第3章 第一节 第2课时 利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定（课件PPT）-【新课程学案】2024-2025学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程（苏教版2019）

第2课时　利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定 学习目标 1.简述PCR的原理、条件及过程。 2.尝试进行PCR的基本操作并电泳鉴定PCR的产物。 课时跟踪检测 CONTENTS 目录 1 2 3 知识点(一)　聚合酶链式反应(PCR)技术 知识点(二)　利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定 课堂小结与随堂训练 4 NO.1 知识点(一)　聚合酶链式反应(PCR)技术 (一)PCR的含义及反应条件 教材知识梳理 含义 PCR是________________的缩写,是______________________的体外扩增技术 原理 DNA半保留复制 条件 模板DNA、_______、4种________ (能量和原料)、缓冲液和热稳定的___________________、Mg2+等 聚合酶链式反应 目的DNA片段(目的基因) 引物对 dNTP DNA聚合酶(Taq酶) (二)PCR的反应步骤和结果 1.PCR反应的一般步骤 2.PCR的结果:理论上,每经过一个循环,样本中DNA片段的数量增加一倍,经过n个循环后,DNA片段数量可以扩增至原先的2n倍。 (三)PCR技术的应用 1.广泛应用于医学及分子生物学等领域,如:病原体鉴定、___________、免疫学研究、癌基因探索及某些疾病治疗等。 2.在古生物学、法医学等方面也有广泛的应用。 遗传病诊断 (一)图示法理解PCR反应过程 核心要点点拨 (二)PCR技术与生物体内DNA复制的比较 比较项目 PCR 细胞核内DNA复制 区别 场所 试管中 细胞内 方式 半保留全连续局部区域复制 半保留半不连续全链复制 起始位点 引物3'端 复制起始位点 酶 仅一种DNA聚合酶(Taq酶) 多种酶(DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等)  区别 反应条件 温度变幅大 温和 解旋 高温解旋 解旋酶解旋 引物 DNA片段,保留在复制的子链中 RNA片段,不保留在复制的子链中 产物 引物界定的片段 核基因组 循环次数 人为设置 与细胞分裂同步 续表 联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成; ②原料:均为四种脱氧核苷酸; ③酶:均需要DNA聚合酶进行催化; ④引物:均需要引物,使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 续表 　(三)与引物相关的问题分析 1.PCR技术需要引物的原因 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从3'端延伸DNA链,因此,DNA的复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶就能从引物的3'端开始延伸DNA链,因此DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸。 2.PCR扩增中需要引物数目的计算规律 若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环,理论上需要消耗引物数为2n+1-2个,第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。 3.关于引物设计应注意的问题 依据目的基因两端的部分核苷酸序列设计。两种引物之间以及每种引物内部不能发生碱基互补配对。有时候引物5'端需要含有某种限制酶的识别序列。 [典例]　聚合酶链式反应(PCR)被广泛用于遗传疾病的诊断、刑事侦查、古生物学和基因工程等领域。利用PCR技术可快速扩增目的基因。下列有关叙述错误的是 (　　) A.扩增目的基因的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 B.PCR技术需要使用Taq酶的原因是其耐高温 C.PCR技术扩增时,两种引物的碱基序列要尽可能互补 D.若目的基因扩增5次,则需要消耗62个引物分子 √ [解析]　PCR技术扩增目的基因的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,其目的是根据这一序列合成引物,A正确;PCR技术需要使用Taq酶而不是普通的DNA聚合酶,主要原因是Taq酶耐高温,B正确; PCR技术中所用的两种引物的碱基序列不能互补,原因是若能互补则会发生配对,从而减弱引物与目的基因的结合概率,C错误;若一个目的基因扩增5次,可得到32个DNA分子,共64条DNA单链,其中原目的基因两条单链不需要引物,所以共需消耗62个引物分子,D正确。 [归纳拓展]　PCR中的数量关系 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物的DNA分子数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1 同时含两种引物的DNA分子数 0=21-2 2=22-2 6=23-2 2n-2 共消耗引物的对数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0=21-2 0=22-4 2=23-6 2n-2n (一)澄清概念 1.