3.1.3 目的基因的获取、DNA的粗提取和鉴定、基因表达载体的构建-【步步高】2023-2024学年高二生物学选择性必修3 生物技术与工程（苏教版）

第3课时　目的基因的获取、DNA的粗提取和鉴定、基因表达载体的构建 [学习目标]　1.简述目的基因的获取方法。2.简述基因表达载体的组成及构建过程。3.概述DNA的粗提取和鉴定的原理及过程。 一、目的基因的获取 1．基因工程的基本操作程序 包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞，以及目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。 2．目的基因的获取 (1)通过化学合成法直接人工合成目的基因 ①比较小的目的基因：在明确脱氧核苷酸序列后，可以通过DNA合成仪直接人工合成。 ②全基因或较大基因 a．方法：使用半合成的方法。 b．合成过程 ⅰ.合成基因的部分寡核苷酸片段。 ⅱ.适当条件下退火得到模板—引物复合体。 ⅲ.在dNTP存在的条件下，通过Klenow酶将双链DNA的突出5′端补平，合成相应的互补链，再用相应的DNA连接酶修复缺口，获得两条完整的互补双链。 (2)通过基因文库获取目的基因 ①基因组文库 a．概念：含有某种生物体全部基因片段的重组DNA的克隆群体。 b．构建过程 将提纯的原核生物或者真核生物的基因组DNA酶解―→随机片段体外重组得到一组含有不同DNA片段的重组DNA分子群体。 c．筛选：一般采用核酸探针杂交的方法，将某基因的已知片段作为筛选的探针，在基因组文库中筛选含有目的基因的菌落，进行扩增、分离回收而获得目的基因。 ②cDNA文库 a．构建：从组织细胞中提取mRNA，逆转录成cDNA，与适当载体连接后转化宿主。 b．概念：包含着某种细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。 c．构建合适的cDNA文库已成为获取真核生物目的基因的常用方法。 (3)获得基因组DNA或mRNA的基本过程 裂解细胞使核酸分子释放出来 ↓ 从释放出来的细胞成分中分离核酸分子 ↓ 纯化获得核酸分子 (4)质粒DNA的提取：先用碱裂解法获取质粒，再提取质粒DNA。 (5)纯化DNA的原理：通常利用了DNA与RNA、蛋白质等物质在理化性质方面的差异。 判断正误 (1)对于核苷酸序列已知且比较小的基因可通过化学合成法直接人工合成(　　) (2)Klenow酶是一种能将双链DNA的突出5′端补平的DNA聚合酶(　　) (3)一般采用核酸探针杂交的方法从基因组文库中筛选目的基因(　　) (4)cDNA文库含有该生物的所有基因(　　) 答案　(1)√　(2)√　(3)√　(4)× 任务一：cDNA文库的建立及分析 根据提供的资料和所学内容，讨论并回答下列问题： 资料　真核生物的基因结构及转录和加工过程图。 (1)cDNA文库是从某种生物的某一细胞中提取出mRNA，经逆转录过程获得的基因文库，为什么该基因文库仅含有该生物的部分基因？ 提示　由于基因的选择性表达，某种生物的某一细胞中仅有部分基因转录出mRNA，所以由该细胞中的mRNA逆转录得到的基因文库(cDNA文库)仅含有该生物的部分基因。 (2)根据提供的资料，推测cDNA文库与基因组文库相比，得到的基因中不含有哪些结构？ 提示　cDNA文库中的基因不含有启动子、终止子、内含子等结构。 　基因组文库与cDNA文库的比较 比较项目 cDNA文库 基因组文库 文库大小 小 大 基因中启动子(具有启动作用的DNA片段) 无 有 基因中内含子(位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段) 无 有 基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 物种间的基因交流 可以 部分基因可以 1．甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，下列相关说法错误的是(　　) A．甲方法可建立该细菌的基因组文库 B．乙方法可建立该细菌的cDNA文库 C．甲方法中的b过程要以脱氧核苷酸为原料 D．