1.2.2 微生物的数量测定和选择培养-【步步高】2023-2024学年高二生物学选择性必修3 生物技术与工程（浙科版）

第2课时　微生物的数量测定和选择培养 [学习目标]　1.概述测定微生物数量的稀释涂布平板法和显微镜计数法。2.举例说明通过调整培养基的配方，可有目的地培养某种微生物。3.尝试分离和计数能分解尿素的微生物。 一、稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量 1．稀释涂布平板法测定微生物数量 2．显微镜计数法 判断正误 (1)稀释涂布平板法中，随机抽取某个稀释度的培养基，统计菌落数(　　) (2)将不同稀释度的3个培养基统计菌落数后求平均值(　　) (3)如果小方格内酵母细胞数目过多，应当对菌液进行稀释(　　) 答案　(1)×　(2)×　(3)√ 任务一：稀释涂布平板法测定微生物的数量 1．两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 (1)稀释涂布平板法测定微生物数量的原理是什么？ 提示　当稀释倍数适当时，在固体培养基表面能得到由单个细胞生长繁殖成的单菌落；通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中的活菌数。 (2)两位同学的统计结果是否可靠？若不可靠，应如何改进？ 提示　都不可靠。甲同学应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。乙同学的其中一个平板菌落数为21，与另外两组数值相差太大，意味着操作有误，需要重新实验。 (3)统计的菌落往往比活菌的实际数目低，为什么？ 提示　因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 2．某同学在三种稀释倍数下吸取0.1 mL的稀释菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下的数据，试计算1 mL菌液中活菌数(一般选择菌落数为30～300的平板进行计数)。 平板 菌落数 稀释倍数 平板1 平板2 平板3 104 320 360 356 105 212 234 287 106 21 23 18 提示　105的稀释倍数下取0.1 mL的稀释菌液涂布的三个平板上的菌落数在30～300之间，计算其平均值为(212＋234＋287)/3≈244(个)。进一步可以换算出1 mL菌液中活菌数为(244÷0.1)×105＝2.44×108(个)。 任务二：显微镜计数法 一次取样后，将样液稀释10倍，采用如图1所示血细胞计数板计数，在显微镜下观察到如图2所示的现象(“”表示酵母菌)。 对图2的中方格中的酵母菌计数时，最佳计数路径是a～d中的哪一种？若以图2的计数结果作为应计数的5个中方格的平均值，则此样液中酵母菌的密度是多少？ 提示　据图分析可知，a图所示的计数方法从头到尾，一气呵成，计数过程中不会出现漏记与重复计数，而其余几种计数方法中都有多条计数路径，需要将各路径的数据相加，容易出现漏记与重复计数，因此对图2的中方格中酵母菌计数时，最佳计数路径是a。据图分析，图2含有酵母菌25个，若以该计数结果作为应计数的5个中方格的平均值，则此样液中酵母菌的密度＝25×25×10 000×10＝6.25×107个/mL。 　稀释涂布平板法测定微生物数量 (1)统计依据：平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中的活菌数。 (2)误差分析：菌落太少说明稀释倍数太大，各平板之间菌落数差异会很大(多一个菌落，乘以稀释倍数误差就大了)，造成误差。数量太多的菌落的生长受到抑制，菌落之间营养竞争较大，可导致某些菌落营养不良影响计数，并且难以区分各个菌落，无法准确计数，造成误差。 (3)结果分析：统计的菌落数往往比实际数目少，因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 1．某同学对101、102、103倍稀释液计数的平均菌落数分别是2 760、295和16，则菌落总数为(所用稀释液体积为0.1 mL)(　　) A．2.76×104个/mL B．2.95×105个/mL C．4.6×104个/mL D．