判断下列叙述的正误 (1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。( ) (2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。 ( ) (3)PCR技术中,DNA模板链上碱基G和C的比例越高,DNA变性解链的温度就越高。 ( ) 层级训练评价 × √ √ (二)落实知能 2.PCR技术需要的酶是(　　) A.解旋酶 B.热稳定的DNA聚合酶 C.RNA聚合酶 D.限制酶 解析:PCR技术利用高温使双链DNA解旋,不需要解旋酶;PCR仪是一个温控设备,需要热稳定的DNA聚合酶;RNA聚合酶参与转录,PCR是进行体外DNA复制;限制酶是对DNA进行切割,PCR技术不需要限制酶。 √ 3.(2024·连云港质检)下列有关细胞内DNA的复制与PCR的叙述,错误的是 (　　) A.都需要以亲代DNA的两条链分别作为模板 B.都需要DNA聚合酶和解旋酶进行催化 C.都需要四种脱氧核苷酸作为原料 D.都遵循相同的碱基互补配对方式 √ 解析:PCR是一项根据细胞内DNA半保留复制的原理,在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。细胞内DNA的复制与PCR都需要以亲代DNA的两条链分别作为模板,A正确;细胞内DNA的复制需要DNA聚合酶和解旋酶,PCR需要热稳定的DNA聚合酶,但不需要解旋酶,B错误;DNA的基本单位是脱氧核苷酸,细胞内DNA的复制与PCR都是为了合成DNA,故都需要四种脱氧核苷酸作为原料,C正确;DNA结构遵循碱基互补配对原则,故细胞内DNA的复制与PCR都遵循相同的碱基互补配对方式,D正确。 (三)迁移应用 4.(2024·连云港质检)导致流感的病原体是一种单链RNA病毒。PCR是一项在生物体外能快速扩增DNA片段的技术。如图为流感病毒核酸检测的部分过程,图中引物是能与模板DNA碱基互补配对的单链DNA片段,是子链合成延伸的基础,DNA复制后将成为新合成子链的一部分。 (1)据图分析,核酸检测时首先以　　　 　　　 　为模板,以___________为原料合成杂交双链,将杂交双链用核酸酶H处理的目的是　　　　 　　　　 。  解析:据图分析,核酸检测时首先以病毒RNA(或RNA单链)为模板,以脱氧核苷酸为原料合成杂交双链,将杂交双链用核酸酶H处理的目的是将杂交双链中的RNA单链水解,得到DNA单链。 病毒RNA(或RNA单链)　 脱氧核苷酸　 将杂交双链中的RNA单链水解,得到DNA单链 (2)图中变性过程是将DNA双链间的　 　破坏,方法是用约94 ℃高温,该过程相当于体内DNA复制中的　 　。退火过程需要降低反应体系的温度,目的是使引物与DNA模板链结合,该温度的高低与引物分子中含有的(A+T)/(G+C)有关,原因是__________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________。 氢键　 解旋　 引物与DNA模板链之间通过 形成氢键结合,碱基对A—T之间可形成2个氢键,碱基对G—C之间可形成3个氢键,所以(A+T)/(G+C)越高,退火需要的温度越低 解析:图中变性过程是将DNA双链间的氢键破坏,使双链分开,方法是用约94 ℃高温,该过程相当于体内DNA复制中的解旋。退火过程需要降低反应体系的温度,目的是使引物与DNA模板链结合,该温度的高低与引物分子中含有的(A+T)/(G+C)有关,是因为引物与DNA模板链之间通过形成氢键结合,碱基对A—T之间可形成2个氢键,碱基对G—C之间可形成3个氢键,所以(A+T)/(G+C)越高,退火需要的温度越低。 (3)利用1个双链DNA分子完成35轮循环共需要　　　个引物分子。  解析:利用1个双链DNA分子完成35轮循环共合成235个DNA分子,有236条单链,最初的两条链不需要引物,故需要236-2个引物分子。 236-2 NO.2 知识点(二)　利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定 教材知识梳理 (一)实验目的 1.尝试运用PCR仪扩增DNA片段。 2.关注PCR技术的应用。 3.学习_______________检测DNA片段的方法和技术。 (二)实验原理 1.扩增DNA片段的过程包括_____、_____和_____等步骤的多次循环。 琼脂糖凝胶电泳 变性 退火 延伸 2.理论上,每经过一个循环,样本中DNA片段的数量增加______,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过n个循环后,DNA片段数量可扩增至原来的____倍。 3.PCR反应体系包括:DNA模板、_____________、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、人工合成的_____________、Taq酶等。 4.在不同阶段,还需要控制PCR仪反应系统的_______温度。 一倍 反应缓冲液 DNA引物对 不同 2n (三)实验步骤 1.PCR扩增目的基因 (1)配制反应体系。 (2)按程序进行扩增。 2.电泳分析 电泳 进行此实验需要配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶液(1×TAE)、50 μL PCR扩增产物和6 μL凝胶加样缓冲液等试剂,操作时维持恒压_______ 1.5~2 h 电泳鉴定 采用凝胶成像仪或____________观察和记录电泳结果 80 V 紫外透射仪 (四)实验注意事项 1.微量取液器不能超量程使用。使用一次性屏蔽式吸液枪头有助于防止吸取的液体流入微量取液器,从而减少实验过程中的交叉污染。 2.为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的PCR管、枪头和双蒸水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 3.