2.2.2 动物细胞融合技术与单克隆抗体课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

制剂只含有来自单个克隆B细胞的一种抗体，因此一种单克隆抗体对于特定的一种抗原表位有高度特异性而广泛利用，例如用于诊断微生物感染和癌症治疗。生产单克隆抗体第一步就是向动物注射特定的抗原，这个抗原上有特定的抗原表位，每个B细胞只产生一种类型的抗体。B细胞从脾脏提取分离，然后与骨髓瘤细胞杂交，这是一种可以无限繁殖的癌细胞。聚二醇是两种类型的细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞、B细胞的混合物。骨髓瘤细胞和杂交瘤在条件下培养这种培养基只允许杂交瘤细胞生长。每一个杂交瘤细胞都将产生一种单一的抗体，每种抗体针对特定的抗原表位，然后将单个杂交瘤细胞加入到微孔板中分开这一步是为了检测杂交瘤细胞是否能够产生特定的抗体。这样，能够产生针对特定抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞就被挑选了出来，然后进行培氧以及单克隆抗体的最终分离和纯化。 第一节 第2课时 动物细胞融合技术与单克隆抗体 第二章 动物细胞工程 本节聚焦 1.阐明动物细胞融合技术的概念，举例说出 诱导动物细胞融合的方法。 2.概述单克隆抗体的制备过程。 1．动物细胞融合的概念：使__________动物细胞结合形成______ 的技术。 2．原理：________________。 梳理归纳教材知识 两个或多个 一个细胞 细胞膜的流动性 电融合　 灭活病毒诱导　 回顾知识 4．意义：细胞融合技术突破了________的局限，使__________成为可能。 有性杂交 远缘杂交 5.单克隆抗体的制备过程 B 淋巴　 杂交 细胞 杂交 瘤　 能分泌 所需抗 体 回顾知识 回顾知识 3．单克隆抗体的优点 (1)能准确地识别________的细微差异。 (2)可以与特定抗原发生____________结合。 (3)可以________制备。 4．单克隆抗体的应用 (1)用作____________，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。 (2)运载药物，如ADC(抗体—药物偶联物)。 (3)直接用于治疗疾病。 抗原 特异性 大量 诊断试剂 1970年，动物细胞融合实验 旧知新学 以前学习： 现在学习： 这一实验以及相关的其他实验证据表明，细胞膜具有流动性。 什么是细胞融合？人细胞和小鼠细胞如何融合在一起的呢？ 一、动物细胞融合技术 1.概念：动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一 个细胞的技术。 2.原理：细胞膜具有流动性 3.诱导动物细胞融合的方法 物理法 化学法 生物法 电融合法；离心法 聚乙二醇（PEG）融合法；高Ca+—高pH法 灭活的病毒诱导法（仙台病毒） 诱导动物细胞融合特有的方法 一、动物细胞融合技术 4.动物细胞融合的过程 杂种细胞经第一次有丝分裂两个核才融合 一、动物细胞融合技术 5.动物细胞融合的结果： 形成一个杂交细胞（具有两个或多个细胞的遗传信息） 6.动物细胞融合的意义： 突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能 7.应用： 至今，种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。 研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。 为制造单克隆抗体开辟了新途径。 二、单克隆抗体的制备 传统方法如何获得抗体？ 向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。 用这种方法制备的抗体不仅产量低、纯度低，而且特异性差。 如何解决这一难题？ 二、单克隆抗体的制备 生物体内有上亿种B淋巴细胞，而每一种B淋巴细胞只产生一种特异的抗体。由一个B淋巴细胞增殖形成的细胞群所产生的单一型抗体分子就称为单克隆抗体。 但是在体外培养时，一个B淋巴细胞是不能无限增殖的，想要持续获 得单一型抗体，应该怎么做？ 已知骨髓瘤细胞能在体外大量增殖 B淋巴细胞 将二者融合？ 融合后的细胞就可能大量增殖，产生足够数量的特定抗体 1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒的实验 二、单克隆抗体的制备过程 用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗 体的B淋巴细胞。 多种B淋巴细胞。 培养骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞。 诱导融合 杂交1 杂交2 杂交3 杂交4 二、单克隆抗体的制备过程 置于特定的选择性培养基上培养 第一次筛选 用特定的选择培养基（HAT培养基）进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 融合后的细胞 × × × × 多种杂交瘤细胞 二、单克隆抗体的制备过程 多种杂交瘤细胞 克隆化培养 抗体检测 第二次筛选 抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能和特定的抗原结合） 抗原—抗体杂交技术 能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 体外或体内培养 单克隆抗体 二、单克隆抗体的制备过程 单克隆抗体的制备小结 动物细胞培养技术 动物细胞融合技术 单克隆抗体的制备小结 （1）该过程中应用到的技术__________________________________ （2）原理_______________________________________ （3）注射特定抗原的目的_____________________________________ ______________________________________ （4）诱导融合的方法______________________________________ 动物细胞特有的诱导融合方法为_______________________ （5）第一次筛选的目的______________________ 第一次如何筛选___________________________ 筛选原理___________________________________________ _____________________________ 