第1章 第2节 第2课时 微生物的选择培养和计数（Word教参）-【状元桥·优质课堂】2024-2025学年高中生物学选择性必修第三册（人教版2024）

第2课时　微生物的选择培养和计数 [课标要求] 1.学会用生物与环境相适应的观点理解选择培养的原理(生命观念)。 2．利用选择培养基分离细菌，运用相应技术解决生产生活中有关微生物的计数问题(科学探究)。 3．关注有害生物的控制，宣传健康的生活方式等(社会责任)。 (见学生用书P17) 知识点1　微生物的选择培养1.选择培养基 (1)实验室中微生物的筛选 原理：人为提供有利于__目的菌__生长的条件(包括__营养__、温度和pH等)，同时__抑制或阻止__其他微生物的生长。 (2)选择培养基 ①概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时__抑制或阻止__其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 ②举例：筛选土壤中分解尿素的细菌的选择培养基是以__尿素__为__唯一氮源__的。 2．微生物的选择培养 (1)方法：对样品进行充分稀释，然后将__菌液__涂布到制备好的__选择__培养基上。 (2)稀释涂布平板法的操作过程 ①等比稀释操作 a．编号为1×102～1×107的试管中分别盛有9 mL__无菌水__。 b．将__10__g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。 c．取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 ②涂布平板操作 (3)培养观察 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板__倒置__，放入__30～37_℃__的恒温箱中培养1～2 d。在涂布有合适浓度菌液的平板上可观察到分离的__单菌落__。 【辨正误】 (1)选择培养基只允许特定种类的微生物生长，而抑制或阻止其他微生物生长。(　√　) (2)分解尿素的细菌之所以能分解尿素是因为它们能合成脲酶。(　√　) (3)可使用牛肉膏蛋白胨培养基筛选分解尿素的细菌。(　×　) 筛选分解尿素的细菌必须以尿素为唯一氮源，不能使用牛肉膏蛋白胨培养基。 (4)进行稀释涂布平板操作时，涂布器采用酒精消毒后可直接使用。(　×　) 涂布器必须经过灼烧灭菌。 知识点2　微生物的数量测定 1.测定微生物数量的常用方法有__稀释涂布平板__法和__显微镜直接计数__法等。 2．稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目 (1)原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的__一个活菌__。通过统计平板上的__菌落__数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 (2)计数原则 ①选择菌落数为__30～300__的平板进行计数。 ②同一稀释度下，应至少对__3__个平板进行重复计数，求__平均值__。 (3)结果分析 统计的菌落数往往比活菌的实际数目__少__，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是__一个菌落__。因此，统计结果一般用__菌落__数而不是用__活菌__数来表示。 3．显微镜直接计数法 利用特定的__细菌__计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是__活菌数和死菌数的总和__。 4．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验 (1)实验步骤 (2)实验注意事项 ①做好标记：本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前要__做好标记__。例如，在标记培养皿时应注明组别、培养日期和平板上培养样品的__稀释度__等。 ②最好以表格形式记录下不同菌落的特征：一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出__稳定__的菌落特征，菌落的特征包括形状、大小和__颜色__等。 【辨正误】 (1)平板划线法不仅可用于分离微生物，也常用来统计样品中的活菌数目。(　×　) 平板划线法可用于分离微生物，不可用来统计样品中的活菌数目。 (2)培养基表面生长的一个单菌落，必定来源于样品稀释液中的一个活菌。(　×　) 在样品稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，而当两个或多个细胞连在一起时，也可形成一个菌落。 (3)统计菌落数目时，为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计。(　×　) 统计菌落数目时，为保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行统计。 (4)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。(　√　) (5)配制培养不同微生物的培养基时都要将培养基调至中性或弱碱性。(　×　) 不同的微生物生长需要的pH是不同的，如培养霉菌时需将培养基调至酸性。 (教材P20“拓展应用·2”改编)地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%～60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题： (1)你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ 到富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌。因为根据生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，因此从这种土样中获得目的微生物的概率要高于普通环境。