1.2.1 目标微生物的分离和纯化-【步步高】2023-2024学年高二生物学选择性必修3 生物技术与工程（浙科版）

第二节　纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得 第1课时　目标微生物的分离和纯化 [学习目标]　1.概述分离和纯化微生物的平板划线法和稀释涂布平板法。2.尝试分离和纯化酵母菌。 一、采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化 1．研究或利用微生物使用纯种的原因：只有使用纯种才能保证实验的可重复性和结果的可靠性，才能保证产品的品质。 2．单菌落：在固体培养基上采用划线或稀释涂布的方法接种，通过培养获得的由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团。 3．目标微生物分离和纯化的两种方法 提醒　(1)扇形划线：从培养基上的一点出发，向多方向多次划线，每划一条线都要将接种环在酒精灯的火焰上灭菌，然后再次以同一起点变换方向划线。 (2)多次连续平行划线：划线分3～4次进行。将培养皿旋转一定角度后，不需再次蘸取菌种，只需在上一次划线的末端区域直接开始划线即可。 (3)稀释涂布平板法：接种时，通常需要先将菌液进行梯度稀释，并在培养皿侧面或底面做好标记。 判断正误 (1)采用划线的方法接种时，每划一条线前接种环都要灼烧灭菌(　　) (2)多次连续平行划线时，接种环已灭菌，整个划线过程中不再灭菌(　　) (3)与平板划线法相比，稀释涂布平板法分散细菌得到单菌落的效果更好(　　) 答案　(1)√　(2)×　(3)√ 任务一：微生物的分离和纯化的原理 1．在平板划线法操作中，在第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因是：划线后，线条末端菌种的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使菌种的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细胞繁殖而来的菌落。 2．为什么最后一次划线与第一次的划线不能相连？ 提示　最后一次划线已经将菌种稀释成单个的细胞，如果与第一次的划线相连则增加了菌种的数目，达不到纯化的效果。 3．稀释涂布平板法也是常用的微生物分离和纯化方法。某同学欲通过稀释涂布平板法了解某牛奶中大肠杆菌的含量，进行了相关的实验操作。请分析回答下列问题： (1)如何获得该牛奶的10倍、100倍、1 000倍稀释液？ 提示　向1 mL牛奶中加入9 mL无菌水，获得10倍稀释液；再取1 mL 10倍稀释液，加入 9 mL无菌水，获得100倍稀释液；取1 mL的100倍稀释液加入9 mL无菌水，获得 1 000倍稀释液。 (2)接种前，该同学将表面残留着少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上灼烧，这样做的目的是什么？ 提示　避免涂布器上可能存在的微生物污染培养基，影响实验结果。 (3)该同学应如何确定哪些菌落是大肠杆菌的单菌落？ 提示　根据大肠杆菌菌落特有的形状、大小、颜色、边缘、表面光滑与否等特征进行确定。 　平板划线操作中三种灼烧的目的 项目 目的 蘸取菌液前灼烧 避免接种环上可能存在的微生物污染菌种 每次划线前灼烧 杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端 划线操作结束后灼烧 及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者 1．已知酸奶中的有益菌主要是乳酸菌，要进一步分离、纯化乳酸菌，采用如图所示的划线分离操作最容易得到单菌落的是(　　) 答案　B 解析　A为连续平行划线，B为多次连续平行划线，B比A更容易得到单菌落。 2．图甲所示是稀释涂布平板法中的部分操作，图乙所示是平板划线法的操作结果。下列相关叙述错误的是(　　) A．图甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能涂布菌液 B．对于浓度较高的菌液，若图甲中的最高稀释倍数仅为102，则所得到的菌落不一定是由单个的细胞繁殖而成的 C．图乙所示培养皿中每个划线区域都可得到符合要求的菌落 D．图乙中连续划线的起点是上一次划线的末端(除第一次划线外) 答案　C 解析　平板划线法中多次划线的目的是降低菌种浓度，经过连续划线才有可能得到由单个细胞繁殖而成的单菌落，这种菌落才符合要求，C错误。 二、活动：接种、培养并分离酵母菌 1．