为保证加入反应体系中的各试剂体积的准确性,要按照加入体积的大小,由大到小依次加入各试剂,即最先加入双蒸水。为保护酶的活性,一般最后加入Taq酶。 4.在向PCR管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,取液器上的枪头都必须更换。 核心要点点拨 (一)图示法理解PCR扩增及电泳分析的实验步骤 1.PCR扩增目的基因AKP 2.电泳分析 (二)PCR扩增中扩增条带异常的原因分析 未出现 扩增条带 ①Taq酶失活;②引物出现质量问题;③Mg2+浓度过低;④变性时的温度低,变性时间短 出现非特异 性扩增条带 ①模板DNA出现污染;②引物特异性不强或形成引物二聚体;③Mg2+浓度过高;④退火时的温度过低等 [典例]　(2024·启东高二阶段测)PCR产物常用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,下列与PCR和琼脂糖凝胶电泳有关叙述错误的是 (　　) A.利用PCR扩增目的基因时,需要已有的目的基因作模板 B.需将扩增得到的PCR产物与内含指示剂的电泳缓冲液混合后加样 C.PCR使用的缓冲液和酶应分装后冷冻保存,使用前取出并缓慢融化 D.琼脂糖溶液中加入的核酸染料利于DNA在紫外灯下被检测 √ [解析]　利用PCR扩增目的基因时,需要已有的目的基因作模板,A正确;加样时需将扩增得到的PCR产物与内含指示剂的凝胶加样缓冲液混合,B错误;PCR所用缓冲液和酶应分装成小份后冷冻保存,使用前应放在冰块上缓慢融化,这样才能不破坏缓冲液中稳定性较差的成分,同样保护酶的活性不被破坏,C正确;DNA分子的大小和构象等有关,凝胶中的DNA分子通过染色,可以在紫外灯下被检测出来,D正确。 层级训练评价 (一)澄清概念 1.判断下列叙述的正误 (1)PCR的引物为DNA片段并保留在子链中,细胞核内DNA复制所需引物为RNA片段,并且不保留在子链中。 ( ) (2)DNA分子的大小影响其在凝胶中的迁移速率。 ( ) √ √ (3)PCR循环之前,常要进行一次预变性,预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率。 ( ) (4)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列。 ( ) √ × (二)落实知能 2.PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,下列有关PCR过程的叙述,正确的是(　　) A.待扩增的DNA两条链的解旋过程需要酶的催化 B.所用引物的长度越短,与模板链结合的特异性越强 C.在子链的形成过程中,dNTP可以提供原料和能量 D.与细胞内DNA复制相比,PCR所需要的酶对高温比较敏感 √ 解析:PCR扩增DNA时,DNA解旋过程是通过高温来实现的,A错误;引物越长,与模板链结合的特异性越强,B错误;dNTP包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP,在子链的形成过程中,可以提供原料和能量,C正确;PCR所需要的酶为热稳定的DNA聚合酶,其最适温度较高,D错误。 3.关于PCR扩增DNA片段和电泳检测扩增产物实验的描述中,不正确的是 (　　) A.PCR过程需要Taq酶 B.PCR过程需要DNA连接酶 C.PCR扩增区域由2种引物来决定 D.不同大小的DNA在电场中迁移速率不同 √ 解析:PCR反应需要高温使DNA变性解旋,所以复制过程中要用热稳定的DNA聚合酶(Taq酶),A正确;PCR过程中用热稳定的DNA聚合酶来催化脱氧核苷酸的聚合,不需要DNA连接酶,B错误;PCR过程中DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从引物的3'端延伸DNA链,因此PCR扩增区域由2种引物来决定,C正确;不同大小的DNA在电场中的迁移速率不同,因此可通过电泳的方法检测扩增产物,D正确。 (三)迁移应用 4.[多选](2024·连云港高二期中)免疫PCR是对微量抗原的一种检测方法。下图是利用该技术检测牛乳中微量抗生素的流程图:首先将抗体1固定在微板上,冲洗后加入待检的牛乳,再加入DNA标记的抗体2,进行PCR扩增,最后进行电泳检测,相关叙述错误的是(　　) A.抗体1和抗体2是由同一种浆细胞分泌的两种不同抗体 B.如果第三次冲洗不充分则有可能出现假阳性现象 C.图示中的DNA是牛乳基因中的DNA片段 D.PCR扩增产物的量与牛乳中抗生素的量呈负相关 解析:每一种浆细胞只分泌一种抗体,则抗体1和抗体2是由不同种浆细胞分泌的两种不同抗体,A错误;免疫PCR利用的是PCR技术扩增“固定抗体1—抗生素—抗体2”上连接的DNA,如果第三次冲洗不充分,可能使残留的、呈游离状态的抗体2上的DNA也作为PCR的模板参与扩增,会出现假阳性现象,B正确; √ √ √ 待检测的牛乳中可能含有牛乳腺细胞的DNA(其上含有牛乳基因的DNA片段),若图示中的DNA用牛乳基因中的DNA片段,经过PCR扩增后的产物中,不仅有抗体2上的DNA扩增产物,还可能有牛乳中本身含有的牛乳基因片段的扩增产物,使检测结果偏大,C错误;免疫PCR是通过PCR技术扩增抗体2上连接的DNA,最后通过检测扩增产物——DNA的量来确定抗生素的量的方法。因此,PCR扩增产物的量与牛乳中抗生素的量呈正相关,D错误。 5.流感病毒是RNA病毒。检测流感病毒特异序列的方法常见的是荧光定量PCR。由于PCR反应模板仅为DNA,因此在进行PCR反应前,首先合成cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。