__ (2)现在要从土壤中分离纤维素分解菌，设计了如下方案，请补全空白处内容。 ①首先进行土壤取样：在__富含纤维素__的潮湿土壤中用无菌小铁铲铲去表层土，迅速铲取土样，装入无菌纸袋内密封。 ②进行__选择培养__：将土壤稀释液接种到__选择__培养基中进行培养，以__增加纤维素分解菌的浓度__。 ③进行__梯度__稀释：将稀释后的样品涂布到__鉴别纤维素分解菌__的固体培养基上进行培养。 ④分离菌种：在培养的过程中，纤维素分解菌产生__纤维素酶__，将纤维素分解成纤维二糖、葡萄糖。这些产物__不能__(填“能”或“不能”)与刚果红结合形成红色复合物，在培养基上就形成了以__纤维素分解菌__为中心的透明圈，用接种环或接种针挑选__产生透明圈__的菌落就是纤维素分解菌的菌落。 探究点1　微生物的选择培养 1．如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，则该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 提示　该培养基与普通培养基相比较，共同点是营养组成大致相同，都包含碳源、氮源、水和无机盐等；不同点是该培养基以尿素为唯一氮源，使仅能以尿素为氮源的微生物生长。 2．为什么能从热泉中筛选出水生栖热菌？ 提示　由于水生栖热菌能在70～80 ℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在该条件下不能生存，故水生栖热菌能从热泉中被筛选出来。 3．分离分解尿素的细菌的实验中，如何设置对照可以判断培养基是否被污染及选择培养基是否起到了选择作用？ 提示　(1)判断培养基是否被污染：设置未接种的培养基作为空白对照——若培养基上无菌落生长，说明培养基未被污染。判断选择培养基是否起到了选择作用：设置接种相同接种物的全营养培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)作为条件对照——若对照培养基上长出的菌落明显多于选择培养基上长出的菌落，则说明选择培养基起到了选择作用。 1．微生物筛选的原理 (1)原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。即根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。 (2)特定培养基的设计原理与应用实例 特定培养基 的设计原理 应用实例 具体处理 分离菌种 依据营养需求 不添加碳源 自养微生物(硝化细菌等) 不添加氮源 固氮微生物(圆褐固氮菌等) 以尿素为唯一氮源 能分解尿素的微生物 以石油为唯一碳源 能分解石油的微生物 【例1】 (2023·广东)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是(　　) A．a点时取样、尿素氮源培养基 B．b点时取样、角蛋白氮源培养基 C．b点时取样、蛋白胨氮源培养基 D．c点时取样、角蛋白氮源培养基 答案　D 解析　研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白，所以应c点取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，D项正确。 选择培养基上生长的微生物≠目的菌 原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题。有些微生物可以利用其他微生物的代谢物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步鉴定。 探究点2　微生物的数量测定 土壤有“微生物的天然培养基”之称，如图表示对土壤中某种微生物进行分离和计数而进行的对样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图。请据图思考有关问题。 (1)图示统计样品活菌数目的方法是什么？其主要包括哪些操作？ (2)图示微生物分离计数的原理是什么？进行计数时宜选择何种菌落数的平板作统计？ (3)图中选择了104、105、106、107倍的稀释液进行平板培养，最可能是测定土壤中　　的数量，则该平板需要将pH调至　　　、在　　　的恒温培养箱中培养1～2 d。 (4)图中显示，每一稀释度下均设置了四个平板，其目的是什么？应如何对其实施计数？ 提示　(1)依据题图分析，图示为用稀释涂布平板法进行活菌计数。这一方法主要包括“依次等比稀释”操作和“涂布平板”操作。 (2)该方法的原理是当样品稀释度足够高时，培养基表面生长的单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。 (3)细菌　中性或弱碱性　30～37 ℃ (4)目的是设置重复组——统计某一稀释度下平板上菌落数时应至少涂布3个平板作为重复组，以增强实验结果的说服力与准确性。计数时应对该稀释度下的各平板菌落分别统计并取平均值。 1．微生物分离与计数实验分析(以土壤中分解尿素的细菌的分离与计数为例) (1)实验设计原则分析方法 ①设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布3个平板作为重复组，以增强实验结果的说服力与准确性。 注：同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差太大，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。 ②设立两种对照组 a．判断培养基中是否有杂菌污染，需同时将未接种的选择培养基进行培养。 b．判断选择培养基是否具有筛选作用，需同时设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目，进行对比得出结论。 (2)结果分析与评价 内容 现象 结果分析 是否有杂菌污染 对照组培养基上无菌落生长 未被杂菌污染 对照组培养基上有菌落生长 被杂菌污染 实验组选择培养基上菌落形态多样，菌落数偏高 有杂菌生长或培养基上可能混入其他氮源 选择培养基是否具有筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目 选择培养基具有筛选作用 样品的稀释操作是否成功 得到3个或3个以上菌落数为30～300的平板 操作成功 重复组的结果 若选取的是同一土样，统计的结果应该接近 2.