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合 C. 融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞 D. 前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株 C 2. 科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（ ） A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 SARS病毒 B. 体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体 C. 将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞 D. 将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体 A 28 29 Lavf55.33.100 单克隆抗体的制备过程 jasmine $$