第1章 第二节 纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得（课件PPT）-【新课程学案】2024-2025学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程（浙科版2019）

第二节 纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得 学习目标 1.概述微生物的分离和纯化的方法。 2.概述微生物数量的测定方法。 3.举例说明通过调整培养基的配方，可以有目的地培养某种微生物。 目 录 01 四层学习内容1 落实必备知识 02 03 04 四层学习内容2 融通关键能力 四层学习内容3·4 浸润学科素养和核心价值 课时跟踪检测 四层学习内容 落实必备知识 1 主干知识梳理 一、微生物的分离和纯化 1.单菌落 在______培养基上采用________________的方法接种，通过培养能获得由_____个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定__________的子细胞集团，这样的细胞集团称为单菌落。  固体 划线或稀释涂布 一 形态构造 2.平板划线法 类型 操作方法 连续 平行划线 从培养基上的一点出发，向______连续划平行线至覆盖整个培养基表面 扇形划线 从培养基的一点出发，向多方向多次划线。每划一条线，要将接种环在______________上灭菌，然后再次从______起点变换方向划线 多次连续 平行划线 划线可分______次进行，将培养皿旋转一定角度后，不需再次蘸取菌种，只需在上一次划线的______区域直接开始划线即可 左右 酒精灯的火焰 同一 3~4 末端 3.稀释涂布平板法 (1)步骤：菌液的_________→各取不同稀释度的菌液0.1 mL加在固体培养基表面→用________将菌液均匀涂布→培养。 (2)目标微生物的选择：根据______的形状、大小、颜色、边缘或表面光滑与否等特征选取目标微生物。 梯度稀释 涂布器 菌落 二、测定微生物的数量的方法 1.稀释涂布平板法 (1)减小随机误差：一是在保证能__________的前提下减小稀释度;二是将相同稀释度下的多组数值取_______后再进行计算。 (2)计算方法：每毫升菌液中微生物细胞的数量=某一稀释倍数下至少____个培养皿的平均菌落数÷菌液稀释液体积×稀释倍数。 准确计数 平均值 3 2.显微镜计数法 (1)血细胞计数板 ①一个血细胞计数板含有_____个计数区，每个计数区由_____ 个大方格组成，以1 mm×1 mm×0.1 mm大方格为例，其液体体积为_________。  ②计数区正中间的大方格为_______计数区，四角的四个大方格是_______计数区。 2 9 0.1 mm3 红细胞 白细胞 (2)酵母细胞计数 三、有目的地培养某种微生物 1.依据和方法 依 据 (1)不同自然环境中生活着的微生物______类型不尽相同 (2)许多微生物的代谢方式并不唯一 方 法 (1)调整培养基中营养物质的______及比例 (2)有针对性地为目标微生物提供所需的__________ 代谢 浓度 生长条件 2.选择培养基 概 念 在培养基中添加(或减去)某种______成分，使得只有某些特定的微生物能够生长，___________均不能生长的培养基 举 例 添加青霉素——筛选对_______有抗性的细菌;不添加氮源——筛选______微生物 化学 其他微生物 青霉素 固氮 12 3.能分解尿素的微生物的分离与计数 (1)实验原理 ①在以尿素为唯一______的选择培养基上生存的微生物能以尿素为______。 ②细菌合成的______能将尿素分解成NH3，致使pH升高，使酚红指示剂______。 (2)培养基的对照：制备100 mL _______________和100 mL尿素固体培养基，分别培养土壤中的微生物，对菌落观察并计数。 氮源 氮源 脲酶 变红 LB固体培养基 (3)实验步骤 1.判断下列说法的正误 (1)多次连续平行划线接种时，将培养皿旋转一定角度后，再次蘸取菌种，并沿上一次划线区域的末端开始划线。( ) 提示：多次连续平行划线接种时，将培养皿旋转一定角度后，不需再次蘸取菌种，只需在上一次划线的末端区域直接开始划线即可。 预习效果自评 × (2)对酵母菌计数时，用滴管吸取静置的培养液滴满血细胞计数板的方格区。 ( ) 提示：吸取培养液之前需要将培养液振荡以使酵母菌分布均匀，用滴管在盖玻片边缘滴加，让菌液渗满计数区。 × (3)平板划线法简单并且可以用来计数，稀释涂布平板法使单菌落更易分开，但操作复杂些。 ( ) 提示：平板划线法只能用来分离细菌，不能用来计数。 × (4)在培养基中加入酚红指示剂就可以筛选分解尿素的微生物。 ( ) 提示：能否实现筛选，与培养基中是否添加或控制特定物质有关，酚红为指示剂，只是用于鉴别分解尿素的微生物利用尿素的能力。 × (5)用稀释涂布平板法接种时，应先在火焰上使涂布器上的酒精燃尽，此时手持涂布器的部位应低于火焰。 ( ) 提示：手持涂布器的部位应高于火焰，以免酒精沿器具流下，烧伤手指。 × 2.微生物接种的方法很多，平板划线法是常用的 一种。如图是平板划线示意图，划线的顺序为①②③ ④。下列相关叙述错误的是 (　　) A.划线操作时，将蘸有菌液的接种环插入培养基 B.平板划线后培养微生物时要倒置培养 C.不能将第④次的划线与第①次的划线相连 D.在第②~④次划线前都要对接种环进行灭菌 √ 解析：划线时不能将接种环插入培养基，而是在培养基表面划线，A错误;用平板培养基培养微生物时，为防止水蒸气凝集滴入培养基造成干扰或污染，应将平板倒置培养，B正确;划线时要避免最后一次的划线与第一次的划线相连，否则有可能影响单个菌落的分离效果，C正确;在第②~④次划线前都要对接种环进行灼烧灭菌，保证每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，D正确。 3.图1甲、乙、丙、丁四幅图是倒平板操作过程图，图2是两种接种方法接种后培养的效果图，请回答下列问题： (1)请用图1文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：　　　　　　　　。  (2)甲、乙、丙中的灭菌方法是　　　　　　。  (3)丁中的操作需要等待　　　　　　　才能进行。  丙→乙→甲→丁 灼烧灭菌法 平板冷却凝固 (4)获得图2中图A效果和图B效果的接种方法分别是_________ ________和____________ 。  稀释涂布 平板法 平板划线法 (5)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么?应当怎样操作才可避免此种现象?________ _______________________________________________________________________________________________________________________________。 最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌。应采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌 精要内容把握 一、知识体系建一建 二、核心语句背一背 1.在固体培养基上采用划线或稀释涂布的方法接种，通过培养能获得由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团。 2.稀释涂布平板法接种时，通常需要先将菌液进行梯度稀释，并在培养皿侧面或底面做好标记。 3.稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量。 四层学习内容 融通关键能力 2 提能点(一)　微生物的分离和纯化 任务驱动 某男性患者，发热伴寒战，入院进行B超及CT检查，疑似肝脓肿。其中细菌性肝脓肿的主要病原菌是大肠埃希 菌、克雷伯杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌 及一些厌氧菌等。为确定致病原因需要进行 细菌的培养及药敏实验检查病原体种类。如图是医院进行的两种不同的微生物纯化操作。 (1)图A采用的何种分离方法，该方法利用的接种工具是什么? 提示：平板划线法，接种工具为接种环。 (2)图B采用的何种分离方法，该方法的操作难度是什么? 提示：稀释涂布平板法，该方法需要对菌液进行梯度稀释。 (3)医院采用图A所示方法分离患者体内的细菌时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是什么? 提示：将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。 生成认知 一、平板划线法 1.平板划线操作流程 2.平板划线操作的注意事项 (1)蘸取菌液及每次划线之前都需要灼烧接种环，划线操作结束后仍需灼烧接种环，三种灼烧的目的不同。 项目 目的 蘸取菌液前灼烧 避免接种环上可能存在的微生物污染菌种 每次划线前灼烧 杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端 划线操作 结束后灼烧 及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者 (2)在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免温度过高杀死菌种。 (3)除第一次划线外，每次划线都从上一次划线的末端开始，这样能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 (4)划线时用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。 二、稀释涂布平板法 1.稀释涂布平板法的操作步骤 操作图示 续表 相关说明 ①将分别盛有9 mL水的6支试管灭菌，并按10-1~10-6的顺序编号;②用移液管吸取1 mL培养的菌液，注入10-1倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸3次，使菌液与水充分混匀;③从10-1倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入10-2倍稀释的试管中，重复②步的混匀操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释 2.稀释涂布平板法的操作细节 (1)样品稀释的问题 稀释 原因 样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键 稀释 标准 选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数处于30~300，便于计数 (2)与涂布有关的问题 ①防止培养基外溅：在倒平板的过程中，不能将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。 ②涂布器的灭菌：涂布器用75%酒精消毒，取出时，多余酒精在烧杯中滴尽，蘸有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃。 ③设置对照：可排除实验中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 三、培养酵母菌的分析 1.将未接种的培养基(或接种等量无菌水的培养基)放入25 ℃左右恒温箱中培养的目的：作为空白对照，若有菌落生长，说明培养基被污染或灭菌不彻底。 2.接种成功的标准：若培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小等基本一致，并符合酵母菌菌落的特点(表面光滑湿润、黏稠、多为乳白色的圆形菌落)，则说明接种操作是符合无菌要求的;若培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，重新实验。 3.培养24 h与48 h后的酵母菌菌落的大小会有明显不同，培养48 h后的菌落明显较大，菌落颜色加深，光泽度增强。 4.如果在培养基上观察到了不同形态的菌落，原因可能是菌种不纯、培养基灭菌不彻底或在实验操作过程中被杂菌污染。 [例1]　(2024·温州十五校联考)图甲所示是稀释涂布平板法中的部分操作，图乙所示是平板划线法的操作结果。下列相关叙述错误的是 (　　) A.图甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能涂布菌液 B.对于浓度较高的菌液，若图甲中的最高稀释倍数仅为10-2，则所得到的菌落不一定是由单一的细胞繁殖而成的 C.图乙所示培养皿中每个划线区域都可得到符合要求的菌落 D.图乙中连续划线的起点是上一次划线的末端(除第一次划线外) √ [解析]　平板划线法中多次划线的目的是降低菌种浓度，经过连续划线才有可能得到由单个细胞繁殖而成的单菌落，这种菌落才符合要求，C错误。 [例2]　下图甲、乙是微生物接种常用的两种方式，回答相关问题： (1)图甲是利用　　　　　法进行微生物接种的，图乙是利用_______________法进行微生物接种的。这两种方法所用的接种工具分别是________和_________;对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是_________和酒精消毒。  [解析]　分析题图可知，图甲和图乙分别是利用平板划线法和稀释涂布平板法进行微生物接种的，这两种方法所用的接种工具分别是接种环和涂布器。对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是灼烧灭菌和酒精消毒。 平板划线 稀释涂布平板 接种环 涂布器 灼烧灭菌 (2)平板划线时，为保证微生物的数目随划线次数的增加而逐步减少，每次划线都要从　　　　　　　　　　　开始，平板划线结束后，最后一次划的线不能与第一次划的线　　　　　　　　　　　　　　。 [解析]　平板划线时，每次划线前都要从上一次划线的末端区域开始，最后一次的划线不能与第一次的划线相连。 上一次划线的末端区域 相连(或相接、相交、交叉等) (3)接种操作为什么一定要在酒精灯火焰附近进行? ______________________________。 [解析]　在酒精灯火焰附近存在着无菌区域，因此接种常在酒精灯火焰附近进行。 酒精灯火焰附近存在着无菌区域 (4)下图是接种后培养的效果图解，其接种方法是　　　(填“图甲”或“图乙”)所示方法。  [解析]　分析题图可知，培养基上的菌落分布均匀，则其接种方法为稀释涂布平板法。 图乙 (5)假设用图乙所示方法接种培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是_______________________________。  [解析]　采用稀释涂布平板法进行菌种分离时，稀释度要足够高，否则会导致微生物不能分散成单个细胞。 稀释倍数不够，菌液的浓度太高 跟踪训练 √ 1.(2024·杭州第二中学月考)平板划线法接种酵母菌时，下列操作正确的是 (　　) A.每次划线时，接种环都需要蘸取菌液一次 B.划线分离时，需要把接种环深入到培养基中进行接种 C.在超净工作台上接种时要在酒精灯火焰旁进行 D.划线分离后将培养皿正放在恒温培养箱中培养 解析：划线分离时，菌液只需蘸取一次，A错误;划线分离时，接种环在培养基表面进行划线操作，B错误;微生物培养的关键是无菌操作，在超净工作台上接种时，需要在酒精灯火焰旁进行，以防止空气中微生物的污染，C正确;划线分离结束后，培养皿应倒置于恒温培养箱中培养，D错误。 2.(2023·浙江1月选考)某同学想从泡菜汁中筛选耐高盐乳酸菌，进行了如下实验：取泡菜汁样品，划线接种于一定NaCl浓度梯度的培养基，经培养得到了单菌落。下列叙述正确的是 (　　) A.培养基pH需偏碱性 B.泡菜汁需多次稀释后才能划线接种 C.需在无氧条件下培养 D.分离得到的微生物均为乳酸菌 √ 解析：培养乳酸菌的培养基应偏酸性，A项错误;划线接种时，泡菜汁无需进行多次稀释，B项错误;乳酸菌是厌氧菌，需在无氧条件下培养，C项正确;泡菜汁中还有酵母菌等，因此分离得到的微生物不只有乳酸菌，D项错误。 3.如图是两种不同接种方法所得的结果，下列叙述正确的是 (　　) A.Ⅰ、Ⅱ两种接种方法使用的接种工具在接种前都要在酒精灯火焰上灼烧，且处理方法完全相同 B.进行接种之前都要对操作者双手和培养基进行灭菌处理 C.Ⅰ方法划线时，是沿方向①②③进行，且在③区域看到有单个菌落，可直接计数 D.Ⅰ、Ⅱ所使用的培养基可以相同，且制作时要先调pH再灭菌最后倒平板 √ 解析：图Ⅰ使用的工具是接种环，接种前需在酒精灯火焰上灼烧灭菌，冷却后再进行划线操作;图Ⅱ使用的接种工具是涂布器，涂布器的处理方法是将蘸有少量酒精的涂布器在酒精灯上引燃，燃尽且冷却后即可涂布，A错误。操作者的双手应进行酒精消毒处理，B错误。平板划线法不能对细菌计数，C错误。Ⅰ、Ⅱ所使用的培养基可以相同，且制作时要先调pH再灭菌最后倒平板，D正确。 提能点(二)　微生物数量的测定 任务驱动 酵母菌是一种应用很早的单细胞真菌。据史料记载我国四千年前的殷商时代，劳动人民就用酵母菌酿酒。酵母菌的用途广泛，与人类关系十分密切，在酿造、食品、医药工业等方面占有重要地位。可广泛用于食品发酵、酿造啤酒和制造酒精等。某科研小组使用显微镜计数法对一个批次培养液的酵母菌数量进行检测计数。 (1)计数前，该科研小组用注射器反复抽取部分培养液冲击剩下的培养液，这样做的目的是什么? 提示：促使培养液中的酵母菌均匀分布，减少误差。 (2)若用血细胞计数板计数细胞时，按下图所示的操作进行，统计出来的数据相比实际值有怎么样的变化?应该如何操作? 提示：统计出来的数值比实际值偏大。正确的操作应该是先盖上盖玻片，然后在盖玻片一侧滴细胞悬液。 (3)如图a为血细胞计数板计数区，图b为一个中方格中酵母菌数。请思考：统计图b中的酵母菌数量时，遵循什么原则?图b中可统计到几个酵母菌?在图a中用方框标出抽样计数区域。 提示：遵循原则：数上不数下，数左不数右。图b中可计数10个酵母菌。图a的抽样计数区如下： 生成认知 一、血细胞计数板及其使用 1.血细胞计数板：通常有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小方格;另一种是一个大方格分成25个中方格，每个中方格又分成16个小方格。但无论哪种规格的计数板，每个大方格都有16×25=400(个)小方格。一个大方格长和宽各为1 mm，深度为0.1 mm，容积为0.1 mm3。 2.计数方法：对于16×25的计数板而言，计四角的4个中方格共计100个小方格中的个体数量;而对于25×16的计数板而言，计四角和正中间的(共5个)中方格共计80个小方格中的个体数量。(如下图所示) 3.计算方法 (1)16×25型的计数板：酵母细胞个数/mL=(100个小方格细胞总数/100)×400×10 000×稀释倍数。 (2)25×16型的计数板：酵母细胞个数/mL=(80个小方格细胞总数/80)×400×10 000×稀释倍数。 