第3章 微专题 PCR技术拓展应用-【正禾一本通】2024-2025学年高中生物选择性必修3同步课堂高效讲义配套课件（人教版2019 单选）

第3章 基因工程 微专题 PCR技术拓展应用 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 04 05 06 04 05 06 04 05 06 04 05 06 04 05 06 04 05 06 04 05 06 04 05 06 04 05 06 07 08 09 07 08 09 07 08 09 07 08 09 07 08 09 07 08 09 07 08 09 07 08 09 07 08 09 07 08 09 07 08 09 07 08 09 07 08 09 一、反向PCR测定未知DNA区域 1.适用范围：当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。 2.原理：用限制酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。 【对点练习】 1.如图所示，在一段未知序列的突变体DNA片段中，插入了已知序列的T­DNA，要想对T­DNA两侧的未知序列进行测序，下列做法正确的是(　　) A.用引物①和引物④直接进行PCR扩增之后再测序 B.用引物②和引物③直接进行PCR扩增之后再测序 C.用DNA连接酶连接成环状后，再用引物①④PCR扩增后测序 D.用DNA连接酶连接成环状后，再用引物②③PCR扩增后测序 解析：选C。直接选用引物①④组合进行PCR，引物选择方向相反，无法完成扩增，A错误；用引物②和引物③可实现对已知的T­DNA序列进行扩增，但达不到预期目的，B、D错误；用DNA连接酶连接成环状后，用引物①④PCR扩增后测序，恰好可扩增出T­DNA两侧的未知序列，C正确。 2.(2024·广西南宁高二期末)常规PCR只能扩增两引物之间的DNA序列，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是(　　) A.酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列 B.环化阶段，可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶 C.图中引物，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对 D.PCR扩增，将温度调至72 ℃的目的是使引物与模板链结合 解析：选D。在酶切阶段，已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列，不然会将已知序列L切断，造成序列识别混乱，A正确；T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶都可以用来连接黏性末端，因此环化阶段可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶，B正确；PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应该选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对，C正确；PCR扩增中，将温度调至72 ℃的目的是Taq DNA聚合酶将四种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，D错误。 3.(2024·山东济宁高二期中)反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如下图所示。下图链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。下列说法错误的是(　　) A.反向PCR利用了DNA半保留复制的原理 B.图3中DNA进行PCR的过程中，沿引物A延伸子链的方向是逆时针 C.图3所示PCR 产物含有EcoRⅠ的酶切位点 D.反向PCR产物最终还是环状DNA分子，包含已知序列的完整序列 解析：选D。PCR利用了DNA半保留复制的原理，A正确；据图中未知序列的位置可知，图3中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A逆时针延伸子链，沿引物a顺时针延伸子链，才能扩增到未知序列，B正确；由于碱基互补配对，环化后的DNA分子含有EcoRⅠ的切割位点，则PCR产物含有EcoRⅠ的酶切位点，C正确；PCR产物最终还是链状DNA分子，不包含已知序列的完整序列，D错误。 二、PCR定点突变技术——重叠延伸PCR 1.图解 2.四种引物：引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。 3.流程 (1)分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起。 (2)再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。 (3)用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。 (4)通过测序可以检验定点突变是否成功。 【对点练习】 4.重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理如图。下列说法错误的是(　　) A.过程②需要含Mg2＋的缓冲液、模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、Taq DNA聚合酶等 B.