乙方法需要逆转录酶参与 答案　C 解析　甲方法获取的是该细菌的全部DNA分子，因此用限制酶切割后可用于构建基因组文库，A正确；乙方法表示用逆转录法获得DNA分子，只包含该生物的部分基因，因此可建立该细菌的cDNA文库，B正确；甲方法中的b过程，只需要利用限制酶将其原有的DNA切断即可，不需要以脱氧核苷酸为原料，C错误；乙方法中d为逆转录过程，需要逆转录酶参与，D正确。 2．(多选)下列关于基因工程及应用的叙述，不正确的是(　　) A．从cDNA文库中能获取某种生物的全部基因 B．一种核酸探针能从基因组文库中筛选出多种基因 C．利用半合成法合成全基因时只需要DNA连接酶的作用 D．构建合适的cDNA文库是获取真核生物目的基因的常用方法 答案　ABC 解析　从cDNA文库中只能获取某种生物的部分基因，从基因组文库中才能获取某种生物的全部基因，A错误；一种核酸探针只能筛选出一种基因，B错误；利用半合成法合成全基因时需要Klenow酶和DNA连接酶的作用，C错误。 二、DNA的粗提取和鉴定 1．DNA的粗提取 2．DNA的鉴定 (1)原理：在酸性条件下，DNA与二苯胺发生反应，溶液呈蓝色。 (2)步骤：将分离的丝状物放入物质的量浓度为2 mol·L－1的NaCl溶液中，使其溶解，再加入二苯胺试剂，沸水浴加热数分钟，溶液出现蓝色。 判断正误 (1)实验中加入2 mol·L－1的NaCl的目的是析出DNA(　　) (2)用玻璃棒搅拌时，动作要缓慢且沿同一方向进行，目的是防止DNA被破坏，但细胞破裂时应快速搅拌(　　) (3)过滤含DNA的黏稠物时能用滤纸代替纱布(　　) (4)DNA溶液中加入二苯胺试剂就会变蓝色(　　) 答案　(1)×　(2)√　(3)×　(4)× 任务二：DNA的粗提取和鉴定的探讨 根据DNA的粗提取和鉴定过程及提供的资料，讨论并回答下列问题： 资料1　DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度曲线。 资料2　DNA与蛋白质等物质的物理和化学性质有差异，如DNA不溶于乙醇，但某些蛋白质溶于乙醇。 (1)能否选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料？为什么？ 提示　不能；哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和各种细胞器，无DNA分子。 (2)根据资料1回答，在DNA的粗提取中，两次加入蒸馏水的作用相同吗？如不相同，分别分析其目的。 提示　实验中两次加入蒸馏水的目的不相同。第一次加入的目的是使鸡血细胞吸水涨破，释放出核物质，第二次加入的目的是稀释NaCl溶液，从而析出DNA。 (3)根据资料2中DNA和蛋白质在酒精中的溶解度的特点，分析如何将DNA和蛋白质进一步分离？ 提示　向溶解有DNA和蛋白质的溶液中加入适量冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液，溶液中会出现白色丝状物即DNA，而部分蛋白质会溶解在乙醇溶液中，这样可以对DNA起到进一步的纯化作用。 　实验材料的选取 (1)一般选取鸡血来提取DNA，鸡血中血细胞含量高，DNA含量丰富，材料易得，细胞易吸水涨破。也可以选用植物细胞如洋葱等，只是破碎植物细胞比较麻烦，提取洋葱DNA时，需要先将洋葱切碎，然后加入一定量的洗涤剂和食盐，进行充分搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。 (2)该实验中不能选用猪血等哺乳动物的血，因为哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和各种细胞器。 3．下列有关“DNA的粗提取和鉴定”实验的叙述，正确的是(　　) A．新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取 B．选用洋葱作为实验材料时可以使用吸水涨破法破坏细胞 C．DNA可溶于2 mol/L的NaCl溶液 D．溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后，颜色呈紫色 答案　C 解析　猪是哺乳动物，其成熟的红细胞没有细胞核和各种细胞器，所以猪血不能用于DNA的粗提取，A错误；植物细胞含有细胞壁，不能使用吸水涨破法破坏细胞，B错误；溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，需沸水浴加热后冷却，再观察溶液颜色(呈蓝色)，D错误。 4．图1、2分别为“DNA的粗提取和鉴定”实验中部分操作示意图，下列叙述错误的是(　　) A．图1中完成过滤后应向滤液中加入一定量的柠檬酸钠溶液 B．图2完成后要将玻璃棒上丝状物重新溶解到2 mol·L－1 的NaCl溶液中进行后续鉴定 C．图1、2中加入蒸馏水的目的不同 D．图1、2中搅拌的目的不同 答案　A 解析　在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液，A错误；图2完成后另取烧杯加2 mol·L－1NaCl溶液使丝状物重新溶解，进行后续鉴定，B正确；图1加入蒸馏水是使细胞吸水破裂，图2加入蒸馏水是析出DNA，C正确；图1搅拌是为了破碎鸡血细胞，图2用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，卷起丝状物，获得含有一定杂质的DNA，图1、2中搅拌的目的不同，D正确。 三、基因表达载体的构建 1．构建基因表达载体的目的 (1)使目的基因进入受体细胞并有效表达。 (2)使目的基因能稳定存在且遗传给后代。 2．基因表达载体的组成 3．载体的种类 (2)有些载体兼有克隆载体和表达载体的特点。 判断正误 (1)构建基因表达载体需用到限制酶和DNA连接酶(　　) (2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子(　　) (3)标记基因不一定是抗生素抗性基因(　　) 答案　(1)√　(2)×　(3)√ 任务三：基因表达载体构建的探讨 1．为什么目的基因要插入启动子和终止子之间？ 提示　启动子位于目的基因的上游，是RNA聚合酶识别、结合的部位，使转录开始；终止子位于目的基因的下游，使转录终止；只有顺序正确，目的基因才能正常转录。 2．构建基因表达载体时，可以选择用同一种限制酶或两种能产生相同末端的限制酶分别切割载体和目的基因所在的DNA分子，这两种方法分别简称为“单酶切法”和“双酶分别切割法”。此处，还可以选择用两种能产生不同黏性末端的限制酶分别同时切割载体和含有目的基因的DNA分子，这种新的方法被称为“双酶同时切割法”。 注：Ampr表示氨苄青霉素抗性基因。 由图示可知，质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分别形成黏性末端1与2，目的基因所在的DNA分子经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分别形成黏性末端3与4。 请结合上述内容回答下列问题： (1)已知限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ识别的核苷酸序列和切割位点分别为： 则DNA分子经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后所形成的末端是否互补(相同)? 提示　不互补(不相同)。 (2)黏性末端1与2能否经DNA连接酶连接？3与4呢？为什么？这说明“双酶同时切割法”具有什么优点？ 提示　均不能，因为这两种限制酶切割后形成的黏性末端不互补(不相同)。这说明“双酶同时切割法”能够避免载体和目的基因的自身环化。 (3)黏性末端1与4、2与3能否经DNA连接酶连接？这说明“双酶同时切割法”具有什么优点？ 提示　均不能，这说明“双酶同时切割法”能够避免载体与目的基因的反向连接。 1．根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 (1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 (2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 (3)为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)切割。 