二、微生物计数的方法 微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者的比较如表所示： 项目 直接计数法 间接计数法 原理 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察计数，再计算一定容积的样品中微生物的数量 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 培养基 计数数据 菌体本身 培养基上的菌落数 优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌 缺点 死菌、活菌都计算在内 操作较复杂，有一定误差 计算公式 每毫升原液含菌数=每小格平均菌体数×400×10 000 ×稀释倍数 每毫升原液含菌数=培养基上平均菌落数×稀释倍数÷涂布液体积 [例1]　(2024·浙江省名校协作体)血细胞计数板是酵母菌计数的常用工具，如图表示一个计数室及显微镜下一个中方格菌体分布情况。下列有关叙述错误的是 (　　) √ A.每次选取计数室四个角和中央的五个中格计数，目的是减小误差 B.需要先盖盖玻片再滴加样液，等酵母菌全部沉降后方可计数 C.每天的取样时间可任意选择，但取样前要摇匀培养液，目的是使酵母菌均匀分布，减小误差 D.若五个中格酵母菌平均数为上图所示，稀释104倍，则估算培养液中酵母菌的密度为6×1010个/mL [解析]　每次选取计数室四个角和中央的五个中格计数，目的是取样计数并求平均值，以减小误差，A正确;制片时，应先将盖玻片盖上，再将培养液滴在计数板的一侧，等酵母菌全部沉降后方可计数，B正确;每天计数酵母菌数量的时间要固定，防止由于取样时间不同造成实验误差，C错误;酵母菌在计数时，计数原则为“计上不计下，计左不计右”，因此计数相邻两边，如果计数的中格酵母菌平均数为题图右侧所示的24个，则培养液中酵母菌的密度=24÷16×400×104× 104=6×1010 个/mL，D正确。 [例2]　下图为土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验中样品稀释示意图。据图分析，下列叙述正确的是 (　　) A.3号试管的稀释倍数为103倍 B.4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰好为5号试管的10倍 C.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个 D.该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要多 √ [解析]　分析题图可知，3号试管的稀释倍数为104倍，A错误;4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数不一定恰好为5号试管的10倍，B错误;5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为(168+175 +167)÷3÷0.1×106=1.7×109(个)，C正确;在固体培养基上可能存在两个或多个菌体形成一个菌落的情况，因此用稀释涂布平板法得到的结果往往会比实际活菌数目少，D错误。 [归纳拓展] 用稀释涂布平板法计数微生物的方法 (1)稀释涂布平板操作要求：按照平行重复原则，同一稀释度下的菌液应涂布3个或3个以上的平板。 (2)计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。 (3)选择可用于计数的平板：选择菌落数在30~300的平板(相同稀释度的平板均符合该特点)进行计数，然后取平均值。 (4)每克样品中的菌株数=某一稀释度下平板上生长的平均菌落数÷涂布平板时所用的稀释液的体积×稀释倍数。 跟踪训练 √ 1.(2024·宁波十校适应性考)用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，对该实验有关叙述正确的是 (　　) A.涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233 B.涂布了一个平板，统计的菌落数是230 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中测试因素和非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数估计值 解析：用稀释涂布平板法测定同一样品中的细菌数时，为了保证结果准确，在每一个梯度浓度内，至少要涂布3个平板，确定对照组无菌后，进行计数，求其平均值，再通过计算得出土壤中的细菌总数，A正确，B、D错误;设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度，C错误。 √ 2.稀释涂布平板法是微生物培养的一种常用的纯化方法。下列相关叙述错误的是 (　　) A.操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释 B.不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落 C.需将不同稀释浓度的菌液分别涂布到固体培养基表面 D.操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理 解析：稀释涂布平板法的操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释，当稀释度足够高时，可在培养基表面形成单个的菌落，若稀释度不够高，细胞聚集在一起，得不到单个的菌落，A正确，B错误;需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面，C正确;操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理，以防杂菌污染，D正确。 3.某兴趣小组按如图方法对没有加工的鲜奶进行细菌检测。有关叙述正确的是 (　　) A.进行检测之前需要对鲜奶进行高压蒸汽灭菌处理 B.若培养基需要调节pH，应该在灭菌后进行 C.对鲜奶中细菌计数，常采用稀释涂布平板法，统计的结果往往比实际值偏高 D.若3个培养皿中菌落数为35、33、34，则鲜奶中细菌数为3.4×106个/mL √ 解析：实验的目的是检测鲜奶中的细菌数，若使用高压蒸汽灭菌处理鲜奶，则鲜奶就不含有细菌了，A错误;若培养基需要调节pH，应该在灭菌前进行，B错误;使用稀释涂布平板法对微生物计数，数值往往偏小，原因是两个或多个细胞连在一起时，在平板上只能观察到一个菌落，C错误;从图中可以看出涂布时添加的0.1 mL的鲜奶共稀释了10×10×10×100=105(倍)，所以鲜奶中细菌数为(35+33+34)÷3× 105=3.4×106(个/mL)，D正确。 提能点(三)　有目的地培养某种微生物 任务驱动 某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难于降解的有机化合物A，研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。 (1)培养基中加入化合物A的目的是什么?该培养基属于哪种类型的培养基? 提示：加入化合物A的目的是筛选能降解有机化合物A的菌种，这种培养基属于选择培养基。 (2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的何种物质? 提示：根据培养基成分可知，“化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素”，其中磷酸盐、镁盐以及微量元素均属于无机盐，因此有机化合物A为目的菌提供了生长所需的氮源和碳源。 (3)若实验需要振荡培养，请推测“目的菌”的代谢类型。 提示：异养需氧型。 生成认知 一、选择培养基及其使用方法 1.利用选择培养基筛选菌株的原理 根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。 2.利用不同方法筛选目标微生物 方法一：加入某种特定物质 原理 依据微生物对某些物质的抗性，在培养基中加入某些物质，以“促进”所需要微生物的生长，“抑制”不需要的微生物的生长 举例 ①培养基中加入高浓度的食盐，可抑制多种细菌生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可达到将该菌分离出来的目的;②在培养基中加入青霉素，可抑制细菌、放线菌生长，从而分离出酵母菌和霉菌等真菌 方法二：改变培养基的营养成分 培养基中缺乏碳源 异养微生物无法生存，而自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物 培养基中缺乏氮源 可分离出自生固氮微生物 方法三：利用“特定”成分分离 以尿素为唯一 氮源的培养基 可抑制不能利用尿素的微生物的生长，使能利用尿素的微生物生长，从而分离出分解尿素的微生物 以石油为唯一 碳源的培养基 可抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生长，从而分离出能消除石油污染的微生物 方法四：通过某些“特殊环境” 高盐 环境 可分离出耐盐菌，其他微生物在高浓度环境中易失水而死亡 高温 环境 可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而不能生存 二、土壤中分解尿素的微生物的分离实验整体思路 1.