平板划线法与稀释涂布平板法比较 【例2】 下图表示研究者从土壤中筛选分解尿素的细菌并计数的相关实验，请据图回答下列问题： (1)微生物接种的方法有很多，该图所示为　　　　　　法，这一方法常用来统计样品中　　　　　(填“活菌”“死菌”或“活菌和死菌”)的数目。为了保证结果准确，一般选择菌落数为　　　　的平板进行计数。实验统计的菌落数往往比细菌的实际数目低，这是因为_______________________________________。 (2)倒平板时，待平板冷却凝固后，应将平板倒过来放置，并用记号笔在皿底标明培养微生物名称、平板上培养样品的稀释度、制作者姓名、培养日期及　　　　等信息。纯化菌种时，为了得到单一菌落，常采用的接种方法是　　　　　　　　　　　　　　。 (3)图中平板内培养基如何起到对尿素分解菌的筛选作用？ _______________________________________________________________ (4)若在5个细菌培养基平板上均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该同学将13、462舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理 　　(填“合理”或“不合理”)。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中　　　　　，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。与显微镜直接计数法相比，此计数方法测得的细菌数较　　　。在实验中，研究者每隔24 h统计一次菌落数目，并选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止　　　　　　　　　　　。为了判断选择培养基是否起到了选择作用，应该增设　　　　　　　　　作为对照。 (5)通常，对分离的菌种还可以依据菌落的　　　　　　　　　　　　　　　　　　　等特征对细菌进行初步鉴定。 解析　(1)由题图信息可知，步骤①②③为稀释涂布平板法；稀释涂布平板法常用来统计样品中活菌的数目。为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。实验统计的菌落数往往比细菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。(2)用记号笔在皿底上标明培养微生物名称、平板上培养样品的稀释度、制作者姓名、培养日期及培养基种类等信息；纯化菌种时为了得到单一菌落，常采用的接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法。(3)由于培养基中只有尿素这一唯一氮源，而凡不能分解尿素的微生物均不能在该培养基中生存，故图中平板内培养基能对尿素分解菌起到筛选作用。(4)如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。用稀释涂布平板法统计细菌数量时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以用此方法测得的活菌数较少，而且显微镜直接计数法统计的一般是活菌数和死菌数的总和。选取菌落数目稳定时记录结果，可防止因培养时间不足导致遗漏菌落数目。为判断培养基是否起到了选择作用，应增设接种了的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。(5)对分离的菌种还可以依据菌落的形状、大小、隆起程度等特征，对细菌作初步鉴定。 答案　(1)稀释涂布平板　活菌　30～300　当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落　(2)培养基种类　平板划线法和稀释涂布平板法　(3)由于该培养基以尿素为唯一氮源，凡是不能分解尿素的微生物均不能生存，只有能分解尿素的微生物才能生存。即可筛选得到尿素分解菌。 (4)不合理　可能的影响因素　少　培养时间不足导致遗漏菌落数目　接种了的牛肉膏蛋白胨培养基 (5)形状、大小、隆起程度和颜色 (1)土壤中微生物分离与计数的一般流程 土壤取样→制备培养基→样品稀释与涂布平板→微生物培养与观察→菌落计数。 (2)微生物数量的两种计数方法比较 项目 间接计数法 (稀释涂布平板法) 直接计数法 (显微镜直接计数法) 原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量 缺点 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 不能区分死菌和活菌 结果 比实际值偏小 比实际值偏大 核心知识小结 [网络构建] [答题必备] 1．在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 2．稀释涂布平板法除可用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。 3．当样品稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。 4．为保证计数结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。 5．显微镜直接计数法是利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察计数的方法，该方法统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。 1．有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学打算从受原油污染的土壤中筛选高效降解原油的菌株，下列有关做法错误的是(　　) A．纯化菌种时，为了得到单菌落，只能采用平板划线法 B．