3.775×104个/mL 答案　B 解析　某同学在101、102、103倍稀释的平均菌落数为2 760、295和16，为保证结果准确，一般应选择菌落数在30～300的平板进行计数，故数值为295，稀释倍数为102，则每毫升菌落总数为295×102÷0.1＝2.95×105个。 2．下列有关微生物计数的叙述，不正确的是(　　) A．统计某一稀释度下的菌落数，最好能计数3个平板并求平均值 B．稀释涂布平板法测定微生物数量，因为观察的是菌落，所以统计值往往比活菌的实际数目高 C．显微镜计数法在计数的同时能观察到所研究微生物的形态特征 D．利用血细胞计数板计数属于显微镜计数法，其缺点是不能区分死菌与活菌 答案　B 解析　由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上显示的只是一个菌落，故稀释涂布平板法的统计值往往比活菌的实际数目低，B错误。 二、调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 1．选择培养基 2．活动：能分解尿素的微生物的分离与计数 (1)实验原理 (2)方法步骤 提醒　①LB固体培养基的成分：蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂和水。 ②尿素固体培养基的成分：葡萄糖、氯化钠、K2HPO4、酚红、琼脂糖和水。 ③琼脂和琼脂糖之间的主要区别在于琼脂是从红藻中获得的凝胶状物质(含N)，而琼脂糖是从琼脂或红藻中纯化的线性聚合物(不含N)，琼脂糖是琼脂的主要成分，占琼脂的70%以上。 琼脂糖在细菌培养中非常有用。 判断正误 (1)选择培养基只允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物的生长(　　) (2)分离能分解尿素的微生物时，培养基中尿素作为唯一氮源(　　) (3)配制的尿素固体培养基在灭菌后再加入尿素溶液，因为尿素高温易分解(　　) (4)相同稀释度下，尿素固体培养基的菌落数比LB固体培养基多(　　) 答案　(1)√　(2)√　(3)√　(4)× 任务三：用功能不同的培养基分离与鉴别微生物 按功能划分，可以把培养基分为选择培养基和鉴别培养基。选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。鉴别培养基是指根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学试剂配制而成的，用以鉴别不同种类的微生物的培养基。据此回答以下问题。 1．根据教材“活动”中尿素固体培养基的配制，回答下列问题： (1)从物理特征看，该培养基属于固体培养基，从功能上看属于选择培养基。 (2)尿素固体培养基是如何实现对能分解尿素的细菌的筛选的？ 提示　该培养基中的唯一氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能够分解尿素，而不能合成脲酶的微生物不能分解尿素，会因缺乏氮源而无法生长繁殖，所以用该培养基能够筛选出分解尿素的细菌。 (3)在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗？ 提示　不都是，有些菌落可能是自生固氮微生物或能直接吸收尿素并作为氮源的微生物，而不是能分解尿素的微生物。 2．已知刚果红是一种染料，它可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈。请回答下列问题： (1)现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出实验方案。 提示　用“纤维素作为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基中加入刚果红进行鉴别。在培养基上形成透明圈的菌落即为纤维素分解菌。 (2)怎么比较纤维素分解菌的分解能力？ 提示　透明圈直径与菌落直径比值越大，说明该菌落分解纤维素的能力越强。 　几种选择培养基的设计 特性 主要用途 设计原理 加入青霉素 分离酵母菌等真菌 青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用 不加氮源 分离固氮微生物 固氮微生物能利用空气中的氮气 不加碳源 分离自养型微生物 自养型微生物能利用无机碳源 3．