筛选过程 先将土壤样品稀释液接种在以尿素为唯一氮源的选择培养基上进行培养，再挑取选择培养基上形成的单菌落接种到加入酚红指示剂的鉴别培养基上培养，鉴别该菌株是否能产生脲酶。 2.过程分析 理论上，以尿素为唯一氮源的选择培养基能够筛选出分解尿素的微生物;但实际上固氮微生物、以尿素分解产物(氨)为氮源的微生物也可以在该培养基上生存;因此选择培养基上的菌落不一定是分解尿素的微生物，挑取单菌落后仍需进一步鉴别。 三、常见实验现象分析 内容 实验现象 结论分析 有无杂菌污 染的判断 用于对照的空白培养基中无菌落生长 培养基制备过程中未被杂菌污染 接种过的培养基中菌落数偏高，菌种的菌落形态多样 接种操作等过程中被杂菌污染 续表 选择培养基 的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显大于选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用 样品的 稀释操作 某稀释度下得到3个或3个以上菌落数目在30~300的平板 操作成功 重复组 的结果 若选取同一种土样，统计结果应接近。若结果相差太远，则需要从各项操作过程中去分析、寻找可能的原因 [例1]　(2024·浙江6月选考)脲酶催化尿素水解，产生的氨可作为细菌的氮源。脲酶被去除镍后失去活性。下列叙述错误的是 (　　) A.镍是组成脲酶的重要元素 B.镍能提高尿素水解反应的活化能 C.产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖 D.以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌 √ [解析]　根据题意，脲酶被去除镍后失去活性，说明镍是组成脲酶的重要元素，A正确;脲酶催化尿素水解的机理为降低化学反应所需的活化能，镍作为脲酶的重要组成元素，应该与降低尿素水解反应的活化能有关，B错误;产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖，C正确;产脲酶细菌能利用脲酶催化尿素水解产生的氨作为氮源，不能产脲酶的细菌则无法分解尿素获得氮源，因此以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌，D正确。 [例2]　从自然菌样中筛选较理想的生产菌种的一般步骤：采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。请回答下列问题： (1)不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养嗜盐菌的菌样应从　　　　(填“高盐”或“低盐”)环境中采集，培养厌氧菌的菌样应从　　　　(填“有氧”或“无氧”)环境中采集。  高盐 无氧 [解析]　在长期自然选择的作用下，生物与其生活环境相适应，培养嗜盐菌的菌样应从高盐环境中采集，培养厌氧菌的菌样应从无氧环境中采集。 (2)富集培养指创设仅适应于该条件的微生物旺盛生长的特定的环境条件，使待分离微生物在群落中的数量大大增加，从而达到从自然界中分离到所需的特定微生物目的的培养方法。对嗜盐菌富集培养的培养基应是　　　　培养基;对含耐高温淀粉酶的微生物富集培养应选择　　　　　　　　　的培养基，并在　　　条件下培养。  加盐 以淀粉为唯一碳源 高温 [解析]　对嗜盐菌富集培养的培养基应是加盐培养基，对含耐高温淀粉酶的微生物富集培养应选择以淀粉为唯一碳源的培养基且在高温条件下培养。 (3)实验室最常用的灭菌方法是高温处理。高温灭菌的原理是高温使微生物的蛋白质和核酸等物质发生　　　　。　　　　　　灭菌法是微生物研究和教学中应用较广、效果较好的湿热灭菌法。  [解析]　高温能使蛋白质和核酸发生不可逆转的变性，高压蒸汽灭菌法是应用较广、效果较好的湿热灭菌法。 变性 高压蒸汽 (4)纯化微生物培养的两种接种方法分别是　　　　　　　　、 　　　　　　。  [解析]　纯化微生物的两种接种方法分别是稀释涂布平板法和平板划线法。 稀释涂布平板法 平板划线法 跟踪训练 √ 1.(2024·杭州九校期中联考)下列对微生物进行选择培养或鉴定的叙述，不合理的是 (　　) A.在热电厂排污口周围的水体中容易筛选到耐热菌 B.筛选土壤中的真菌时需要在培养基中加入抗生素 C.向选择培养基中加入特定指示剂可以对筛选的菌落进行鉴定 D.从土壤中筛选尿素分解菌所用的培养基中只有尿素一种碳源 解析：筛选耐热菌时需要在温度较高的环境中取样，故热电厂排污口周围的水体中容易筛选到耐热菌，A合理;抗生素可以杀灭或抑制细菌的生长，因此筛选土壤中的真菌时需要在培养基中加入抗生素，B合理;对筛选的菌落进行鉴定时可以向选择培养基中加入特定指示剂，比如对筛选的尿素分解菌进行鉴定时可以向选择培养基中加入酚红指示剂，C合理;从土壤中筛选尿素分解菌所用的培养基只有尿素一种氮源，D不合理。 2.(2024·浙考联盟改编)为提高一种石油降解菌净化能力，将其涂布于以石油为唯一碳源的固体培养基上，以致死率为90%的辐照剂量诱变处理，下列叙述不合理的是 (　　) A.将培养基分装于培养皿中后灭菌，可降低培养基污染的概率 B.用于对照的空白培养基中无菌落生长，说明培养基未被杂菌污染 C.需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，以确定最佳诱变时间 D.挑取培养基上长出的较大单菌落，纯化后进行降解效率分析 √ 解析：培养基应该先灭菌，再在超净工作台上分装到培养皿中，A错误;用于对照的空白培养基中无菌落生长，说明培养基未被杂菌污染，B正确;可通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，以确定最佳诱变时间，C正确;结合题干信息分析可知，石油降解菌能分解石油获得碳源，维持生长，形成菌落，菌落越大说明降解能力越强，故挑取培养基上长出的较大单菌落，纯化后进行降解效率分析，以获得能高效降解石油的菌种，D正确。 3.(2024·9+1联盟高三测评)下表是关于对四种生物能源、碳源、氮源的来源和新陈代谢类型的描述，其中正确的一组是 (　　) 项目 硝化细菌 乳酸菌 根瘤菌 衣藻 能源 NH3 乳酸 N2 光能 碳源 CO2 糖类 糖类 CO2 氮源 NH3 N2 N2 N 代谢类型 自养需氧型 异养厌氧型 自养需氧型 自养需氧型 A.硝化细菌与乳酸菌　　 B.乳酸菌与根瘤菌 C.根瘤菌与衣藻 D.硝化细菌与衣藻 √ 解析：硝化细菌能将NH3氧化成亚硝酸和硝酸，并利用该过程释放的化学能，将CO2和水合成有机物，属于自养需氧型生物，其氮源和能源都是NH3，碳源是CO2;乳酸菌是异养厌氧型生物，不能直接利用N2，氮源是N等，碳源和能源为糖类;根瘤菌是能固氮的异养需氧型生物，进行生命活动所需要的能量来自糖类等有机物的氧化分解，氮源是N2，碳源和能源是糖类;衣藻是低等植物，能利用光能进行光合作用制造有机物，属于自养需氧型生物，其能源是光能，碳源是CO2，氮源是N等。 四层学习内容 浸润学科素养和核心价值 3·4 科学思维——运用归纳法比较平板划线法和稀释涂布平板法 比较项目 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散 将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以形成单细胞菌落(标准菌落) 接种工具 接种环 涂布器 单细胞菌 落的获得 单细胞菌落从最后划线的区域挑取 只有合适的稀释度，才能得到单细胞菌落 续表 用途 分离纯化菌种，获得单细胞菌落 ①分离纯化菌种，获得单细胞菌落;②用于计数 操作难 易程度 操作较简便，细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，细菌逐步分散开 操作比较复杂，需将菌液进行一系列的梯度稀释和涂布培养，需涂布多个平板 续表 接种 效果图 共同点 ①都能分离纯化菌种; ②都是在固体培养基上进行的; ③都需要在酒精灯火焰旁进行接种 素养评价 1.(2024·宁波效实中学月考)微生物的接种方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。下列关于两者区别的说法，正确的是 (　　) 类别 平板划线法 稀释涂布平板法 ① 需要接种环(灼烧灭菌) 需要涂布器(只需酒精消毒) ② 无需对菌液梯度稀释 对菌液系列梯度稀释 ③ 能纯化微生物，不可计数 既能纯化微生物，又能计数 ④ 最后的划线区域一定出现单菌落 稀释倍数足够大的菌液，涂布的平板才会出现单菌落 A.②④　　　　　　　　　　 B.③④ C.①④ D.②③ 解析：稀释涂布平板法中，用到的涂布器进行酒精浸泡消毒后要在涂布平板前进行灼烧去除表面残留少量酒精且有利于灭菌，①错误;平板划线法不需要对菌液梯度稀释，稀释涂布平板法需要对菌液进行系列梯度稀释，②正确;平板划线法不能计算菌液中的活菌数，稀释涂布平板法可计算菌液中的活菌数，③正确;如果划线操作不规范，平板划线的最后划线区域也不一定出现单菌落，④错误。 √ 2.为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题： (1)通常培养基采用　　　　　法灭菌;待平板冷却至　　　　左右时进行倒平板操作，待平板冷却凝固后，应将平板倒过来放置，这样做的目的是　 　　　　　　　　　　　　　　　　　。  