若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次DNA分子的复制后，一共会产生2种DNA分子 C.经过程④获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过程⑤获得目的基因 D.过程⑤使用Taq DNA聚合酶延伸，不需要引物 解析：选B。过程②为PCR反应，需要在添加了Mg2＋的缓冲液中才能进行，需要提供模板DNA、分别与两条模板链结合的引物、4种脱氧核苷酸和Taq DNA聚合酶等，A正确；两个反应系统中各自形成两种DNA分子，但由于引物1和引物4形成两个与原DNA相同的DNA分子，所以含有引物1和4的DNA属于同一种DNA，故总共形成3种DNA分子，B错误；过程④获得的杂交DNA有2种，一种3′端为单链，一种5′端为单链，5′端为单链的杂交DNA为所需DNA，C正确；过程⑤是延伸过程，该过程使用Taq DNA聚合酶进行催化，不需要引物，D正确。 5.(2024·河南开封高二期末)PCR是基因工程中的关键技术之一，可以用来获取目的基因，也可以引发基因定点突变。将T­DNA插入A基因后，为了确定T­DNA的插入位置，设计引物并进行PCR的过程如下图，下列相关叙述正确的是(　　) A.该过程产物的长度取决于引物 B.选择引物Ⅰ和引物Ⅲ能达到目的 C.该过程在95 ℃条件下磷酸二酯键断开 D.引物是RNA聚合酶识别和结合的位点 解析：选A。由于引物能与模板特异性结合，所以该过程产物的长度取决于引物，A正确；选择引物Ⅱ和引物Ⅲ能达到目的，B错误；该过程在95 ℃条件下氢键断开，C错误；引物是DNA聚合酶识别和结合的位点，D错误。 6.(2024·河北邯郸高二期中)PCR技术可用于扩增目的基因、引入定点突变等。大引物PCR定点诱变技术的操作过程如图所示。回答下列问题： (1)PCR过程中，温度的控制至关重要。若变性温度过低，则会因____________导致反应效率降低；若复性温度过高，则会因___________导致目标产物的量减少。利用PCR技术扩增目的基因时，需要加入引物的原因是________________。一般还要向PCR反应缓冲溶液中添加Mg2＋，目的是_______________。 (2)进行大引物PCR定点诱变时，需要进行两轮PCR(PCR1和PCR2)。在PCR1中，至少需要经过____个循环才能获得图中所示大引物。在PCR2中，若要获得带有突变位点的改良基因，则应选择的引物是_____(填“①”或“②”)。 解析：(2)由图可知，大引物的两条链均带有突变位点，进行第一轮循环，得到一个不含突变位点的DNA，一个有一条链含有突变位点的DNA，进行第二轮循环，即可得到三个不含突变位点的DNA和一个两条链均含突变位点的DNA，即大引物。从大引物和目的基因的结合位点分析，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的②链。 答案：(1)DNA双链不能充分解开，使得模板减少　引物不能与模板充分配对　DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链　激活DNA聚合酶　(2)2　② 三、荧光定量PCR(RT－PCR) 1.提取RNA：先从样本中提取RNA，RNA中可能有新冠病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。 2.逆转录并PCR：通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA，并进行PCR扩增，在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。 3.荧光产生机理：探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。 4.病毒核酸浓度的检测机理：每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小。 【对点练习】 7.(2024·江西南昌高二期中)荧光定量PCR是通过在PCR体系中添加荧光染料来记录PCR产物的累积情况，从而达到对PCR过程进行实时监控的目的。Ct值表示每个反应管内荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的循环数。通常情况下将已知浓度的DNA标准样品经过梯度稀释后分别取样进行荧光定量PCR，得到一系列的Ct值，以梯度稀释后的浓度对数值作为横坐标，浓度所对应的Ct值为纵坐标绘制曲线，即可得到一个标准曲线，如图所示。下列叙述错误的是(　　) A.荧光定量PCR反应体系中需要添加耐高温的DNA聚合酶 B.荧光定量PCR可以用于检测样品中待测病毒核酸的浓度 C.若两组Ct值的差异在3与4之间，则两组样品中待测病毒核酸的浓度差了30～40倍 D.若标准样品的DNA出现降解，则利用所得的标准曲线分析，待测样品所测Ct值偏高 解析：选C。荧光定量PCR是反复多次进行PCR，所以需要添加耐高温的DNA聚合酶，A正确；根据题意和图示可知，可根据荧光定量PCR的Ct值算出待测病毒核酸的浓度对数值，进而算出病毒核酸浓度，B正确；根据图中Ct值与梯度稀释后的浓度对数值之间的关系可知，如果PCR产物的浓度增加10倍，其荧光强度也会增加10倍，但是Ct值会减少大约3.3个单位(即1个对数单位)，C错误；据图所示，DNA标准样品的浓度越高，达到设定的荧光阈值时所经历的循环数越少，Ct值越小，所以，若标准样品的DNA出现降解，DNA浓度下降，则标准曲线值偏高，待测样品所测Ct值偏高，D正确。 