2．基因表达载体的构建过程 5．下列有关基因表达载体的叙述，不正确的是(　　) A．具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增 B．具有启动子，作为核糖体识别、结合的部位 C．具有标记基因，有利于重组DNA的鉴定和选择 D．具有目的基因，以获得特定的基因表达产物 答案　B 解析　基因表达载体具有启动子，启动子是RNA聚合酶识别、结合的部位，B错误。 6．(多选)基因工程常用土壤农杆菌Ti质粒作为载体，需把目的基因插入Ti质粒的T－DNA才能整合到植物染色体DNA上。如图表示抗虫棉培育中使用的三种限制酶A、B、C的识别序列以及Ti质粒上限制酶位点的分布，抗虫基因内部不含切割位点，两侧标明的序列为切割区域。下列叙述正确的是(　　) A．应该使用酶B和酶C切取抗虫基因 B．应该使用酶A和酶B切割Ti质粒 C．成功构建的重组质粒含1个酶A的识别位点 D．成功构建的重组质粒用酶C处理将得到2个DNA片段 答案　ABD 解析　在目的基因的左侧只有酶B的识别位点，右侧只有酶C的识别位点；质粒上含有三种酶的识别位点，其中T－DNA上含有酶A和酶B的识别位点，因此应选用酶B和酶C切取目的基因，选用酶A和酶B切割Ti质粒，A、B正确；酶A和酶C切割形成的黏性末端相同，使用酶B和酶C切取抗虫基因，使用酶A和酶B切割Ti质粒，再用DNA连接酶连接两者形成重组质粒后，重组质粒不含酶A的识别位点，C错误；成功构建的重组质粒含有两个酶C的识别位点，因此用酶C处理重组质粒将得到2个DNA片段，D正确。 题组一　目的基因的获取 1．下列不属于获取目的基因的方法是(　　) A．从基因文库中提取 B．利用逆转录合成 C．利用DNA转录合成 D．利用化学方法人工合成 答案　C 解析　利用DNA转录合成的是RNA，不是基因，C符合题意。 2．下列关于基因文库的说法，正确的是(　　) A．cDNA文库中的基因也有启动子 B．一种生物的cDNA文库只有一种 C．基因组文库的基因都可以在物种间进行基因交流 D．cDNA文库中只含有某种生物的部分基因 答案　D 解析　cDNA文库中的基因都没有启动子，A错误；由于cDNA文库中只含有某种生物的部分基因，因此该种基因文库可能有多种，而基因组文库中含有某种生物的全部基因，因此只有一种，B错误，D正确；基因组文库的部分基因可以在物种间进行基因交流，C错误。 3．观察分析下图，该图表示的过程是(　　) A．构建基因组文库 B．构建cDNA文库 C．构建基因表达载体 D．构建转基因工程菌 答案　A 解析　由图可知，该过程利用的是某种生物的基因组DNA，用限制酶切割后，与载体连接注入受体菌中，该过程是构建基因组文库。 4．为了在大肠杆菌细胞中成功表达人胰岛素基因，首先需要提取细胞的mRNA，经逆转录等过程来获取目的基因。下列相关叙述错误的是(　　) A．用于逆转录的mRNA只能从胰岛B细胞中获取 B．逆转录过程需要四种游离的核糖核苷酸作为原料 C．经逆转录得到的目的基因不含启动子和内含子 D．逆转录获取目的基因时遵循碱基互补配对原则 答案　B 解析　胰岛素基因只在胰岛B细胞中表达，因此只能从胰岛B细胞中获取用于转录的mRNA，A正确；逆转录过程是以RNA为模板合成DNA的过程，以四种游离的脱氧核糖核苷酸为原料，B错误；真核细胞的mRNA转录后通过加工剪切了内含子和启动子，因此逆转录得到的基因不含启动子和内含子，C正确。 题组二　DNA的粗提取和鉴定 5．在“DNA的粗提取和鉴定”实验中，实验原理是DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同。DNA的溶解和析出与图中所示曲线的对应点符合的是(　　) A．a点浓度最适合析出DNA B．b点浓度最适合析出DNA C．c点浓度最适合溶解DNA D．d点浓度最适合析出DNA 答案　B 解析　用高浓度的NaCl溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质，用低浓度的NaCl溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质，因此，反复溶解、析出DNA能除去与DNA溶解度不同的杂质。