解析：微生物培养过程应该进行无菌操作，配制的培养基要进行高压灭菌;倒平板操作的适宜温度为培养基冷却至60 ℃左右，将平板倒置的作用是防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 高压灭菌 60 ℃ 防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染 (2)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是　　　　　　　　　　　　　　;然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液;经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37，据此可得出每升水样中的活菌数为　　　　　。  检测培养基平板灭菌是否合格 3.8×107 解析：为了检测培养基灭菌是否彻底，应该取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间。根据题意分析，3个平板的菌落数分别是39、38和37，且水样稀释了100倍，体积为0.1 mL，因此每升水样中的活菌数为(39+38+37)÷3÷0.1×100×1 000=3.8×107(个)。 (3)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过 ______灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　 　。  解析：在采用平板划线法分离菌种的过程中，对接种环常用的灭菌方法是灼烧灭菌;在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，目的是将聚集的菌体逐渐稀释分散以便获得由单个细胞繁殖而来的单菌落。 灼烧 将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落 (4)示意图A和B中，　　　表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。  解析：据图分析可知，图A表示的是用平板划线法接种培养后得到的结果，图B表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。 B (5)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养，结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因：振荡培养能提高培养液中 　　　　的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高_________的利用率。  溶解氧 营养物质 解析：根据题意分析，振荡培养不仅提高了培养液中溶解氧的含量，还可使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率，使细菌生长速度加快。 教材活动与课后习题参考答案 Ⅰ.活动“接种、培养并分离酵母菌”讨论题参考答案(教材P13) 1.提示：与未接种的培养基相比，接种的培养基由于酵母菌的增殖而变浑浊。 2.提示：与用酵母菌纯种在固体培养基表面接种的结果相比，用样品稀释液接种的固体培养基表面出现特征相同的菌落即认为可能是分离出了酵母菌单菌落。 3.提示：若出现，可能是在接种过程中有杂菌污染(根据菌种来源不同，可能有多种合理答案)。 4.提示：否。方法一：挑取单菌落接入糖水中，培养一段时间检查是否能产生酒味;或接入面团中观察能否发面;方法二：挑取菌落样品，制作临时装片，在显微镜下观察、识别。 Ⅱ.活动“能分解尿素的微生物的分离与计数”讨论题参考答案(教材P19) 1.提示：会影响实验结果。如果先取用稀释度小的菌液，微生物浓度大，再用同一移液器吸取稀释度大的菌液，就会提高后者的细菌数目，从而导致较大的统计误差。 2.提示：应统计稀释度为1的3个培养皿中的菌落数后取平均值。因为这个浓度的培养皿中菌落数比较适中，计数的结果误差较小。 3.提示：因为培养基中加入了酚红指示剂，当培养基pH升高指示剂会变红。提示这些微生物能够合成脲酶而将尿素分解成氨。氨可使培养基的碱性增强，从而使颜色发生改变。 4.提示：答案合理即可。 意见一：合理，因为自生固氮微生物能在固氮酶的作用下，将N2转化为可利用的氮源，故可在没有氮源的培养基上生长。 意见二：不合理，因为F培养皿中微生物总数相对少于E培养皿，所以如果延长培养时间，培养基仍有可能改变颜色。 意见三：不合理，应挑取培养基未变色区域的菌落，清洗除去细胞表面的培养基后接种在无氮源的培养基上，观察其生长情况，才能证明其是否为能固氮的微生物。 Ⅲ.课后思考与练习参考答案(教材P22) 一、选择题 1.D　2.D　3.B　4.D 二、简答题 1.提示：根据微生物的代谢特征调整培养基的配方，可以抑制不具有某种代谢特征的微生物生长，只有具备相应代谢特征的微生物才能生长，从而实现分离微生物的目的。 2.提示：从自然界中分离能产生某种特定水解酶的微生物的主要过程： (1)在含有特定化合物的环境中取样并制成菌悬液。 (2)配制含特定化合物的液体培养基，将菌悬液接种其中培养。一段时间后，若检测到特定化合物含量下降，即认为采集到了所需菌种。 (3)配制含该特定化合物的培养基平板，将以不同梯度稀释的菌悬液在平板上涂布或划线接种。 (4)挑取单菌落接种于含一定量特定化合物的培养液中培养24~48 h后，检测特定化合物的含量变化以确认选取的微生物菌种是否为所需菌种。 课时跟踪检测 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 √ 检测(一)　纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得 A级——基础综合练 1.(2023·山东高考)平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是(　　) A.不含氮源的平板不能用于微生物培养 B.平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒 C.接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃 D.利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 解析：不含氮源的平板可用于固氮微生物的培养，A错误;平板涂布时涂布器使用前必须浸在酒精中，然后在火焰上灼烧灭菌，B错误;使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误;只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物，D正确。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 √ 2.如图是利用平板划线法在培养基上获得微生物 单菌落的实验操作，下列叙述错误的是 (　　) A.该接种过程一般需灼烧接种环5次 B.划线结束可看到划线末端出现不连续单菌落 C.如果培养的是尿素分解菌，可加入酚红指示剂鉴定 D.该接种方法常用来纯化该种微生物但不能计数 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：分析图示可知，该操作过程划线接种4次，因此需灼烧接种环5次;划线结束，需进行培养才可在划线末端出现单菌落;尿素被分解产生NH3，NH3会使培养基的碱性增强，酚红指示剂在碱性情况下呈红色;平板划线法操作简单，但是无法计数培养液中微生物的数量。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 √ 3.为探究结核杆菌的耐药性，研究人员提取患者体内病原菌进行培养，如图1，过程Ⅰ接种纯化结果如图2，下列说法错误的是 (　　) A.固体平板培养使用的培养基属于鉴别培养基 B.图2中划线的顺序依次是①③② C.两个固体平板培养基中均需加入抗生素 D.过程Ⅲ得到的结核杆菌均具有耐药性 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：分析题图可知，过程Ⅰ是接种纯化，使用的培养基应属于选择培养基，A错误;根据图2中菌落分布的特点，划线次数越多，细菌数量越少，可以推导出划线的顺序依次是①③②，B正确;为了防止杂菌污染，确保分离到耐药性的结核杆菌，两个固体平板培养基中均需加入抗生素，C正确;经选择培养基筛选，得到的结核杆菌均具有耐药性，D正确。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 √ 4.(2024·温州新力联盟联考)如图为“能分解尿素的微生物的分离与计数”的实验结果，下列叙述正确的是 (　　) A.图中采用平板划线法接种 B.图中①和②表示尿素培养基长出的菌落 C.图中③④培养基中菌落生长代谢时，会释放CO2 D.实验结果表明，自然界中能合成脲酶的微生物比例较高 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：根据实验结果可知，图中采用的接种方法为稀释涂布平板法，A错误;图中①和②(稀释度较大)的菌落数明显多于③(稀释度较小)的菌落数，说明①和②中的培养基很可能是LB固体培养基，B错误;③④已经分离出单个细菌繁殖而来的尿素分解菌的菌落，尿素分解菌分泌脲酶，能够催化尿素分解成氨、CO2和水，C正确;根据实验结果判断自然界中能合成脲酶的微生物比例较低，D错误。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 5.(2024·温州新力联盟月考)某同学依据下图操作步骤，从土壤中分离能分解尿素的微生物。其中尿素固体培养基和尿素液体培养基均以尿素为唯一氮源。