(2023·湖州高二期末)下列有关微生物筛选的叙述中，不正确的是(　　) A．利用高温条件筛选耐热的Taq细菌 B．加入青霉素可以筛选出对青霉素有抗性的细菌 C．含酚红的尿素培养基初步鉴别出分解尿素的细菌 D．筛选分解尿素的细菌时应以尿素作为培养基中的唯一营养物质 答案　D 解析　耐热的Taq细菌可以生存在高温环境中，所以可以利用高温条件筛选耐热的Taq细菌，A正确；尿素分解菌可以将尿素分解成氨使酚红指示剂呈红色，C正确；筛选分解尿素的细菌时应以尿素作为培养基中的唯一氮源，同时也要加入其他营养物质，D错误。 4．(2023·舟山高二质检)如图为“能分解尿素的微生物的分离与计数”的部分实验结果，下列叙述正确的是(　　) A．图中采用平板划线法接种 B．图中①和②表示尿素培养基长出的菌落 C．图中③、④培养基中菌落生长代谢时，会释放CO2 D．实验结果表明，自然界中能合成脲酶的微生物比例较高 答案　C 解析　根据实验结果可知，图中采用的接种方法为稀释涂布平板法，A错误；图中①和②的稀释度等于③和④，但菌落数却明显多于③④，很可能是LB培养基上长出的菌落，B错误；根据实验结果，判断自然界中能合成脲酶的微生物比例较低，D错误。 题组一　微生物的数量测定 1．在细菌培养实验中进行计数时，应计数的是(　　) A．各个稀释度样品的培养基上的细菌数 B．合理稀释度样品的培养基上的细菌数 C．各个稀释度样品的培养基上的菌落数 D．合理稀释度样品的培养基上的菌落数 答案　D 2．某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)(　　) A．2.34×108 B．2.34×109 C．234 D．23.4 答案　B 解析　据题意分析可知，每毫升样品中的菌落数＝(234÷0.1)×106＝2.34×109(个)。 3．测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，其中正确的是(　　) A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230 B．涂布了两个平板，统计的菌落数是216和260，取平均值238 C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163 D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是209、240和256，取平均值235 答案　D 解析　为了减小实验误差，至少需要涂布三个平板，且菌落数在30～300之间，D正确。 4．丙草胺是一种广泛应用的除草剂，能抑制土壤细菌、放线菌和真菌的生长。某研究小组从某地土壤中分离获得能有效降解丙草胺的细菌菌株，并对其计数(如图所示)，以期为修复污染土壤提供微生物资源。下列有关叙述错误的是(　　) A．将培养基调至酸性时，有利于降解菌的生长繁殖 B．利用该方法的计数结果往往比显微镜计数法偏小 C．用以丙草胺为唯一氮源的培养基进行培养可以提高降解菌的浓度 D．5 号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为 1.7×109个 答案　A 解析　细菌通常要求在中性偏碱的环境中生长，A错误；该计数方法为稀释涂布平板法，由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，故计数结果比显微镜计数法偏小，B正确；若以丙草胺作为唯一氮源，则只有具有降解丙草胺能力的菌株能够存活，故可以提高降解菌的浓度，C正确；根据5号试管的数据可知，每克土壤中菌株数为(168＋175＋167)÷3÷0.1×106＝1.7×109(个)，D正确。 题组二　微生物的选择培养 5．分离土壤中分解尿素的细菌，可选用的培养基是(　　) 选项 尿素 琼脂糖 葡萄糖 硝酸盐 A ＋ ＋ ＋ ＋ B － － － － C ＋ ＋ ＋ － D ＋ － － ＋ 注：“＋”表示加入，“－”表示不加。 答案　C 6．(2023·温州高二检测)如图为筛选产脲酶细菌的过程，下列说法错误的是(　　) A．选择培养基中应以尿素为唯一碳源 B．挑取单菌落后可用划线法进行接种 C．鉴别培养基中可加入酚红作指示剂 D．培养皿在接种微生物后需倒置培养 答案　A 解析　筛选产脲酶细菌需要制备以尿素为唯一氮源的选择培养基，A错误。 