由题图可知，DNA在物质的量浓度为0.14 mol·L－1的NaCl溶液中的溶解度最小，因此最适合析出DNA，但是随着NaCl溶液浓度的增大或减小，DNA溶解度均逐渐增大。 6．(2019·江苏，10)下列关于DNA粗提取和鉴定的叙述，错误的是(　　) A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近 B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂 C．预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热 答案　A 解析　哺乳动物(如兔)成熟的红细胞无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于乙醇溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于乙醇溶液，预冷的、体积分数为95%的乙醇溶液可用来进一步纯化粗提的DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，D正确。 题组三　基因表达载体的构建 7．如图是基因工程中基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是(　　) A．目的基因插入位点 B．启动子 C．标记基因 D．DNA聚合酶识别位点 答案　B 解析　基因表达载体由启动子、终止子、标记基因、复制原点和目的基因等组成。题图中有终止子、标记基因(抗生素抗性基因)、目的基因、复制原点等，还缺少启动子。启动子位于目的基因的上游，所以X最可能是启动子，B符合题意。 8．在基因工程的操作过程中，获得重组质粒不需要(　　) ①DNA连接酶　②限制性内切核酸酶　③RNA聚合酶　④具有标记基因的质粒　⑤目的基因　⑥四种脱氧核苷酸 A．③⑥ B．②④ C．①⑤ D．①②④ 答案　A 解析　构建重组质粒时，首先要用限制性内切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和质粒，其次需要用DNA连接酶将目的基因与质粒连接；RNA聚合酶催化转录过程，获得重组质粒时不需要RNA聚合酶；获得重组质粒时，需要具有标记基因的质粒作为载体；重组质粒是由目的基因与质粒形成的；四种脱氧核苷酸是合成DNA的原料，获得重组质粒不需要四种脱氧核苷酸。 9．某目的基因两侧的DNA序列所含的限制性内切核酸酶的酶切位点如图所示，最好选用下列哪种质粒作为载体(　　) 答案　D 解析　目的基因仅一侧含有限制酶NheⅠ的识别序列，用此酶切割不能获取目的基因，A不符合题意；目的基因两侧分别含有限制酶AluⅠ的识别序列，但只用此酶切割可能会导致目的基因和质粒反向连接或自身环化，B不符合题意；目的基因两侧含有限制酶NheⅠ和AluⅠ的识别序列，但用这两种酶切割可能会产生不含目的基因的片段，C不符合题意；目的基因两侧分别含有限制酶NheⅠ和SmaⅠ的识别序列，用这两种酶切割既能获取目的基因，又能防止目的基因和质粒的自身环化和反向连接，D符合题意。 10．蜘蛛丝是天然蛋白纤维，其机械性能高于制作防弹衣的凯夫拉纤维，有广泛的应用前景。近期，中国科学家利用质粒(如图)成功构建了蛛丝蛋白基因的重组质粒，并在家蚕丝腺细胞中获得大量蛛丝蛋白。下列有关说法错误的是(　　) A．为防止目的基因自身环化，可以用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因 B．构建表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于目的基因在家蚕丝腺细胞中表达 C．启动子是RNA聚合酶识别、结合的部位，可以驱动遗传信息的复制和转录 D．