下列叙述正确的是 (　　) 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 A.尿素固体培养基比尿素液体培养基多了琼脂 B.以尿素为唯一氮源的培养基的灭菌方式是过滤灭菌 C.利用液体培养基的培养需要振荡以提高营养成分的利用率 D.两种步骤获得的菌落比值相等(甲1/甲2=乙1/乙2) √ 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：尿素固体培养基比尿素液体培养基多了琼脂和酚红指示剂，A错误;以尿素为唯一氮源的培养基的灭菌方式是高压蒸汽灭菌，其中的尿素溶液用无菌的G6玻璃砂漏斗进行过滤除菌，B错误;利用液体培养基进行培养的过程中，通过振荡可以提高营养成分的利用率，C正确;两种步骤获得的菌落比值关系为(甲1/甲2>乙1/乙2)，因为后者经过了对尿素分解菌的选择培养，所以尿素分解菌的比例变大(杂菌菌落减少)，D错误。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 6.金黄色葡萄球菌具有高度耐盐性，可引起人肠炎等疾病，在血平板(培养基中添加适量血液)上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色。某研究小组要测定某地自来水中金黄色葡萄球菌的浓度，将自来水依次稀释成10-1、10-2、10-3、10-4四种稀释液。下列说法错误的是 (　　) A.配制培养基时应先调pH到中性偏碱后灭菌 B.该培养基能起到鉴别金黄色葡萄球菌菌落的作用 C.培养基中加入高浓度NaCl有利于金黄色葡萄球菌的筛选 D.若在10-3稀释液的3个血平板上(每个接种0.1 mL)，金黄色葡萄球菌菌落数分别为35、36和37，则每升自来水中的活菌数约为3.6×105个 √ 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：金黄色葡萄球菌(细菌)适宜pH为中性偏碱，配制培养基时应先调pH再灭菌，防止调pH时造成杂菌污染，A正确;金黄色葡萄球菌在血平板(培养基中添加适量血液)上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色，由此可见该培养基能起到鉴别金黄色葡萄球菌菌落的作用，B正确; 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 由于金黄色葡萄球菌具有高度耐盐性，高浓度NaCl不影响金黄色葡萄球菌生长的同时能抑制其他菌的生长，因此，金黄色葡萄球菌的培养基中加入高浓度NaCl，有利于金黄色葡萄球菌的筛选，C正确;若在10-3稀释液的3个血平板上(每个接种0.1 mL)，金黄色葡萄球菌菌落数分别为35、36和37，则每升自来水中的活菌数约为(35+36+37)÷3÷ 0.1×103×1 000=3.6×108(个)，D错误。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 7.莠去津是一种含氮的有机化合物，是一种广泛使用的除草剂，且在土壤中不易降解。为修复被其污染的土壤，某研究小组按下图选育能降解莠去津的细菌(目的菌)。已知莠去津在水中溶解度低，含过量莠去津的固体培养基不透明。下列说法错误的是 (　　) 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 A.图中A~C均为以莠去津为唯一氮源的选择培养基 B.A~C培养的目的是增加目的菌的数量 C.本实验用到的固体培养基在接种前是不透明的 D.周围无透明圈的菌落即为目的菌落 √ 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：据题图分析可知，从A瓶到C瓶液体培养的过程称为选择培养，目的是初步选择能降解莠去津的细菌(目的菌)，并提高其密度，故为获取目的菌，图中A~C均为以莠去津为唯一氮源的选择培养基，A~C培养的目的是选择并扩大培养目的菌，A、B正确;据题干信息“已知莠去津在水中溶解度低，含过量莠去津的固体培养基不透明”可知，固体培养基在接种前是不透明的，原因是培养基中含过量莠去津，当莠去津被降解后，培养基会变透明，所以培养基中有透明圈的菌落即为目的菌落，C正确，D错误。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 8.(2024·鄞州中学月考)已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。 Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。 Ⅱ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。 Ⅲ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 回答下列问题。 (1)在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是　　　　　　　　。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是　　　。  解析：牛肉膏蛋白胨培养基中，牛肉膏、蛋白胨为微生物提供了氮源，而Ⅱ号、Ⅲ号培养基中除X外的其他物质均不含碳，所以能为微生物提供碳源的有机物是X。 牛肉膏、蛋白胨 X 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 (2)若将土壤悬液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会　　　，其原因是_______________________ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 解析：因为Ⅱ号培养基中碳源只有X，相当于选择培养基，只有能降解X的细菌才能增殖，而不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖。 下降 不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 (3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是________________。  解析：要对菌落进行计数，应采用稀释涂布平板法进行接种。 稀释涂布平板法 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 (4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该细菌的生长提供 _______和____________________。  解析：在有氧条件下，丙酮酸参与细菌的需氧呼吸，可以为该细菌的生长提供能量和合成其他物质的原料。 能量 合成其他物质的原料 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 B级——应用创新练 9.(2024·浙江超级全能生联考)如图为某同学取1 mL培养液稀释100倍后，用血细胞计数板(1 mm×1 mm×0.1 mm)通过显微镜观察到的培养液中的酵母菌在血细胞计数板中的分布情况。下列相关叙述错误的是(　　) 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 A.该培养液中酵母菌的数量为6×108个/mL B.选择图示乙规格的计数室，含25个中方格、400个小方格 C.一个血细胞计数板中央仅含有一个计数室 D.取样时滴管从静置的培养液底部吸取，会导致数据偏大 √ 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：由乙图可知，该血细胞计数板的规格为25个中方格×16个小方格，即一个大方格中含有400个小方格，乙中一个中方格含24个酵母菌，则一个大方格中含24×25=600(个)酵母菌，因大方格体积为0.1 mm3，又稀释了100倍，所以酵母菌为600÷0.1×100×1 000=6× 108(个/mL)，A、B正确;一个血细胞计数板中央含有两个计数室，C错误;静置的培养液中酵母菌细胞沉到底部，直接从底部吸取会导致细胞数目偏多，数据偏大，D正确。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 10.自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是有关土壤中分解尿素的细菌分离和计数的实验过程，请回答有关问题。 (1)为分离出土壤中分解尿素的细菌，应该用___________________的培养基进行分离，这种培养基属于　　　培养基(按功能分类)。可在培养基中加入　　　指示剂对该类微生物鉴别。  尿素作为唯一的氮源 选择 酚红 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：用尿素作为唯一氮源的培养基能够选择出分解尿素的微生物，这种培养基属于选择培养基。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 (2)若取土样6 g，应加入　　mL的无菌水配制成稀释10倍土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释，配制成101~107不同浓度的土壤溶液。