7．(2022·宁波高二期末)为筛选能分泌脲酶的细菌，所配制的培养基中不能含有的成分是(　　) A．尿素 B．甘露醇 C．葡萄糖 D．琼脂 答案　D 解析　因为琼脂含有一定量的含氮化合物，故不能加入，但需要加入琼脂糖，D符合题意。 8．“分离土壤中能分解尿素的微生物”实验中，配制LB全营养培养基的目的是(　　) A．作为实验组，分离尿素分解菌 B．作为对照组，检测培养基灭菌是否彻底 C．作为对照组，观察尿素分解菌在含有酚红培养基上的菌落形态 D．作为对照组，观察全营养条件下能生长的土壤微生物的种类和数量 答案　D 解析　配制LB全营养培养基的目的是作为对照组，观察全营养条件下能生长的土壤微生物的种类和数量，以区分选择培养基是否具有选择作用，D正确。 9．某同学依据如图操作步骤，从土壤中分离能分解尿素的微生物。其中尿素固体培养基和尿素液体培养基均以尿素为唯一氮源。下列叙述正确的是(　　) A．尿素固体培养基比尿素液体培养基多了琼脂 B．以尿素为唯一氮源的培养基的灭菌方式是过滤灭菌 C．利用液体培养基的培养需要振荡以提高营养成分的利用率 D．两种步骤获得的菌落比值相等(甲1/甲2＝乙1/乙2) 答案　C 解析　尿素固体培养基比尿素液体培养基多了琼脂糖和酚红指示剂，A错误；以尿素为唯一氮源的培养基的灭菌方式是高压蒸汽灭菌，其中的尿素溶液用过滤除菌，B错误；两种步骤获得的菌落比值关系为(甲1/甲2＞乙1/乙2)，因为后者经过了对尿素分解菌的选择培养，所以尿素分解菌的比例变大，D错误。 10．某兴趣小组从校园土壤取样，进行“能分解尿素的微生物的分离与计数”实验。小明从稀释度为106培养基中筛选出约120个菌落，而其他同学只筛选出约40个菌落。下列叙述错误的是(　　) A．小明出现这种结果的原因可能是和其他同学取样的土壤不同 B．要证明培养基是否受到污染，可将小明配制的培养基不接种进行培养 C．当稀释倍数太小时，可能由于菌落重叠导致计数结果偏小 D．在牛肉膏蛋白胨培养基中加入酚红指示剂可初步鉴定尿素分解菌 答案　D 解析　小明筛选出的菌落数明显比其他同学多，出现这种结果的原因可能是和其他同学取样的土壤不同，也有可能是培养基中混入其他氮源或培养基被污染，A正确；要证明培养基是否受到污染，可将小明配制的培养基不加土样进行培养，即进行空白对照，B正确；当稀释倍数太小时，两个或两个以上细胞连在一起，培养基上看到的是一个菌落，可能会出现菌落重叠而导致计数结果偏小，C正确；在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂可初步鉴定尿素分解菌，而牛肉膏蛋白胨培养基中尿素不是唯一氮源，D错误。 11．取9个洁净培养皿，均分为三组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，各组分别加入等量的不同培养基，每个平板均用涂布法接种0.1 mL大肠杆菌菌液，37 ℃培养36 h后，统计菌落数(见表)，以下相关叙述正确的是(　　) 组别 培养基 各平板的菌落数 1 2 3 Ⅰ 琼脂、C6H12O6、NH4NO3 30 31 27 Ⅱ 琼脂、C6H12O6、NH4NO3、维生素 169 178 193 Ⅲ 琼脂、NH4NO3、维生素 0 0 1 A.三组实验均使用了液体培养基，以方便菌落计数 B．Ⅰ组和Ⅱ组说明维生素可以促进大肠杆菌生长 C．Ⅰ组和Ⅲ组说明大肠杆菌正常生长需要糖类物质 D．三组实验所使用的培养基均需62 ℃、30 min消毒 答案　B 解析　培养基中都含有琼脂，说明三组实验均使用了固体培养基，A错误；Ⅱ组和Ⅲ组才能说明大肠杆菌正常生长需要糖类物质，C错误；三组实验所使用的培养基均需高压蒸汽灭菌，D错误。 12．(2022·湖州高二期中)金黄色葡萄球菌具有高度耐盐性，在血平板(培养基中添加适量血液)上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色。下列是某研究小组测定自来水中金黄色葡萄球菌浓度的实验操作，错误的是(　　) A．在金黄色葡萄球菌的培养基中加入7.5%NaCl，其作用是有利于金黄色葡萄球菌的筛选 B．在制作血平板时需等平板冷却后，才可加入血液，以防止高温破坏血细胞 C．现将10 mL菌液依次稀释成10－1、10－2、10－3、10－4四个稀释样液，再取四个稀释样液各0.1 mL分别接种到4个血平板上，所用方法是稀释涂布平板法 D．