3.2基因工程的基本操作程序课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

3.2 基因工程的基本操作程序 你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？ 培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢？ 培育转基因抗虫棉的四个步骤： 与载体拼接 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 （有抗虫特性） 导入 抗虫基因 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的 检测与鉴定 一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76） 1.目的基因 ⑴概念： 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。 如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关基因。 主要是编码特定蛋白质的基因， 也可以是具有调控作用的因子。 Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因 Bt抗虫蛋白 使棉花抗虫 一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76） 1.目的基因 ⑵实例： 培育转基因抗虫棉用到的Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因。 苏云金芽孢杆菌 产生 Bt 基因 伴胞晶体蛋白 （Bt抗虫蛋白） 表达 破坏鳞翅目昆虫的消化系统 杀死棉铃虫 导入 抗虫棉 培育 棉花细胞 一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76） 2.筛选合适的目的基因 ①从相关已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关 掌握了Bt基因的序列信息。 Bt蛋白分解为多肽后，与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，造成害虫死亡。 Bt蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才表现出毒性，人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。 Q：筛选出来的目的基因如何获取？ 一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76） 3.获取目的基因的方法 人工合成 从基因文库中获取 利用PCR获取和扩增目的基因 一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76） 3.获取目的基因的方法 ⑴人工合成目的基因 ①前提：基因比较小、核苷酸序列已知 ②方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成 ⑵从基因文库中获取 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 蛋白质的 氨基酸序列 mRNA的 核苷酸序列 基因的 核苷酸序列 目的基因 推测 推测 化学合成 DNA合成仪 基因组文库 部分基因文库（如cDNA文库） 生物材料 人工合成 获取目的基因 DNA cDNA 一定大小范围的DNA PCR mRNA 基因组文库 cDNA文库 基因文库 包括 限制酶 酶切 逆转录 导入受体菌中保存 一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76） 3.获取目的基因的方法 ⑶利用PCR获取和扩增目的基因 ①概念： PCR是聚合酶链式反应的缩写。是一项根据DNA半保留复制的原理，通过在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。（穆里斯） Q：PCR需要什么条件呢？先回顾DNA的复制过程！ PCR扩增仪/PCR仪 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子链 ATP 为合成DNA子链供能 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 体内DNA复制所需的基本条件 Q：体外复制怎么改进？ 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子链 ATP 为合成DNA子链供能 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 体内DNA复制所需的基本条件 体外用 高温代替 体外用耐高温的DNA聚合酶 一般为DNA单链 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20〜30个核苷酸。 3′ 5′ DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端，即子链的延伸方向是5 ′→3 ′。 由于DNA聚合酶不能将单个的核苷酸链连接成链，因此子链合成需要引物（最初的已有链）。 DNA聚合酶 3′ 5′ 模板链 DNA复制 参与的组分 PCR技术 参与的组分 在DNA复制中的作用 DNA母链 模板：2条DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 原料：dNTP（4种脱氧核苷酸） 合成DNA子链的原料 能量：ATP 能量：dNTP 为合成DNA子链供能 解旋酶 解旋酶：体外用高温代替 打开DNA双链 DNA聚合酶 DNA聚合酶：耐高温（Taq酶） 催化合成DNA子链 引物：2种小分子单链核酸片段 使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 一定的缓冲液（Mg2＋） 真核细胞和细菌的DNA聚合酶需要Mg2＋激活 PCR技术所需的基本条件： 在PCR过程中实际加入的为dNTP（实质加入的是4种脱氧核苷三磷酸，即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 ATP结构中的五碳糖为核糖，而dATP结构中的五碳糖为脱氧核糖。 ATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤核糖核苷酸，所以ATP是转录的底物。同理，dATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA复制的底物。 一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76） 3.获取目的基因的方法 ⑶利用PCR获取和扩增目的基因 ②条件： 微量离心管 缓冲液 （Mg2＋） DNA模板 4种脱氧核苷酸（dNTP） 2种引物 耐高温的DNA聚合酶 一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76） 3.获取目的基因的方法 ⑶利用PCR获取和扩增目的基因 ②条件： 微量离心管 离心处理后 一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76） 3.