动物细胞融合、动物细胞培养 细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖 用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞 PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法 灭活病毒诱导法 筛选获得杂交瘤细胞 用特定的选择培养基进行筛选 在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长 单克隆抗体的制备小结 （6）杂交瘤细胞的特点__________________________________ （7）第二次筛选的目的_______________________________________ 如何筛选_______________________________________ 选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即____________________ （8）抗体检测原理_______________________________________ （9）如何获取大量所需杂交瘤细胞____________________________ （10）如何获取单克隆抗体 ①体外培养___________________________ ②小鼠腹腔内培养_________________________ （11）单克隆抗体的优点______________________________________ _________________________________________________ 既能迅速大量增殖，又能产生抗体 获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选） 阳 分泌的抗体能与特定的抗原结合 抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定） 在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖 从细胞培养液中获取 从小鼠腹水中获取 能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备 特定的选择性培养基（HAT培养基）的筛选原理 ①细胞合成DNA有两条途径， 正常细胞内两种途径都有， 若全合成途径被阻断，可以 通过补救合成途径合成DNA； ②骨髓瘤细胞不能合成转化酶和激酶，因此只能进行全合成途径；③全合成途径能被氨基喋呤（A）阻断；④次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶（T）是补救合成途径的原料；⑤无增殖能力的细胞在培养基中存活仅5～7天。 将诱导融合后的细胞接种于HAT培养基后两周，则细胞生存状况及原因为：①B细胞和B-B细胞死亡，能进行补救合成途径，但是无增殖能力；②骨髓瘤细胞和瘤-瘤细胞死亡，两种途径均无法进行，无法合成DNA并增殖；③杂交瘤细胞存活，能进行补救合成途径，能合成DNA并大量增殖。 第一次筛选的原理 怎样再次筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。 二选方法：克隆化培养和专一抗体检测 第二次筛选的原理 动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较 动物细胞融合 植物体细胞杂交 原理 细胞膜的流动性 细胞膜的流动性、细胞的全能性 融合前处理 胰蛋白酶、胶原蛋白酶等使细胞分散开 纤维素酶和果胶酶除去细胞壁 诱导方法 电融合法、PEG融合法、灭活病毒诱导法等 电融合法、PEG融合法、离心法、高Ca2+—高pH融合法等 结果 得到杂交细胞 形成杂种植株 意义 突破远缘杂交不亲和的障碍,打破生殖隔离,扩展了杂交的亲本组合 【资料1】 用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。 三、单克隆抗体的应用 思考与讨论 抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体 诊断优点：具有准确、高效、简易、快速特点 三、单克隆抗体的应用 思考与讨论 【资料2】 使用高效的细胞 毒素类药物进行化疗可以有效杀 伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特 异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还 会对健康细胞造成伤害，这限制 了它在临床上的应用。抗体一药物偶联物（antibody-drug conjugates,ADC)通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如图所示。 1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？ 抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。 2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？ 可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。 3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？ 单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。 1.作为诊断试剂——最广泛的应用 三、单克隆抗体的应用 抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体 血型检测试剂 三、单克隆抗体的应用 (主要用于癌症治疗)如： 单克隆抗体+药物 =“生物导弹” 2.用于治疗疾病和运载药物 优点：位置准确、疗效高、副作用小 脂质体给药 高效 低毒 靶向 抗肿瘤药物载体：阿霉素脂质体和顺铂脂质体已在国外上市。 本节小结 一、概念检测 1．下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是 （ ） A．它们的原理都涉及细胞膜的流动性 B．都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合 C．融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞 D．