在PCR反应体系中,包含一对特异性引物以及一个Taqman探针,该探针为一种寡核苷酸链,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 (1)检测流感病毒的过程中,反应体系中应加入的酶是___________ __________________________。  逆转录酶和 热稳定的DNA聚合酶(Taq酶) 解析:由于PCR反应模板仅为DNA,因此在进行PCR反应前,先将流感病毒核酸RNA逆转录为cDNA,再以cDNA为模板,PCR扩增合成目的片段。所以检测流感病毒的过程中,反应体系中应加入的酶是逆转录酶和热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)。 (2)在检测过程中要用到两种引物,引物的作用是_______________ _____________________________。进行引物设计时需要注意的问题是_______________________________________________________ (答出2点即可)。 解析:在检测过程中要用到两种引物,引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸;进行引物设计时需要注意的问题是引物长度要适宜、引物自身或两种引物之间不能存在互补序列。 使DNA聚合酶从 引物长度要适宜、引物自身或两种引物之间不能存在互补序列 引物的3'端开始连接脱氧核苷酸　 (3)核酸检测过程中需要大量探针,若仅扩增探针这段单链,需要利用不对称PCR,即采用不等量的一对引物,经若干次循环后,低浓度的引物被耗尽,以后的循环只产生高浓度引物的延伸产物,结果产生大量的单链DNA。这两种引物分别为限制性引物与非限制性引物,其最佳比例一般为1∶50~1∶100。据此分析,下图中的引物　 应该为非限制性引物。假设反应体系中原来有1个模板DNA分子,最初20个循环扩增产生双链DNA,后15个循环均只扩增一条链,则需要限制性引物_______个,需要非限制性引物　　　个。  1　 220-1　 224-1 解析:由题意分析可知,图中的引物1应该为非限制性引物;假设反应体系中原来有1个模板DNA分子,最初20个循环扩增产生双链DNA,产生的DNA分子数为220个,最初的两条模板链不需引物,所以需要限制性引物220-1(个);前20个循环需要非限制性引物的个数和限制性引物一样,也为220-1个,后15个循环,需要利用前20个循环扩增得到的DNA为模板,需要非限制性引物个数为220×15,所以一共需要非限制性引物个数为220-1+220×15=220×16-1=224-1(个)。 课堂小结与随堂训练 NO.3 一、知识体系构建 二、关键语句必背 1.聚合酶链式反应(PCR)技术所需条件:模板DNA、引物对、四种dNTP、缓冲液和热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)、Mg2+等。 2.PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。由于PCR过程在高温下进行,因此需要使用热稳定的DNA聚合酶。目的是通过指数式扩增获取大量的目的基因;前提是要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列,以便合成引物。 3.DNA迁移速率取决于琼脂糖凝胶的浓度、迁移分子的形状及大小等。 三、素养好题训练 1.实时荧光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测,其原理是在PCR退火过程中探针和引物一起与模板结合,探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团,新链延伸过程中,DNA聚合酶会破坏探针,导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT-PCR进行核酸检测的相关过程如下图所示。下列有关叙述错误的是 (　　) A.该技术需要用到解旋酶和Taq酶 B.该技术的原理是DNA半保留复制 C.该技术过程中需加入一对碱基序列不互补的引物 D.若检测结果有荧光发出,说明被检测者可能感染了病毒 √ 解析:逆转录合成cDNA的过程中,反应体系中需要加入逆转录酶,在PCR技术中需要用到Taq酶,不需要解旋酶,A错误;该技术运用了DNA半保留复制的原理,B正确;该技术需要一对特异性的引物,要求一对引物的碱基序列不能互相配对,否则引物之间会相互结合,C正确;若检测结果有荧光发出,说明被检测者可能感染了病毒,D正确。 2.(2024·南京雨花区月考)用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时,得到以下电泳图谱,其中1号为DNA标准样液(Marker),10号为蒸馏水,PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析,不合理的是 (　　) A.PCR产物的分子大小在250~500 bp之间 B.3号样品为不含目的基因的载体DNA C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号确定反应体系等对结果没有干扰 √ 解析:PCR过程中,可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段,4~9号是转基因植株,理论上应包含目的基因,结合2号野生型和 10号蒸馏水组的结果推测包含目的基因的片段大小应为250~500 bp,A正确;3号PCR结果包含250~500 bp片段,应包含目的基因,B错误;9号PCR结果不包含250~500 bp片段,所以不是所需转基因植株,C正确;10号放入蒸馏水,可排除反应体系等对结果的干扰,D正确。 3.