若在10－3组的3个血平板上(每个接种0.1 mL)，金黄色葡萄球菌菌落数分别为35、36和37，则每升自来水中的活菌数约为3.6×106个 答案　D 解析　由于金黄色葡萄球菌具有高度耐盐性，7.5%NaCl在不影响金黄色葡萄球菌生长的同时还抑制其他菌的生长，因此，金黄色葡萄球菌的培养基中加入7.5%NaCl，有利于金黄色葡萄球菌的筛选，A正确；若在10－3组的3个血平板上(每个接种0.1 mL)，金黄色葡萄球菌菌落数分别为35、36和37，则每升自来水中的活菌数约为(35＋36＋37)÷3÷10－3÷0.1×1 000＝3.6×108(个)，D错误。 13．土壤中有些细菌可以降解焦化厂淤泥中的污染物S，如图是分离、纯化和筛选高效降解S的优质菌株的过程。下列叙述正确的是(　　) A．甲是土样经高温灭菌后用无菌水配制的土壤稀释液 B．丙是添加了琼脂的选择培养基 C．在涂布平板上长出的菌落，可通过平板划线法进行计数 D．经多次稀释和筛选，形成的单菌落中所有细胞的遗传物质都相同 答案　B 解析　土样不能用高温灭菌，这样会杀死土样中的目的菌，A错误；固体培养基中才能形成菌落，故丙是固体培养基，制备时加入了琼脂，B正确；平板划线法是常用的接种方法，但不能用来计数，C错误；菌落往往是由一个细胞繁殖而成的子细胞集团，细菌分裂生殖过程中可能会发生基因突变，该实验中筛选出的菌落中的菌种降解能力可能不同，故细胞的遗传物质不一定相同，D错误。 14．产脲酶的细菌可分解尿素。为筛选产脲酶的菌株，科研人员开展了相关研究。回答下列问题： (1)为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一___________________，尿素的灭菌方法是____________________________________________________________。 (2)称取1 g土壤样品，加入99 mL__________中，制备成菌悬液。若用稀释涂布平板法计数细菌的个数，要使所得估计值更接近实际值，应严格操作，多次重复，还应保证对待测样品________的比例恰当。取0.1 mL 10倍稀释的菌悬液涂布在固体培养基上，平均长出了25个菌落，则该样本中每克土壤约有产脲酶的细菌________个。 (3)通常筛选菌种时可以通过观察________特征对细菌进行初步鉴定。在筛选产脲酶的细菌时，还可以在培养基中添加________作为指示剂，产脲酶的细菌在培养基中生长一段时间后，菌落周围指示剂将变成________色。 答案　(1)氮源　用已高压灭菌的G6玻璃砂漏斗过滤除菌　(2)无菌水　稀释　250 000　 (3)菌落　酚红　红 15．一种广泛使用的除草剂(含氮有机物)在土壤中不易被降解，长期使用可污染土壤。为修复被该除草剂污染的土壤，可用一定方法选育能降解该除草剂的细菌(已知该除草剂在水中溶解度低，含一定量该除草剂的培养基不透明)。 (1)现有1 L土壤浸出液，为了对土壤中的细菌进行计数，各取0.1 mL已稀释103倍的水样分别接种到三个培养基上培养。接种需选择图1工具中的______(填字母)进行实验操作。计数结束记录上述三个培养皿中的菌落数分别为55、56、57，则每升原土壤浸出液中菌体数为______________个。 (2)在培养基上形成的菌落中，有透明圈菌落利用的氮源主要是__________，据此可筛选出目的菌。实验结果如图2所示，图中A～E五种菌株中，______是最理想菌株，判断依据是________________________________________________________________________。 (3)在无菌操作下，可将最理想的单菌落用接种环取出，再用______法接种至斜面培养基中。 答案　(1)B　5.6×108　(2)该除草剂　E　透明圈直径与菌落直径比值最大　(3)划线 解析　(1)常用稀释涂布平板法对土壤中细菌进行计数，稀释涂布平板法要用B(涂布器)进行操作。每升土壤浸出液中菌体数为(55＋56＋57)÷3÷0.1×103×103＝5.6×108(个)。(2)要筛选降解该除草剂的菌体，培养基中应该以该除草剂作为唯一氮源。图中E菌株透明圈(降解圈)直径与菌落直径比值最大，故是最理想的菌株。(3)菌种保藏时，可将单菌落取出用划线法接种在斜面培养基中。 学科网（北京）股份有限公司 $$