前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株 ~~~~~练习与应用~~~~~ C 一、概念检测 2．科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（ ） A．利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒 B．体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体 C．将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即 为杂交瘤细胞 D．将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离 出的抗体为单克隆抗体 ~~~~~练习与应用~~~~~ A 随堂练习 1．如图为动物细胞融合技术过程图，相关叙述错误的是(　　)   A．图中C为灭活的病毒，此外还可用物理或化学方法诱导动物细胞融合 B．图中①过程发生了细胞膜的融合，体现了细胞膜的选择透过性 C．图中②过程表示细胞核融合形成杂交细胞 D．动物细胞融合技术可用于制备单克隆抗体 B 随堂练习 解析： 图中C为灭活的病毒，此外还可用物理或化学方法诱导动物细胞融合，A正确； 图中①过程发生了细胞膜的融合，体现了细胞膜的流动性，B错误；图中②过程表示细胞核融合形成杂交细胞，C正确； 利用动物细胞融合技术将小鼠骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合为杂交瘤细胞，可用于生产单克隆抗体，D正确。 随堂练习 2．对比动物细胞融合和植物体细胞杂交技术，下列论述合理的是 (　　) A.均可使用PEG、电融合或灭活病毒诱导细胞融合 B．两者都可以跨越种属间的生殖隔离 C．两者都可以体现细胞的全能性 D．在适宜的条件下，均可产生完整个体 B 随堂练习 解析： 灭活病毒是动物细胞融合特有的诱导因素，A错误； 动物细胞融合和植物体细胞杂交技术都可以打破生殖隔离，B正确； 植物体细胞杂交技术体现了细胞的全能性，动物细胞融合技术体现了细胞膜具有流动性，C错误； 目前，动物细胞融合技术不能产生完整个体，D错误。 随堂练习 3．甘草酸是中药甘草中的主要 活性成分。为了快速检测甘草酸， 科研人员利用细胞工程技术制备 了抗甘草酸的单克隆抗体，其基 本操作过程如图所示。下列相关叙述正确的是(　　) A．过程①只需要注射一次相应抗原 B．过程②诱导细胞融合，利用了细胞膜的选择透过性 C.过程⑤无论是在体内还是在体外进行，细胞丁都可大量增殖 D．过程③④筛选的目的相同 C 随堂练习 解析： 在进行小鼠免疫处理时，一般要每隔一段时间重复注射相同抗原，以获得更多的已免疫的B淋巴细胞，A错误； 细胞融合的原理是细胞膜的流动性，B错误； 杂交瘤细胞可在小鼠腹腔或体外培养液中大量增殖，C正确； 在制备单克隆抗体的过程中，过程③④筛选的目的不同，过程③的目的是获得杂交瘤细胞，过程④的目的是获得能产生所需抗体的杂交瘤细胞，D错误。 随堂练习 4．下列关于动物细胞融合与单克隆抗体制备的叙述，正确的是(　　) A．动物细胞经PEG诱导融合后再通过培养能得到优良动物个体 B．单克隆抗体最广泛的用途是用作体外诊断试剂 C．杂交瘤细胞是B淋巴细胞癌变的结果 D．单克隆抗体和传统方法生产的抗体化学本质不同 B 随堂练习 解析： 由于动物细胞的全能性受到限制，动物细胞融合形成的杂交细胞一般不能培育成动物个体，A错误； 单克隆抗体能准确识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备，最广泛的用途是用作体外诊断试剂，B正确； 杂交瘤细胞是骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合而成的，不是B淋巴细胞癌变的结果，C错误； 单克隆抗体和传统方法生产的抗体化学本质相同，都是蛋白质，D错误。 随堂练习 5．人体心肌细胞中的肌钙蛋白由三种结构不同的亚基组成，即肌钙蛋白T(cTnT)、肌钙蛋白1(cTn1)和肌钙蛋白C(cTnC)，其中cTn1在血液中的含量上升可作为心肌损伤的特异性指标。为制备出抗cTn1的单克隆抗体，研究人员完成了以下实验。请据图回答下列问题。 (1)动物细胞培养时，除了适宜的营养物质、温度等条件外，还需要控制气体条件为______与5% CO2的混合气体。为了防止培养细胞时有害代谢物的积累，可采用_____的方法，以清除代谢物。 (2)以cTn1作为抗原进行注射，引起小鼠产生免疫反应，经细胞诱导融合，甲、乙、丙中只含杂交瘤细胞的是________________；诱导动物细胞融合的常用方法有_______________(写出两种)。 (3)图示过程中的②表示将乙细胞接种到多孔培养板上，进行_________________，之后稀释、培养、再检测，多次重复上述操作，其目的是筛选获得______________的杂交瘤细胞。 随堂练习 95%的空气 定期更换培养液 乙、丙 PEG、灭活的病毒 克隆化培养和抗体阳性检测 能产生(特异性强、灵敏度高的)抗cTn1抗体的杂交瘤细胞 随堂练习 解析：(2)图中甲是融合后的细胞，而乙是经过选择培养基筛选后的细胞，丙是经多孔培养板筛选的细胞，故甲、乙、丙中只含杂交瘤细胞的是乙和丙；诱导动物细胞融合的常用方法有电融合法(物理法)、PEG(化学法)、灭活的病毒(生物法)。 (3)图中②过程表示将乙细胞接种到多孔培养板上，进行克隆化培养和抗体阳性检测，之后稀释、培养、再检测，并多次重复上述操作，就能获得足够数量的能分泌抗cTn1抗体的细胞。 3．诱导融合的方法 Lavf57.62.100 $$据介绍，一月中旬起，中国科学院微生物研究所迅速开展攻关，二月下旬从新冠肺炎痊愈出院患者体内分离筛选出两株理想的特效抗体动物模型，评估结果表明，中和抗体可以有效的阻断新冠病毒感染，显著降低恒河猴呼吸道中新冠病毒载量，减轻或阻断由病毒感染造成的肺部损伤。你如果康复病人血清那总是有限的，对不对？那你要人来献血，你不可能大规模的去使用，这是在局限单位。抗体内我就体外，我有很多的指控指标，对吧？我对这个抗体的产品进行严格的检测，大规模的培养，大发酵罐，几千升的上万升的发酵罐的培养，所以它很容易量产。严景华表示，该克隆抗体药物适用两类人群，一是用于治疗已经感染新冠病毒的患者，二是重点人群，包括医务人员密切接触者的预防。它与疫苗不同的是，疫苗属于主动免疫，使人体形成有记忆的免疫细胞，实现长期保护，单克隆抗体则属于被动免疫，它有三周左右的半衰期，在一个比较短的时间内产生保护作用。我们是怎么在这个实验室里找到我们想要的这个抗体细胞的呢？