将103~107倍的稀释液分别吸取0.2 mL加入到固体培养基上，用涂布器将菌液铺平，每个稀释度下至少涂布3个平板，这种接种方法称为　　　　　　　　。将接种的培养皿放置在37 ℃恒温培养箱中培养24 h~48 h，观察并统计菌落数，结果如表，其中____倍的稀释倍数比较合适，由此计算出每克土壤中的细菌数为_________。这种方法测定的菌落数往往比活菌的实际数目　　(填“低”或“高”)。  54 稀释涂布平板法 105 1.32×108 低 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：若取土样6 g，应加入54 mL的无菌水配制成稀释10倍土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释，配制成101~107不同浓度的土壤溶液。将103~107倍的稀释液分别吸取0.2 mL加入到固体培养基上，用涂布器将菌液铺平，每个稀释度下至少涂布3个平板，这种接种方法称为稀释涂布平板法。在每一个梯度浓度内，至少要涂布3个平板，选择菌落数在30~300的进行计数，求其平均值，由题表可知，105倍的稀释倍数比较适合计数，再通过计算得出土壤中细菌总数。由此计算出每克土壤中的细菌数≈(277+261+254)÷3÷0.2×105=1.32×108。由于一个菌落可能是由一个或多个细菌繁殖而来，因此这种方法测定的细菌数往往比活菌的实际数目低。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 稀释倍数 103 104 105 106 107 菌落数/个 1号平板 478 367 277 26 5 2号平板 496 354 261 20 8 3号平板 509 332 254 29 3 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 (3)若研究尿素分解菌的群体生长规律，可采用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌。操作时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是__________ _______________________________________。将分离纯化后的单个菌落进行液体培养，可采用定期取样的方法进行显微计数。若以一个大方格(体积为0.1 mm3)有25个中方格的计数板为例进行计算，设五个中方格中总菌数为45，菌液稀释倍数为102，那么原菌液的菌群密度为　 　　　　个/mL。  将聚集的菌体逐步稀释以便获得(不连续的)单个菌落 2.25×108 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：平板划线法分离土壤中的尿素分解菌时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次划线区域的末端开始划线，这样做是将聚集的菌体逐步稀释以便获得(不连续的)单个菌落。将分离纯化后的单个菌落进行液体培养，可采用定期取样的方法进行计数。若以一个大方格(体积为0.1 mm3)有25个中方格的计数板为例进行计算，设五个中方格中总菌数为45，菌液稀释倍数为102，那么原菌液的菌群密度为45÷5×25÷0.1×103×102=2.25×108(个/mL)。 1 2 3 4 5 6 7 8 √ 检测(二)　微生物技术综合强化练 一、选择题 1.平板划线法和稀释涂布平板法是纯化微生物常用的接种方法，二者的共同点是(　　) ①都需要使用接种工具进行接种　②都需要在酒精灯火焰旁进行接种，防止杂菌污染　③都能稀释分散菌种，达到分离、纯化目的菌的目的　④都可以用于计数 A.①②　　　　　　　 B.③④ C.①②③ D.①②③④ 解析：平板划线法用接种环接种，稀释涂布平板法要用涂布器接种，①正确;都需要进行无菌操作，所以都需要在酒精灯火焰旁进行接种，以防止杂菌污染，②正确;都能稀释分散菌种，在培养基表面形成单个菌落，以达到分离、纯化目的菌的目的，③正确;平板划线法不能用于计数，④错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 2.(2024·海盐高级中学)甲、乙、丙为三种微生物，下表中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖;甲能在Ⅰ中正常生长繁殖，而乙和丙都不能;乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，甲、丙都不能。下列说法正确的是 (　　) 项目 粉状硫 10 g K2HPO4 4 g FeSO4 0.5 g 蔗糖 10 g (NH4)2SO4 0.4 g H2O 100 mL MgSO4 9.25 g CaCl2 0.5 g Ⅰ + + + + - + + + Ⅱ + + + - + + + + Ⅲ + + + + + + + + 1 2 3 4 5 6 7 8 注：“+”表示培养基中加入了这种物质，“-”表示培养基中没有加入这种物质。 A.甲、乙、丙都是异养型微生物 B.甲、乙都是自养型微生物，丙是异养型微生物 C.甲是异养型微生物，乙是固氮微生物，丙是自养型微生物 D.甲是固氮微生物，乙是自养型微生物，丙是异养型微生物 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 解析：由题表数据可知，Ⅰ是无氮培养基，只有能固氮的微生物才能在其上正常生长繁殖;Ⅱ是不含碳源的培养基，只有自养型微生物才能在其上正常生长繁殖;Ⅲ培养基含有氮源和碳源，营养成分全面，适合多种微生物生长繁殖。再结合题干分析可知，甲是固氮微生物、乙是自养型微生物、丙是异养型微生物，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 3.(2024·台州选考模拟)尿酸氧化酶能分解尿酸(C5H4N4O3)，为获取尿酸氧化酶高产菌株用以研制治疗高尿酸血症的酶类药物，科研人员从海洋泥土中取样后富集培养，3天后吸取培养液梯度稀释到1×10-6，然后接种到固体培养基上分离培养。挑取单菌落检测尿酸氧化酶的酶活性(用每分钟转化1 μmol尿酸所需要的酶量表示)，结果如下表所示。下列分析错误的是 (　　) 菌株 1 2 3 4 酶活性 100 50 14 20 1 2 3 4 5 6 7 8 A.从海洋泥土中取的样品需在无菌条件下富集培养 B.需要在以尿酸作为唯一氮源和碳源的固体培养基上分离培养 C.菌株3的酶活性最高，可作为实验所需的目的菌 D.分离培养时采用了平板划线法进行接种 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 解析：为避免杂菌污染，应在无菌条件下富集培养样品，A正确;实验目的是获取尿酸氧化酶高产菌株，故需要在以尿酸作为唯一氮源和碳源的固体培养基上分离培养，B正确;由题干可知，酶活性用每分钟转化1 μmol尿酸所需要的酶量表示，故所需酶量越少，说明酶活性越大，由表可知，菌株3的酶活性最高，故其可作为实验所需的目的菌，C正确;分离培养时采用了稀释涂布平板法进行接种，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 4.(2024·宁波镇海中学月考)调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物。下列叙述正确的是 (　　) A.培养乳酸菌时应将液体悬浮振荡培养以保证氧气供应 B.光照条件下培养蓝细菌时只需提供水和无机盐而不需提供有机物 C.在以尿素为唯一氮源的培养基上长出菌落的微生物一定能分泌脲酶 D.硝化细菌和圆褐固氮菌都可在不添加任何氮源的培养基上生长 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 解析：乳酸菌为厌氧菌，应隔绝空气培养，A错误;蓝细菌可以进行光合作用，在光照条件下能将CO2转变为有机物，因此只需提供水和无机盐，不需提供有机物，B正确;在以尿素为唯一氮源的培养基上长出菌落的微生物也有可能是自生固氮菌，能利用空气中的氮气，不一定能分泌脲酶，C错误;硝化细菌能利用化学反应放出的能量将CO2转变为有机物，不能固氮，因此培养硝化细菌的培养基必须有氮源，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 5.研究发现圆褐固氮菌和巨大芽孢杆菌组合可以将某类厨余垃圾有效降解。为制备能有效分解该类厨余垃圾的微生物菌剂，科研小组对两菌种进行了最佳接种量比例的探究实验，实验结果如图。下列叙述正确的是 (　　) 1 2 3 4 5 6 7 8 A.该实验的接种方法为平板划线法 B.该类厨余垃圾可作为圆褐固氮菌扩大培养的培养基 C.处理该类厨余垃圾，两菌种的最佳接种量比为2∶1 D.圆褐固氮菌的某些代谢产物可能会促进巨大芽孢杆菌的增殖 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 解析：本实验是对两菌种最佳接种量比例的探究，由于要统计有效菌落数，而平板划线法无法对微生物计数，故接种方法为稀释涂布平板法，A错误;扩大培养指的是让目的微生物在特定培养基上进行大量繁殖，增多其数目，该类厨余垃圾不能作为圆褐固氮菌扩大培养的培养基，而是作为选择培养基，来筛选有效分解该类厨余垃圾的微生物，B错误;根据图示可知，两菌种的接种量比例为1∶1时，有效菌落数相对最大，故该实验中处理该类厨余垃圾废液，两菌种的最佳接种量比例为1∶1时，效果最佳，C错误;图中显示：两菌种混合接种时有效菌落数均大于单独接种，因此推测圆褐固氮菌的某些代谢产物可能会促进巨大芽孢杆菌的增殖，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 6.