[多选](2024·湖南高考)最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中,分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子链延伸时,双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则。以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP,延伸终止;若配对的为原脱氧核苷三磷酸(dATP),继续延伸;PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列,结果如图所示。下列叙述正确的是 (　　) A.上述PCR反应体系中只加入一种引物 B.电泳时产物的片段越小,迁移速率越慢 C.5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列 D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 解析:利用双脱氧测序法时,PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA,故只需加入一种引物,A正确。电泳时,产物的片段越大,迁移速率越慢,B错误。 √ √ 依据题干信息中双脱氧测序法的原理,可以确定每个泳道中条带(DNA片段)的3'终端的碱基,如+ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同,但终止点不同,可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基;图示电泳方向为从上→下,即对应的DNA片段为长→短,则对应的DNA测序结果为3'→5',如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带,则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C。因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3',患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3',C正确。对比患者和对照个体的测序结果可知,患者该段序列中某位点的碱基C突变为T,D错误。 4.PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌,医生进行了相关操作:①分析PCR扩增结果;②从病人组织样本中提取DNA;③利用PCR扩增DNA片段;④采集病人组织样本。回答下列问题: (1)若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是___________ (用序号表示)。  解析:利用PCR技术检测病原菌的步骤:采集病人组织样本→从病人组织样本中提取DNA→利用PCR扩增DNA片段→分析PCR扩增结果,即④②③①。 ④②③① (2)操作③中使用的酶是　　　　 　　　。PCR中的每次循环可分为变性、退火、　　　三步,其中退火的结果是___________ 　 　。  解析:利用PCR扩增DNA片段需要热稳定的DNA聚合酶;PCR反应中的每次循环可分为变性、退火、延伸三步,其中退火的结果是引物通过碱基互补配对与单链DNA结合。 热稳定的DNA聚合酶　 延伸　 引物通过碱 基互补配对与单链DNA结合 (3)为了做出正确的诊断,PCR所用的引物应该能与_____________特异性结合。  解析:在DNA复制中引物所起的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,为了做出正确的诊断,PCR反应所用的引物必须与病原菌DNA碱基互补配对。 病原菌DNA (4)PCR是　　　　 　　的缩写。它是一项根据_______________的原理,在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术。PCR的产物常用　　　　　　　　来鉴定。  解析:PCR全称为聚合酶链式反应,是在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术;PCR依据的原理是DNA半保留复制,其产物DNA常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 聚合酶链式反应　 DNA半保留复制　 琼脂糖凝胶电泳 课时跟踪检测 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 A级——基础综合练 1.在PCR中不会用到的是(　　) A.解旋酶 B.DNA聚合酶 C.脱氧核苷酸 D.引物 解析:在PCR中不会用到的是解旋酶,PCR利用高温使作为模板的双链DNA解旋,A符合题意。 √ 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 2.PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。下列有关PCR技术的叙述,正确的是 (　　) A.打开DNA双链需依赖于解旋酶 B.子链延伸的方向是3'端向5'端 C.所用的引物一定是单链DNA分子 D.PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行 √ 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 解析:在利用PCR技术扩增DNA片段的过程中,在约94 ℃高温下,作为模板的双链DNA解旋为两条单链DNA,A错误;DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸,B错误;引物可以是单链DNA分子,也可以是单链RNA分子,C错误;PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行,缓冲溶液的作用是给Taq酶提供一个最适的酶促反应条件,D正确。 