目的要求 (1)用平板划线法或稀释涂布平板法接种酵母菌。 (2)用液体培养基大量扩增酵母菌。 2．方法步骤 判断正误 (1)用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上(　　) (2)用接种环取出菌种后需马上塞上装菌种试管的棉塞，然后再划线(　　) (3)用固体培养基更容易大量扩增酵母菌(　　) 答案　(1)√　(2)×　(3)× 任务二：酵母菌培养过程的注意事项和结果分析 1．如何判断培养基是否被杂菌污染？ 提示　培养未接种的培养基，观察是否有菌落生长。如果有，说明培养基被杂菌污染。 2．如果培养基出现不同颜色特征的菌落，你认为出现的原因是什么？ 提示　可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等。 3．仅从菌落特征是否能够认定你分离出了酵母菌？怎么进行进一步鉴定？ 提示　不能。可以利用生化实验和染色及显微镜观察来进一步鉴定。 4．判断液体培养基中接种酵母菌成功的依据是什么？ 提示　和对照组相比，培养基变浑浊。 5．平板倒置的目的是什么？ 提示　防止水分过度挥发；防止皿盖上的水珠落入培养基。 6．制作平板和平板划线法接种时，哪些操作可防止杂菌污染？ 提示　(1)倒平板：①要使三角瓶的瓶口通过酒精灯火焰；②不要让培养基溅在培养皿内壁与皿盖上；③用拇指和食指将培养皿打开一条缝隙，将培养基倒入，立即盖上皿盖。 (2)平板划线法接种：①在酒精灯火焰旁划线；②接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧；③取菌液前后，要将试管口通过酒精灯火焰；④划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养皿表面迅速划线，划线后及时盖上皿盖。 　实验结果的分析 (1)培养未接种的培养基的目的是检查培养基制备是否合格。未接种的培养基表面若有菌落生长，则说明培养基被污染，应该重新制备；若无菌落生长，则说明未被污染。 (2)在接种酵母菌的固体培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色、形状和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。 (3)若在固体培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是菌种不纯，混入了其他杂菌，或在实验操作过程中被杂菌污染。 3．将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37 ℃恒温箱的目的是(　　) A．对比观察培养基的成分是否相同 B．对比分析培养基是否被杂菌污染 C．没必要放入未接种的培养基 D．为了下次接种时再使用 答案　B 解析　对未接种的培养基进行培养，起到对照作用，可确定培养基是否被杂菌污染。 4．平板划线法接种酵母菌时，下列操作正确的是(　　) A．每次划线时，接种环都需要蘸取菌液一次 B．划线分离结束后接种环无需再进行灭菌 C．在超净工作台上接种时要在酒精灯火焰旁进行 D．划线分离后将培养皿正放在恒温培养箱中培养 答案　C 解析　划线分离时，菌种只蘸取一次，A错误；划线分离结束后，接种环仍需进行灼烧灭菌，B错误；微生物培养的关键是无菌操作，在超净工作台上接种时，需要在酒精灯火焰旁进行，以防止空气中微生物的污染，C正确；划线分离结束后，培养皿应倒置于恒温培养箱中培养，D错误。 题组一　平板划线法 1．下列操作中，需用到接种环的是(　　) A．平板划线操作 B．梯度稀释操作 C．涂布平板操作 D．倒平板操作 答案　A 2．如图表示培养和分离X细菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是(　　) A．步骤①倒平板操作时，倒好后应立即将其倒过来放置 B．步骤②将接种环在火焰上灼烧后迅速蘸取菌液后进行平板划线 C．步骤③应多个方向划线，使菌种逐渐分散，培养后出现单菌落 D．步骤④培养箱培养后可用来对X细菌进行计数 答案　C 解析　步骤①倒平板操作时，倒好后待平板冷却凝固，然后将其倒过来放置，A错误；步骤②将接种环在火焰上灼烧后冷却至室温再蘸取菌液进行平板划线，B错误；步骤④培养箱培养后可用来对X细菌进行分离纯化，得到单菌落，但不可用来计数，D错误。 3.微生物接种的方法很多，平板划线法是常用的一种。如图是平板划线示意图，划线的顺序为①、②、③、④。下列相关叙述错误的是(　　) A．划线操作时，将蘸有菌液的接种环插入培养基 B．