无菌技术要求实验操作应在酒精灯火焰附近进行，以避免周围环境中微生物的污染 C．在筛选过程中应选用选择培养基，即将土壤样品稀释液接种到以原油为唯一碳源的固体培养基上 D．在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌 答案　A 解析　纯化菌种时，为了得到单菌落，可采用平板划线法和稀释涂布平板法，A项错误；无菌技术要求实验操作应在酒精灯火焰附近进行，以避免周围环境中微生物的污染，B项正确；在筛选过程中应选用选择培养基，即将土壤样品稀释液接种到以原油为唯一碳源的固体培养基上，从而提高该菌的筛选率，C项正确；在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌，D项正确。 2．下列有关土壤中微生物的分离与计数的说法，错误的是(　　) A．应该设置对照以排除非测试因素对实验结果的干扰，提高可信度 B．分离不同的微生物要采取不同的稀释度 C．如果得到了3个菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数 D．若牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显小于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落 答案　D 解析　应该设置对照以排除非测试因素(如杂菌)对实验结果的干扰，提高可信度，A项正确；分离不同的微生物要采取不同的稀释度，因为微生物在土壤中的含量有较大差距，B项正确；如果得到了3个菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，C项正确；若牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落，D项错误。 3．如图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，图丙是接种后培养的效果图解。下列相关叙述不正确的是(　　) A．图甲是平板划线法，图乙是稀释涂布平板法 B．这两种方法所用的接种工具分别是接种针和接种环 C．图丙是采用图乙所示方法得到的结果 D．两种方法的接种操作都一定要在火焰附近进行，因为火焰附近存在着无菌区域 答案　B 解析　依据题图分析，图甲是平板划线法，图乙是稀释涂布平板法，这两种方法所用的接种工具分别是接种环和涂布器，B项错误。 4．(2024·6月浙江)脲酶催化尿素水解，产生的氨可作为细菌的氮源。脲酶被去除镍后失去活性。下列叙述错误的是(　　) A．镍是组成脲酶的重要元素 B．镍能提高尿素水解反应的活化能 C．产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖 D．以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌 答案　B 解析　根据题意，脲酶被去除镍后失去活性，说明镍是组成脲酶的重要元素，A项正确；脲酶催化尿素水解的机理为降低化学反应所需的活化能，镍作为脲酶的重要组成元素，应该与降低尿素水解反应的活化能有关，B项错误；产脲酶细菌可利用NH4Cl里的氮源进行代谢活动，因此产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖，C项正确；产脲酶细菌能利用脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源，不能产脲酶的细菌则无法分解尿素获得氮源，因此以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌，D项正确。 5．(2024·全国甲)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题。 (1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是_________________________ _______________________________________________________________________________________________________________________。 (2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算细菌原液中细菌浓度为________个/mL。 (3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是________________，冷却的目的是_____________________________________ ___________________________________。 (4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是__________，判断依据是___________ ___________________________________________________ (答出两点即可)。 (5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈________色。 解析　(1)微生物计数有显微镜直接计数法和菌落计数法，前者计数值比实际值偏大，后者计数值比实际值偏小。(2)由题可知，细胞原液中细菌浓度为100÷0.2 mL(平板涂布体积) ×10(稀释倍数)＝5×103个/mL。(5)伊红美蓝培养基可用来鉴别大肠杆菌，生长在此培养基上的大肠杆菌菌落呈深紫色，并有金属光泽。 答案　(1)显微镜直接计数法无法区分死细胞和活细胞，计数时将死细胞一起计数，菌落计数法当2个细胞或多个细胞连在一起时，在平板上只观察到一个菌落　(2)5×103　(3)杀死涂布器上的微生物，防止杂菌污染　避免温度过高杀死细菌 (4)A　与B、C消毒液相比，A消毒液在相同处理时间下，活细菌减少量最多，且杀菌最快完成，杀菌速度快、效果好　(5)深紫 学科网（北京）股份有限公司 $$