(2024·浙北G2联盟期末)筛选淀粉分解菌需使 用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细 菌能分解淀粉，培养平板经稀碘液处理，会出现以 菌落为中心的透明圈(如图)，实验结果见下表。有关本实验的叙述，错误的是 (　　) 菌种 菌落直径：C/mm 透明圈直径：H/mm H/C 细菌Ⅰ 5.1 11.2 2.2 细菌Ⅱ 8.1 13.0 1.6 1 2 3 4 5 6 7 8 A.培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质 B.筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布 C.以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外 D.H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 解析：筛选淀粉分解菌的培养基中，除淀粉提供碳源外，还需要氮源、水、无机盐等营养物质，A正确;筛选分离淀粉分解菌时需要将菌液进行一定程度的稀释才能涂布培养，B正确;据图分析可知，两个菌落均产生了透明圈，说明两种细菌均能将淀粉酶分泌至细胞外，C错误;据表分析可知，H/C值越大，分解淀粉能力越强，该值的大小反映了两种细菌分解淀粉能力的差异，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 7.(2024·平湖中学月考)下图所示为分离某种以尿素为氮源的细菌实验过程，下列叙述错误的是 (　　) 1 2 3 4 5 6 7 8 A.土样从有哺乳动物尿液的地方获取，获得目的菌种的概率很高 B.为验证尿素固体培养基具有选择作用，可用牛肉膏蛋白胨固体培养基进行对照 C.若从D试管取样后涂布平板菌落数平均值为56，则每克土样中含有此种菌5.6×107个 D.在尿素固体培养基上生长的细菌都是以尿素为氮源的细菌 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 解析：在含哺乳动物尿液的土壤中有较多能合成脲酶的细菌，因此土样从有哺乳动物尿液的地方获取，获得目的菌种的概率很高，A正确;取不同稀释倍数的土壤稀释液各0.1 mL，分别涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基、尿素固体培养基上，其中牛肉膏蛋白胨固体培养基是对照，用以说明尿素固体培养基是否有选择作用，B正确;D试管取样后涂布平板菌落数平均值为56，则1 g土壤样本中约有分解尿素的细菌56÷0.1×105=5.6×107个，C正确;在尿素固体培养基上生长的细菌大多数是以尿素为氮源的细菌，还有一些能利用空气中氮的微生物也能生长，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 二、非选择题 8.(2024·杭州S9联盟联考)为提高作物产量，种植业往往使用大量的氮素化肥，既增加了生产成本，又易造成环境污染。自生固氮菌营独立生活，为改变这种现状带来了希望。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如下图。回答下列问题： 1 2 3 4 5 6 7 8 (1)步骤①土样应取自表层土壤的原因是_____________________ _______________________________________________________________________。  步骤②需充分振荡的主要目的是____________________________ _________。  同其他环境相比，土壤中的微生物数量及种类较多，在富含有机质的土壤表层，有更多的固氮菌生长 使土壤中的微生物充分释放到 无菌水中 1 2 3 4 5 6 7 8 解析：步骤①土样应取自表层土壤的原因是同其他环境相比，土壤中的微生物数量及种类较多，在富含有机质的土壤表层，有更多的固氮菌生长;步骤②需充分振荡的主要目的是使土壤中的微生物充分释放到无菌水中。 1 2 3 4 5 6 7 8 (2)步骤③中需用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸3次的作用是　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　。步骤④用于分离菌落的方法是　　　　　　　　，所用的接种工具是　　　　。  解析：用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸3次的作用是使菌液与水混合均匀，以便计数更准确。由题图观察可知，步骤④平板中的菌落分布均匀，故所采用的分离菌落的方法是稀释涂布平板法，接种工具是涂布器。 使菌液与水混合均匀，以便计数更准确 稀释涂布平板法 涂布器 1 2 3 4 5 6 7 8 (3)下表为两种培养基的配方，步骤④应选其中的培养基　　　，原因是_____________________________________________________ _____________________________________________________________________。用平板培养细菌时一般需要将平板　　　　(填“倒置”或“正置”)。  甲 培养基甲不含氮源具有选择作用，自生固氮菌可以利用空气中的氮气作为氮源，而培养基乙中的蛋白胨可以提供氮源，不具有选择作用 倒置 培养基类型 培养基组分 培养基甲 甘露醇、K2HPO4、MgSO4·H2O、NaCl、K2SO4、蒸馏水、琼脂 培养基乙 蛋白胨、酵母提取物、NaCl、蒸馏水、琼脂 1 2 3 4 5 6 7 8 解析：由表格中培养基配方分析可知，步骤④应选其中的培养基甲，这是因为该培养基不含氮源具有选择作用，自生固氮菌可以利用空气中的氮气作为氮源，而培养基乙中的蛋白胨可以提供氮源，不具有选择作用。用平板培养细菌时一般需要将平板倒置，倒置培养既可以防止培养基表面的水分过快地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 1 2 3 4 5 6 7 8 (4)纯化培养时，需同时进行未接种培养基的培养，目的是____________________________________。 若在④的平板上统计出菌落的平均数量为130个，则每克土壤中含有的固氮菌为　　　　　个。另一组实验中发现，当培养时间过长时，在固氮菌大菌落四周出现了少量杂菌小菌落，进一步研究表明这些杂菌不能利用空气中的氮气，则其氮源来自________________________。  检测培养过程中培养基是否被杂菌污染 1.3×107 固氮菌产生的含氮化合物 1 2 3 4 5 6 7 8 解析：进行纯化培养时，需同时进行未接种培养基的培养，作为对照，目的是检测培养过程中培养基是否被杂菌污染。若在④的平板上统计的菌落的平均值为130个，则每克土壤中含有固氮菌为130÷0.1×104=1.3×107个。杂菌不能利用空气中的氮气，但可利用自生固氮菌产生的含氮化合物(或自生固氮菌向培养基上分泌的含氮化合物)。 1 2 3 4 5 6 7 8 (5)将纯化的固氮菌置于完全培养液中扩大培养48 h，经离心后收集下层细胞并转移至特定培养基中进行固氮能力的测定，筛选出固氮能力最强的菌种CM12，为进一步鉴定其固氮能力，科研人员选用发芽一致的玉米种子进行3组盆栽实验，30 d后测定土壤微生物有机氮含量，结果如下图： 1 2 3 4 5 6 7 8 N：尿素处理组[每盆土壤浇灌50 mL有氮全营养液(在1 000 mL无氮植物营养液中加入0.12 g尿素)];CM12：自生固氮菌CM12处理组(每盆土壤浇灌50 mL接种自生固氮菌的无氮植物营养液)。 ①对照组(CK)的处理为_________________________________。  每盆土壤浇灌50 mL无氮植物营养液 1 2 3 4 5 6 7 8 ②实验结果表明，用尿素处理和接种自生固氮菌CM12处理均能显著增加土壤微生物有机氮含量。与尿素处理组相比，自生固氮菌CM12处理组土壤微生物有机氮含量增加了约　　　　%。  ③自生固氮菌较共生固氮菌(如根瘤菌)的应用范围更广，原因是　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。  ④研究表明，土壤中碳氮比低于40∶1时，固氮菌的固氮作用迅速停止。因此优良菌肥最好与　　　　(填“有机肥”“氮肥”“磷肥”或“钾肥”)配合施用。  83.3 自生固氮菌能在土壤中独立固氮，不受宿主的限制 有机肥 1 2 3 4 5 6 7 8 解析：①设置对照组时需要排除无关变量对实验的影响，故对照组(CK)的处理为每盆土壤浇灌50 mL无氮植物营养液。②由柱形图分析可知，空白对照组中土壤微生物有机氮含量为10，尿素处理组的土壤微生物有机氮含量为12，而自生固氮菌CM12处理组土壤微生物有机氮含量为22，故与尿素处理组相比，自生固氮菌CM12处理组土壤微生物有机氮含量增加了(22-12)÷12×100%≈83.3%。 1 2 3 4 5 6 7 8 ③自生固氮菌较共生固氮菌(如根瘤菌)的应用范围更广，这是因为自生固氮菌能在土壤中独立固氮，不受宿主的限制。④土壤中碳氮比低于40∶1时，固氮菌的固氮作用迅速停止，而有机肥中含有碳，经微生物分解可提供碳源，故优良菌肥最好与有机肥配合施用。 1 2 3 4 5 6 7 8 $$