3.(2024·泰州高二月考)关于DNA片段的扩增及电泳鉴定实验,下列相关叙述正确的是 (　　) A.PCR仪实质上就是一台能自动调控温度的仪器,但在使用时需根据扩增的DNA片段以及引物的情况人工设定合适的温度 B.PCR反应体系中需加入热稳定的DNA聚合酶,该酶主要在退火过程中起作用 C.为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理 D.电泳完成后,可直接观察凝胶中的DNA分子 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 √ 解析:PCR反应体系中需加入热稳定的DNA聚合酶,该酶主要在延伸过程中起作用,B错误;为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理,移液器不需要高压灭菌,C错误;电泳完成后,凝胶中的DNA分子可通过凝胶成像仪或紫外透射仪观察,D错误。 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 4.在核酸分子杂交技术中,常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)。为了获得B链作探针,可应用PCR技术进行扩增,应选择的引物种类是 (　　) A.引物1与引物2 B.引物3与引物4 C.引物2与引物3 D.引物1与引物4 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 √ 解析:要获得B链,根据PCR中子链延伸方向为5'到3',则需选择引物2与引物3进行扩增,故选C。 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 5.(2024·无锡高二阶段测)利用PCR技术分析粪便已成为珍稀野生动物种群调查的有效手段。同种生物不同个体在同源染色体某些位置上DNA片段长度存在差异,这些片段可作为辨别不同个体的依据。下列叙述错误的是 (　　) A.需去除粪便中微生物的DNA以免干扰实验结果 B.设计PCR引物时需要考虑物种特异性 C.反应体系中需加入四种脱氧核苷三磷酸作为原料 D.PCR获得的不同长度片段可通过电泳检测 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 √ 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 解析:由于不同的生物DNA具有特异性,故利用PCR技术辨别不同个体时不需要去除粪便中微生物的DNA,A错误;引物是一段能与目的基因结合的核苷酸序列,设计PCR引物时需要考虑物种特异性,B正确;PCR是对目的基因进行扩增的技术,反应体系中需加入四种脱氧核苷三磷酸作为原料,C正确;PCR获得的不同长度片段可通过电泳检测,D正确。 6.如图是PCR扩增过程的示意图,其中叙述错误的是 (　　) A.①②过程均不需要酶的参与 B.常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物 C.在用PCR技术扩增DNA时,DNA的复制过程与细胞内的类似 D.该过程需要设计两种特异性的引物,要求这两种引物的序列互补 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 √ 解析:①表示变性过程,双链DNA解旋在高温条件下进行,不需要酶的催化,②是退火过程,2条引物分别与单链DNA结合,也不需要酶的催化,A正确;不同的DNA片段在电泳时移动的速率不同,可以将PCR产物的电泳结果与标准DNA样品的电泳结果进行比对,从而鉴定PCR的产物,常采用琼脂糖凝胶电泳,B正确;PCR技术扩增DNA的原理是DNA半保留复制,在该过程中DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似,C正确;该过程需要一对特异性的引物,要求一对引物的序列是不互补的,否则会形成引物二聚体,进而影响目的基因的扩增,D错误。 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 7.[多选]在PCR反应缓冲体系中,进行目的基因扩增时的常规程序包括:①PCR仪中94 ℃左右预加热约5 min,再加热约1 min;②将温度降到55 ℃左右,保持1 min;③在温度为72 ℃左右保持2 min完成一个循环;④所有循环完成后72 ℃下保持7~10 min,4 ℃保存。下列相关分析错误的是 (　　) A.在缓冲液中加入模板、酶和4种脱氧核苷三磷酸即可反应 B.程序①使模板DNA的氢键和磷酸二酯键裂解后变性 C.完成程序①②和③后,DNA分子数是前一轮循环的两倍 D.程序④有利于热稳定的DNA聚合酶使产物延伸完整、保持DNA结构的稳定 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 √ √ 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 解析:在缓冲液中需要加入模板、酶和4种脱氧核苷三磷酸、引物等物质,A错误;程序①变性使模板DNA的氢键裂解后变性,B错误;DNA是半保留复制,故完成程序①②和③后,DNA分子数是前一轮循环的两倍,C正确;程序④有利于热稳定的DNA聚合酶使产物延伸完整、保持DNA结构的稳定,D正确。 