平板划线后培养微生物时要倒置培养 C．不能将第④次的划线与第①次的划线相连 D．在第②～④次划线前都要对接种环进行灭菌 答案　A 解析　划线时不能将接种环插入培养基，而是在培养基表面划线，A错误；用平板培养基培养微生物时，为防止水蒸气凝集滴入培养基，应将平板倒置培养，B正确；划线时要避免最后一次的划线与第一次的划线相连，否则有可能影响单个菌落的分离效果，C正确；在第②～④次划线前都要对接种环进行灼烧灭菌，保证每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，D正确。 题组二　稀释涂布平板法 4．若在固体培养基上用稀释涂布平板法接种细菌，看到的培养结果不可能是(　　) 答案　D 5．稀释涂布平板法是微生物培养的一种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是(　　) A．操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释 B．不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单菌落 C．需将不同稀释浓度的菌液分别涂布到固体培养基表面 D．操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理 答案　B 解析　稀释涂布平板法操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释，以获得单菌落，A正确；只有稀释度足够高的菌液才可在培养基表面形成单菌落，若稀释度不够高，细菌聚集在一起，得不到单菌落，B错误；操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理，以防杂菌污染，D正确。 6．(2023·绍兴高二检测)下列有关平板划线法和稀释涂布平板法这两种方法共同点的叙述，正确的是(　　) A．对接种工具进行灭菌的次数相同 B．接种工具都要先蘸上酒精再放在酒精灯火焰上灼烧灭菌 C．都可以用来计数微生物的数量 D．可以用相同成分的培养基 答案　D 解析　接种环需要多次划线，每次划线开始和结尾均需要灭菌，涂布器只需开始和结尾处灭菌即可，A错误；涂布器需要先进行酒精浸泡再放在酒精灯火焰上进行灼烧灭菌，接种环不需要蘸上酒精，B错误；平板划线法不能用于计数，C错误。 题组三　接种、培养并分离酵母菌 7．下列依次表示倒平板、接种的位置以及平板划线法接种的路径的示意图，其中错误的是(　　) 答案　D 8．接种、培养并分离酵母菌最常用的方法是平板划线法或稀释涂布平板法。下列有关这两种方法的叙述，错误的是(　　) A．均将酵母菌接种在固体培养基的表面 B．获得的每一个菌落均是由一个细胞生长繁殖而来的子细胞集团 C．都应在酒精灯火焰附近操作，以防止杂菌污染 D．稀释分散菌种的原理不同，但均能达到纯化酵母菌的目的 答案　B 解析　用稀释涂布平板法时，如果稀释度不够，获得的单菌落就可能是由多个细胞繁殖形成的，B错误。 9．在培养基配制和微生物接种的过程中，确保无杂菌污染被称为无菌操作。图中符合无菌操作要求的有(　　) ①三角瓶口通过火焰，并在火焰旁将培养基倒入灭菌培养皿　②盛菌种的试管口在火焰上灼烧　③接种前灼烧接种环　④接种前培养皿在火焰上灼烧　⑤靠近火焰接种 A．①②③④ B．①②③⑤ C．①③④⑤ D．②③④⑤ 答案　B 10．下列有关多次连续平行划线操作的叙述，正确的是(　　) A．使用灭菌的接种环、培养皿，操作过程中不再灭菌 B．打开含菌种的试管后需要将试管口通过火焰，蘸取菌种后需要马上塞上棉塞 C．培养皿皿盖打开后将蘸有菌液的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线即可 D．待接种环冷却后再伸入菌液中蘸取一环菌液 答案　D 解析　平板划线过程中，接种环在每次划线之前和之后均需要灼烧灭菌，A错误；打开含菌种的试管后需通过酒精灯火焰灭菌，取出菌种后还需通过酒精灯火焰灭菌，再塞上棉塞，B错误；将蘸有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖，灼烧接种环，冷却后从第一区域划线末端开始向第二区域内划线。重复上述过程，完成后面区域内划线，注意不要将最后一区域的划线与第一区域的划线相连，C错误。 11.如图所示为实验室使用某种接种方法在培养基上培养某种微生物的结果。下列相关说法正确的是(　　) A．该图最可能是用稀释涂布平板法进行接种的 B．在操作时，为防止杂菌污染，需进行严格的消毒和灭菌 C．该种微生物有可能是H5N1病毒 D．