基因表达载体中的标记基因可以鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞 答案　C 解析　用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因，可以使目的基因两端产生不同的黏性末端，防止目的基因自身环化，A正确；为能从家蚕丝腺细胞中提取蛛丝蛋白，基因表达载体中目的基因的上游必须含有使其能在家蚕丝腺细胞中转录的启动子，即构建表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于目的基因在家蚕丝腺细胞中表达，B正确；启动子只能驱动基因转录，不能驱动其复制，C错误。 11．如图为“DNA的粗提取和鉴定”实验(以鸡血为实验材料)中部分操作步骤示意图，图中装置可以进行该实验的多个步骤。若下列操作之前甲烧标中已加入相应的实验材料或溶液，相关叙述错误的是(　　) A．若向甲烧杯中倒入蒸馏水并快速搅拌，则应丢弃乙烧杯中滤液 B．若向甲烧杯中加入2 mol/L的NaCl溶液，则应保留乙烧杯中的滤液 C．若向甲烧杯中缓缓加入蒸馏水并轻缓搅拌，则应保留过滤物 D．若在甲烧杯中加入冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液并轻轻搅拌，则玻璃棒上会出现丝状物 答案　A 解析　若向鸡血中倒入蒸馏水并快速搅拌，使细胞吸水破裂，细胞内容物溢出，则应保留乙烧杯中的滤液，A错误；若向甲烧杯中加入2 mol/L的NaCl溶液，使DNA溶解，应保留乙烧杯中的滤液，B正确；若向甲烧杯中缓缓加入蒸馏水并轻缓搅拌，使DNA析出，则应保留过滤物，C正确；DNA不溶于乙醇，若在甲烧杯中加入冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液并轻轻搅拌，则玻璃棒上会出现丝状物(DNA)，D正确。 12．(多选)(2023·淮安高二检测)从人的胰岛B细胞中提取出总RNA，经逆转录后得到cDNA，以cDNA为模板，利用PCR扩增目的基因，可以得到的是(　　) A．胰岛素基因 B．呼吸酶基因 C．RNA聚合酶基因 D．生长激素基因 答案　ABC 解析　胰岛素基因、呼吸酶基因和RNA聚合酶基因在胰岛B细胞中都会表达，因此胰岛B细胞中有这些基因的mRNA，经过题干步骤可获得这三种基因，A、B、C符合题意；生长激素基因在胰岛B细胞中不表达，因此胰岛B细胞中没有该基因的mRNA，经过题干步骤不能获得该基因，D不符合题意。 13．(多选)如图为某种cDNA的制作流程示意图，下列相关叙述错误的是(　　) A．催化①②过程的酶都能促进双链间氢键的形成 B．核酸酶H能催化杂交双链中所有的磷酸二酯键的断裂 C．cDNA文库的构建需要提前了解目的基因的有关信息 D．该双链DNA在PCR仪中扩增时需要核酸酶H 答案　ABD 解析　催化①②过程的酶都能促进单链上磷酸二酯键的形成，但不能促进氢键的形成，A错误；核酸酶H只能催化杂交双链中RNA上的磷酸二酯键的断裂，B错误；cDNA文库的构建需要首先获得相应的mRNA，需要提前了解目的基因的有关信息，C正确；该双链DNA在PCR仪中扩增时不需要核酸酶H，D错误。 14．(多选)如图为某基因结构示意图及该基因上几种限制酶的酶切位点，下列相关叙述错误的是(　　) A．图中所示基因可能来自真核生物，也可能来自原核生物 B．PCR技术扩增该基因时，形成磷酸二酯键所需要的能量可由dNTP提供 C．利用PCR技术扩增该基因时，可根据Ⅰ、Ⅲ区域的DNA序列设计引物 D．用该基因作为目的基因和质粒构建重组质粒时，只能用SmaⅠ切割 答案　AD 解析　图中基因的编码区存在外显子和内含子，因此该目的基因来源于真核生物，A错误；Ⅰ、Ⅲ区域位于编码区上、下游，可根据这两区域DNA序列设计引物，C正确；SmaⅠ的酶切位点在编码区，会破坏目的基因，所以不能用SmaⅠ切割目的基因，D错误。 15．CTAB法是一种提取植物DNA的方法。通过有机溶剂抽提，去除蛋白质等杂质后，加入异丙醇获得的沉淀为CTAB与核酸复合物，用体积分数为75%的乙醇洗涤可去除CTAB，具体流程如图。请回答下列问题： (1)氯仿—异戊醇的密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。过程②中加入氯仿—异戊醇离心后，DNA主要存在于A中，则A为____________(填“上清液”或“沉淀物”)。 (2)过程④用体积分数为75%的乙醇洗涤后的沉淀物中含有RNA，为得到较为纯净的DNA，可先用一定浓度的__________溶液溶解沉淀物，然后加入__________酶，再重复步骤________(填图中序号)，最后在上清液中加入冷却的、体积分数为________，得到较纯净的DNA。 答案　(1)上清液　(2)NaCl　RNA　②　95%的乙醇 解析　(1)氯仿—异戊醇密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，这说明过程②中加入氯仿—异戊醇离心后，DNA主要存在于上清液。(2)去除沉淀物中的RNA需要使用RNA酶，故可先用一定浓度的NaCl溶液溶解沉淀物，然后加入RNA酶，再重复步骤②，最后在上清液中加入冷却的、体积分数为95%的乙醇，得到较纯净的DNA。 16．科研人员利用大肠杆菌构建了抗虫基因文库。最新研究发现漏斗蜘蛛中的AH基因控制合成的毒素肽具有显著的杀虫效果，现以p—B质粒为载体，构建AH基因的cDNA文库。图1表示p—B质粒，其中Cmlr表示氯霉素抗性基因，ccdB基因表达产物能抑制大肠杆菌DNA的复制。图中箭头表示相关限制酶的酶切位点，且不同种限制酶识别序列不同，其中AiuⅠ、XbaⅠ、SspⅠ和MfeⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别是－AG↓CT－、－T↓CTAGA－、－AAT↓ATT－、－C↓AATTG－。请分析并回答下列问题： (1)为获得AH基因的cDNA，先要从漏斗蜘蛛毒素肽分泌细胞中提取____________，再通过____________合成出AH基因的cDNA。若从漏斗蜘蛛其他组织细胞提取，则难以成功，原因是___________________________________________________________________________。 (2)若已知AH基因的cDNA两端部分序列为：5′－AACTATGCGC……CGTAGCCTCT－3′，请写出PCR扩增该cDNA时的两个引物对应的局部序列(前10个碱基序列)，并标明5′端和3′端：______________________、________________________。一个初始双链cDNA经四轮循环后，共消耗这两种引物的数量为________________个。 (3)利用图中的质粒和AH基因构建重组质粒时，宜选用限制酶______________________双酶切割质粒，再选用限制酶__________________________切割目的基因，将切割后获得的DNA片段混合，经____________处理后，再与大肠杆菌混合培养。 答案　(1)mRNA　逆转录　AH基因在其他组织细胞中不表达，提取不到AH基因的mRNA (2)5′－AACTATGCGC－3′　5′－AGAGGCTACG－3′　30　(3)AiuⅠ和MfeⅠ　SspⅠ和MfeⅠ　DNA连接酶 解析　(1)AH基因的cDNA可以通过逆转录获得，因此需要先从漏斗蜘蛛毒素肽分泌细胞中提取mRNA，再逆转录合成出AH基因的cDNA。由于AH基因在其他组织细胞中是不表达的，因此若从漏斗蜘蛛其他组织细胞提取，则难以成功。(2)根据题意分析，已知AH基因的cDNA两端部分序列为：5′－AACTATGCGC………CGTAGCCTCT－3′，则其在利用PCR技术进行扩增时需要两种不同的引物，且引物与目的基因(双链)两侧的碱基序列是互补的，因此两个引物对应的局部序列(前10个碱基序列)为5′－AACTATGCGC－3′、5′－AGAGGCTACG－3′。PCR技术的原理是DNA的半保留复制，则一个初始双链cDNA经四轮循环后，共消耗这两种引物的数量为21＋22＋23＋24＝30(个)。(3)根据图示分析可知，若用XbaⅠ切割会破坏复制原点；由于ccdB基因表达产物能抑制大肠杆菌DNA的复制，因此构建基因表达载体时，应该破坏该基因，即需要用MfeⅠ切割；若用SphⅠ和MfeⅠ切割会导致启动子丢失，若用MfeⅠ和SacⅠ切割，则不能获取目的基因。综上，利用图中的质粒和AH基因构建重组质粒时，切割质粒的酶应该是AiuⅠ(产生平末端)和MfeⅠ，切割目的基因的酶应该是SspⅠ(产生平末端)和MfeⅠ。 学科网（北京）股份有限公司 $$