获取目的基因的方法 ⑶利用PCR获取和扩增目的基因 ②条件： 一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76） 3.获取目的基因的方法 ⑶利用PCR获取和扩增目的基因 ③反应过程：变性→复性→延伸 90 50 72 ℃ 延伸 90 50 72 ℃ 变性 90 50 72 ℃ 复性 PCR反应过程： 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ A.变性 当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。 B.复性 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 C.延伸 当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ PCR反应过程： 第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。 第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物。 第二轮循环的产物 第三轮循环的产物 第一轮循环 第二轮循环 第三轮循环 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Q1：n次循环后，DNA分子数为 。 （或DNA链有 条。 Q2：n代后，共消耗引物 个。 （或 对） 2n 2n+1 2n+1-2 2n-1 非目的基因序列 目的基因序列 引物 Q3：在第几次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（即完整的目的基因）？ 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 目的基因 目的基因 在第三次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（即完整的目的基因）。n代后，等长目的基因有 个。 2n-2n 一、第一步：目的基因的筛选与获取（P76） 3.获取目的基因的方法 ⑶利用PCR获取和扩增目的基因 ④结果： 1个模板DNA分子经过n轮PCR，以指数方式扩增，可以扩增出2n个DNA片段。 ⑤PCR产物的鉴定： 琼脂糖凝胶电泳　 变性 90℃以上 延伸 72℃左右 复性 50℃左右 基本过程 100bp 200bp 300bp 400bp 500bp 600bp 700bp 800bp 1,200bp 1,000bp 900bp 标准 样品1 样品2 样品3 Q4.利用PCR可以扩增mRNA吗？ mRNA不可以直接扩增，需逆转录成cDNA再进行扩增，称为逆转录PCR，简称RT-PCR。 1.3 传统发酵技术 思考·讨论：目的基因的筛选与获取（P79） 单链RNA DNA-RNA 杂交分子 单链DNA 双链DNA 逆转录酶 核酸酶H 降解RNA链 DNA聚合酶 26 思考·讨论：基因表达载体的构建（P79） Q.获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？ 就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解 不能原因 那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？ 27 培育转基因抗虫棉的四个步骤： 与载体拼接 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 （有抗虫特性） 导入 抗虫基因 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的 检测与鉴定 二、第二步：基因表达载体的构建（P80） 1.构建目的 ⑴使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代。 ⑵使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 2.基因表达载体的组成 基因工程的核心工作 位置：基因的上游（一段有特殊结构的DNA片段） 功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 目的基因必须插入到启动子与终止子之间 位置：基因的下游（一段特殊的DNA片断） 功能：终止转录 鉴别和筛选出受体细胞中是否含有目的基因 DNA复制的起始位点，DNA聚合酶识别和结合位点 拓展延伸 启动子的类型： ①组成型启动子：每种组织器官中均发挥作用。 ②组织特异性启动子：特定组织器官中才能发挥作用。 ③诱导型启动子：特定条件下（光、温度、化学物质等）刺激才能发挥作用。 诱导型启动子 诱导物 作用 激活或抑制 目的基因表达 诱导型启动子： 拓展延伸 启动子与终止子： 位于DNA分子中， 作用：起始和终止转录过程。 起始密码子与终止密码子： 位于mRNA分子中， 作用：起始和终止翻译过程。 “启动子与终止子”VS“起始密码子与终止密码子” 二、第二步：基因表达载体的构建（P80） 3.构建过程 ① 用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。 ② 用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 ③ 将切下的Bt基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。 Q1.“载体”＝“基因表达载体”？ 思考·讨论：目的基因的筛选与获取（P79） 载体 ≠ 基因表达载体 二者都有：标记基因和复制原点两部分DNA片段。 基因表达载体：在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子。 33 Q2.构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？ 思考·讨论：目的基因的筛选与获取（P79） 启动子下游和终止子上游。 因为只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达。 标记基因 启动子 插入目的基因 终止子 复制原点 限制酶切割位点 34 Q3.使用一种DNA限制酶切割，有几种连接情况？如何解决？ 思考·讨论：目的基因的筛选与获取（P79） 载体 目的基因 自连 片段间的连接 目的基因自连 质粒自连 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 正向连接 反向连接 1 1’ 2 2’ 1 2 2’ 1’ 2 1’ 1 双酶切：①可以防止目的基因与载体的反向连接 ②还可以防止质粒、目的基因的自身环化连接 35 二、第二步：基因表达载体的构建（P80） 4.限制酶的选择原则 ①不破坏目的基因原则 ②保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则 ③确保出现相同黏性末端原则（善用“双酶切”，注意方向性，巧用“同尾酶”） 拓展延伸 1.原核基因的结构和表达 翻 译 转 录 mRNA 蛋白质 拓展延伸 加 工 转 录 mRNA前体 成熟mRNA 外显子 内含子 翻 译 蛋白质 2.真核基因的结构和表达 外显子： 能够编码蛋白质的序列 内含子： 不能够编码蛋白质的序列 $$