8.PCR是聚合酶链式反应的缩写,是一项在体外提供参与DNA复制的组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。下图为PCR获取并扩增目的基因的示意图,引物的3'端有结合模板DNA的关键碱基,5'端碱基无严格限制。据图回答下列问题: 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 8.PCR是聚合酶链式反应的缩写,是一项在体外提供参与DNA复制的组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。下图为PCR获取并扩增目的基因的示意图,引物的3'端有结合模板DNA的关键碱基,5'端碱基无严格限制。据图回答下列问题: 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 (1)PCR的原理是　　　 ,PCR过程中所用的酶是______________________________。  解析:PCR的原理是DNA半保留复制,PCR过程中所用的酶是热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)。 DNA半保留复制　 热稳定的DNA聚合酶(Taq酶) 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 (2)PCR的每次循环一般包括　　　 　　　三步,在PCR过程中,新合成的DNA子链的延伸方向是　　　　　　,PCR获取目的基因时;在第　　次循环后反应体系中可出现目的基因。  解析:PCR的每次循环一般包括变性、退火、延伸三步,在PCR过程中,新合成的DNA子链的延伸方向是5'端→3'端;利用图示片段通过PCR获取目的基因时,在第3次循环后反应体系中可出现目的基因。 变性、退火、延伸 　5'端→3'端　 3　 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 (3)PCR获取目的基因时,引物的作用是_______________________ ___________________________________________________________。  为了方便目的基因与质粒的连接,可在引物的　　　端添加限制酶识别序列。若引物上的限制酶识别序列为 在用一种酶连接目的基因与质粒时,所用的酶为　　　 。  界定目的基因,为DNA聚合 酶提供结合位点并使DNA聚合酶能够从引物的3'端连接脱氧核苷酸　 5'　 T4 DNA连接酶 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 解析:PCR获取目的基因时,引物的作用是界定目的基因,为DNA聚合酶提供结合位点并使DNA聚合酶能够从引物的3'端连接脱氧核苷酸。为了方便目的基因与质粒的连接,可在引物的5'端添加限制酶识别序列,使目的基因和载体能够产生相同的黏性末端。若引物上的限制酶识别序列为 则被限制酶切割后形成平末端,在用一种酶连接目的基因与质粒时,所用的酶为T4 DNA连接酶。 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 (4)科学设计引物是PCR能否成功的关键。若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高,会造成PCR的效率偏低,收获的目的基因较少,原因是________________________________________________________ _______。  若对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果发现有两个或多个条带,从引物角度分析,原因可能是　　　　 　　　　　　　　　　。  引物与模板链结合过于紧密,变性时引物不易与模板链脱离(影响 引物过短导致引物的特异性下降 变性)　 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 解析:科学设计引物是PCR能否成功的关键。若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高,会造成PCR的效率偏低,收获的目的基因较少,原因是C、G之间含有3个氢键,引物与模板链结合过于紧密,变性时引物不易与模板链脱离(影响变性)。若对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果发现有两个或多个条带,从引物角度分析,原因可能是引物过短导致引物的特异性下降,错误配对导致扩增片段出错。 B级——应用创新练 9.[多选](2024·常州高二阶段练)亚洲棉的突变型光籽和野生型毛籽是一对相对性状,研究发现,亚洲棉某突变体的光籽表型与8号染色体的880 kb至903 kb区间相关,研究人员根据野生型毛籽棉的该区间设计连续的重叠引物进行PCR,产物扩增结果如图所示,下列说法正确的是 (　　) 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 A.应提取该突变体和野生型亚洲棉的全部染色体DNA进行PCR B.上图中PCR产物的鉴定是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的 C.据图分析可知,分子量较大的扩增产物与点样处的距离较小 D.