该培养基上的菌落分布不均匀，代表纯培养失败 答案　B 解析　题图最可能是采用平板划线法进行接种的，A错误；病毒无细胞结构，必须寄生在活细胞中才能生存，因此病毒不能用培养基直接培养，C错误；平板划线法中随划线次数的增加，菌落密度逐渐减小，因此分布不均匀，D错误。 12．在接种、培养并分离酵母菌实验中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如图所示。下列有关叙述错误的是(　　) A．接种前应对培养基进行高压蒸汽灭菌 B．连续划线的目的是获得单个细胞形成的菌落 C．接种过程中至少需要对接种环灼烧5次 D．图甲中a区域为划线的起始位置 答案　D 解析　菌液经过连续划线，菌液中的菌体越来越少，最后容易形成单菌落，B正确；在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，因此按照图中划线顺序(d→c→b→a)，整个划线过程中至少需要对接种环灼烧5次，C正确；每次划线的菌种均来自上一区域的末端，因此划线的起始区域菌落多，由图乙可知，图甲中d区域菌落多，为划线的起始位置，D错误。 13．最常用的微生物的接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法。下列关于两者区别的说法，正确的是(　　) 类别 平板划线法 稀释涂布平板法 ① 需要接种环(灼烧灭菌) 需要涂布器(只需酒精消毒) ② 不需要对菌液梯度稀释 对菌液进行梯度稀释 ③ 能纯化微生物，不可计数 既能纯化微生物，又能计数 ④ 最后的划线区域一定出现单菌落 稀释倍数足够大的菌液，涂布的平板才会出现单菌落 A.②④ B．③④ C．①④ D．②③ 答案　D 解析　稀释涂布平板法中，用到的涂布器进行酒精浸泡消毒后要在涂布平板前进行灼烧灭菌，①错误；平板划线法不需要对菌液梯度稀释，稀释涂布平板法需要对菌液进行梯度稀释，②正确；平板划线法不能计算菌液中的活菌数，稀释涂布平板法可计算菌液中的活菌数，③正确；如果划线操作不规范，平板划线的最后划线区域也不一定出现单菌落，④错误。故选D。 14．使用特定的接种技术可以得到目标微生物的单菌落，实现对目标微生物的分离，回答下列问题： (1)一般情况下，培养基都可以为微生物的生存提供______________________________等。 (2)实验前需要确定培养基灭菌是否彻底，具体的操作是________________________________ _______________________________________________________________________________。 (3)下面是四种菌落的分布情况，其中属于通过稀释涂布平板法得到的是________(多选)。 答案　(1)水、碳源、氮源、无机盐和生长因子　 (2)将未接种的培养基放在恒温箱中培养一段时间，观察培养基上是否有菌落出现　(3)ABC 15．某研究小组从黄色短杆菌(能合成L－亮氨酸)中筛选L－亮氨酸缺陷型(不能合成L－亮氨酸)突变菌株，实验流程如图所示。回答下列问题： (1)培养基灭菌常用的方法是______________________________________。 (2)过程①的接种方法是____________________。过程②接种时，先将灭菌后的金丝绒与培养皿A中的菌落接触一次，然后像盖印章一样将菌种连续接种到培养皿B和C的培养基表面，这种接种方法便于将来比较培养皿B、C中菌落的差异，原因是__________________。 (3)培养皿A、B、C中的培养基都要使用固体培养基，原因是____________________。若培养皿B的培养基中含有L－亮氨酸，培养皿C的培养基中不含L－亮氨酸，培养一段时间后菌落生长情况如图所示，研究人员应该从培养皿______(填“B”或“C”)中选取目的菌落。 答案　(1)高压蒸汽灭菌法　(2)稀释涂布平板法　培养皿B、C中的菌种接种位置相同　 (3)便于观察菌落特征和分离目的菌株　B 解析　(2)根据过程①所得培养基中菌落的分布结果可以判断，该过程所采用的接种方法为稀释涂布平板法。先将灭菌后的金丝绒与培养皿A中的菌落接触一次，然后像盖印章一样将菌种连续接种到培养皿B和C的培养基表面，这种接种方法叫影印法，由于其不改变原有菌株在培养基中的位置，因而将来可比较培养皿B、C中菌落的差异。(3)为了便于观察菌落特征和分离目的菌株，培养皿A、B、C中的培养基都要使用固体培养基。在不含L－亮氨酸培养基中，突变菌株不能生长，而在含L－亮氨酸培养基中能够生长，因此培养皿B中的菌落中可挑选出突变菌株。 学科网（北京）股份有限公司 $$