3.2 实验突破2 DNA片段的扩增及电泳鉴定-【步步高】2023-2024学年高二生物学选择性必修3 生物技术与工程（人教版，京津琼）

一、DNA片段的扩增 1．实验原理 2．实验步骤 二、PCR扩增产物的电泳鉴定 1．实验原理 2．实验步骤 三、操作提示 1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 2．缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 四、关键点拨 1．PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在G、C含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。 2．未出现扩增条带的主要原因 (1)TaqDNA聚合酶失活。 (2)引物出现质量问题。 (3)Mg2＋浓度过低。 (4)变性时的温度低，变性时间短。 3．出现非特异性扩增条带的主要原因 (1)模板DNA出现污染。 (2)引物特异性不强或形成引物二聚体。 (3)Mg2＋浓度过高。 (4)复性时的温度过低等。 例1　(2023·云南昆明高二月考)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列相关叙述正确的是(　　) A．PCR仪实质上就是一台能自动调控温度的仪器，但在使用时需根据扩增的DNA片段以及引物的情况人工设定合适的温度 B．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在复性过程中起作用 C．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理 D．电泳时，电泳缓冲液不能没过凝胶，以免凝胶加样孔中的电泳样液流出 答案　A 解析　PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程中起作用，B错误；为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理，移液器不需要高压灭菌，C错误；电泳时，电泳缓冲液以没过凝胶1 mm为宜，D错误。 例2　用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是(　　) A．PCR产物的分子大小在250～500 bp之间 B．3号样品为不含目的基因的载体DNA C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D．10号确定反应体系等对结果没有干扰 答案　B 解析　PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段，4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A合理；3号PCR结果包含250～500 bp片段，应包含目的基因，B不合理；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C合理；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D合理。 1．使用PCR仪的正确实验操作顺序应为(　　) ①设置好PCR仪的循环程序　②按配方准备好各组分　③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分　④进行PCR反应　⑤离心使反应液集中在离心管的底部 A．②⑤③④① B．①⑤③②④ C．②③⑤①④ D．④②⑤③① 答案　C 解析　PCR反应的操作步骤一般为准备(包括配制试剂及将各试剂放于实验台上)→移液→混合→离心→反应。PCR仪是一种能自动调控温度的仪器，设置好循环程序就可以进行反应。 2．下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是(　　) A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理 B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，在－20 ℃储存 C．将PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出，需放在高温环境中迅速融化 D．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换 答案　C 解析　将PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出，需放在冰块上缓慢融化，C错误。 3．(2023·重庆渝中区高二期中)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　) A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间 C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度 答案　D 解析　增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带的产生，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少产生非特异性条带，B、C错误；非特异性条带增加的原因可能是复性温度过低而造成引物与模板的错配，故可通过提高复性的温度来减少非特异性条带的产生，D正确。 4．下列有关电泳的叙述，不正确的是(　　) A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B．待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率 C．进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动 D．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定 答案　C 解析　由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，C错误。 5．为优化目的基因(700 bp)的PCR条件，研究者设计不同的复性温度进行实验，产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图。据图分析，下列有关说法错误的是(　　) A．对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同 B．电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小呈正相关 C．复性温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度 D．58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度 答案　B 解析　实验设计应遵循对照原则与单一变量原则，故对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同，A正确；PCR技术中，反应最终的电泳条带的宽度、亮度与 PCR 起始状态的模板DNA(或者模板)含量呈正相关，B错误；据图可知，58 ℃条件下条带宽度最大，故该温度是本实验中扩增该基因的最佳复性温度，D正确。 6．(2023·江苏扬州高二期末)在基因工程操作中，科研人员利用两种限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图所示。下列相关叙述不正确的是(　　) A．电泳时，核酸的移动方向是从负极到正极的 B．该载体最可能为环状DNA分子 C．限制酶R1与R2的切点最长相距约600 bp D．两种限制酶在载体上识别的序列可能相同 答案　D 解析　根据图示可知，200 bp的DNA分子量小，800 bp的DNA分子量较大，200 bp的DNA移动速度快，所以在电泳时，核酸的移动方向是从负极到正极的，A正确；当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，B正确；两种限制酶同时切割时产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的切点最长相距约600 bp，C正确；当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种不同长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，二者识别的序列不相同，D错误。 学科网（北京）股份有限公司 $$