该突变体出现的根本原因是第6对引物对应区间发生了基因突变 √ √ √ 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 解析:由于亚洲棉某突变体的光籽表型与8号染色体的880 kb至903 kb区间相关,故应该提取该突变体和野生型亚洲棉的8号染色体上的DNA进行扩增,A错误;题图中PCR产物的鉴定是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的,主要依据分子量不同,分子量较大的扩增产物迁移速率慢,与点样处的距离较小,B、C正确;根据野生型和该突变体经引物6扩增的产物不同可知,8号染色体上的第6对引物对应的区间基因突变是该突变体光籽性状出现的根本原因,D正确。 10.[多选](2024·常州模拟)下图1表示限制酶SpeⅠ、XbaⅠ的识别序列和切割位点,图2表示基因P(960 bp)、基因Q(840 bp) 的限制酶SpeⅠ或XbaⅠ的酶切图谱和融合基因,图3表示几种基因经限制酶SpeⅠ或XbaⅠ处理后进行电泳(电泳条带表示特定长度的DNA片段)得到的带谱图,下列相关分析正确的是 (　　) 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 A.基因P经限制酶SpeⅠ处理后进行电泳的结果与图3中的Ⅰ相符合 B.基因Q经限制酶XbaⅠ处理后进行电泳的结果与图3中的Ⅱ相符合 C.融合基因经限制酶SpeⅠ处理后进行电泳的结果与图3中的Ⅲ相符合 D.融合基因经限制酶XbaⅠ处理后进行电泳的结果与图3中的Ⅳ相符合 √ √ √ 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 解析:根据图2所示,基因P上有限制酶SpeⅠ的一个酶切位点,基因P的总长度960 bp,所以经酶切后可以得到两个小于960的片段,图3中的Ⅰ符合酶切后的基因P,同理,图3中的Ⅱ符合酶切后的基因Q,A、B正确;由图1可知,融合基因中没有限制酶SpeⅠ和限制酶XbaⅠ的酶切位点,所以用这两种酶处理融合基因,融合基因不会断开,因此处理之后只有一个片段,与图3中的Ⅳ相符合,C错误,D正确。 11.如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例): 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 请据图回答问题: (1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种　　　 　　　　　酶,它通过识别特定的　　　　　　　　　切割特定位点。 解析:根据题图可知,步骤Ⅰ是获取目的DNA片段,所用的酶EcoRⅠ是一种限制酶,其能识别特定的(脱氧)核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的两个(脱氧)核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 限制性内切核酸(或限制)　 (脱氧)核苷酸序列  1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 (2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成　　　　　　;PCR循环中,升温到95 ℃是为了获得__________; Taq酶的作用是催化　　　　 　　 　　。  解析:步骤Ⅱ是将目的DNA片段连接成环状,其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3'-羟基和5'-磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中,升高温度到95 ℃是为了打开氢键使双链解旋,获得DNA单链,Taq 酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物3'端,合成DNA子链。 磷酸二酯键　 DNA单链　 以DNA为模板的DNA链的延伸 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 (3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是　　　(从引物①②③④中选择,填编号)。    DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知序列 PCR引物 ②④ 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 解析:引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始延伸DNA子链,因为DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸,故为扩增未知序列,选择的与模板链相结合的引物应为5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'(引物④)和5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'(引物②)。 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 (4)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列),结果正确的是　　。  A.5'-AACTATGCG……AGCCCTT-3' B.5'-AATTCCATG……CTGAATT-3' C.5'-GCAATGCGT……TCGGGAA-3' D.5'-TTGATACGC……CGAGTAC-3' B 1 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 解析:分析题意可知,片段F的两端为限制酶EcoRⅠ切割后产生的黏性末端,因此其5'端序列应为AATT-,3'端序列应为-TTAA,B正确。 $$