8.(2024·广东汕头高二期末)实时荧光RT－PCR可用于新型冠状病毒的核酸检测，RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA聚合酶链式扩增反应相结合的技术，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是(　　) A.做RT－PCR之前，需要先根据新冠病毒的cDNA核苷酸序列合成引物和探针 B.如果检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染新型冠状病毒 C.RNA不能作为PCR扩增的模板，需将样本中的RNA逆转录为DNA后再扩增 D.还可以检测病毒的外壳或病毒引发机体产生的抗体，其原理都是抗原—抗体杂交 解析：选B。PCR 需要根据cDNA的核苷酸序列合成引物，同时RT－PCR还需要探针与待测样本DNA混合，故需要根据cDNA的核苷酸序列合成探针，A正确。若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者极有可能感染了病毒，B错误。PCR扩增必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板，所以需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增，C正确。RNA病毒的检测方法有：①RNA检测，即检测病毒的遗传物质RNA；②特异性抗原蛋白检测，即检测病毒表面的一种糖蛋白；③特异性抗体检测，即检测感染者体内通过免疫反应所产生的某种抗体。后两种方法的原理是抗原—抗体杂交，D正确。 9.(2024·河北唐山高二检测)“实时荧光定量RT－PCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在1～2 h内即可得到检测结果。Taqman探针是实时荧光定量RT－PCR技术中的一种常用探针(如图1)，其5′端连接荧光基团(R)，3′端连接淬灭剂(Q)。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq DNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步(如图2)。请据图回答下列问题： (1)结合图1和图2分析，“荧光RT－PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有____酶、_______酶、Taqman探针、引物、dNTP、Mg2＋、缓冲剂等。这种分子层面的荧光RT－PCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的______、______有关。 (2)根据Taqman探针功能分析，探针中碱基序列的设计应主要依据___________。新冠病毒是冠状病毒大家庭中新的一员，其碱基序列与引起SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，因此在设计Taqman探针时应筛选出该病毒特有的序列，以避免__________(填“假阴性”或“假阳性”)的出现。 (3)根据图1和图2，Taq DNA聚合酶除了能催化DNA子链的延伸，还能____________________________。 (4)若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a，则反应体系中某时刻荧光信号强度(Rn)主要与__________、__________________________有关。在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度 也等比例增加，增加了检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。可通过荧光强度的变化监测产物量的变化从而得到荧光扩增曲线图(图3)。“平台期”出现的最可能的原因是试剂盒中______________________等有限，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加。 (5)虽然荧光RT－PCR是当前被广泛认可的检测手段之一，但是仍有“假阴性”现象出现，通过上述过程分析，“假阴性”的可能原因有________(填字母)。 a．通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足 b．在样本运输、检测中出现了损坏和污染 c．病毒相应关键序列发生了基因突变 解析：(3)根据图1和图2可知，Taq DNA聚合酶除了能催化DNA子链的延伸，还能催化RNA(Taqman探针)的水解，Taqman探针水解释放出游离R被仪器检测到。(4)在PCR扩增过程中，Taq DNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R，因此，扩增次数越多，样品中病毒初始数量(病毒样品模板RNA含量)越多，则被水解的探针越多，释放出游离的R越多，反应体系中某时刻荧光 信号强度(Rn)也越强。由图3可知，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加，其原因最可能是试剂盒中原料、引物和探针数量(或Taq DNA聚合酶活性)等有限。(5)荧光RT－PCR出现“假阴性”可能是通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足，使荧光信号强度(Rn)未达到或超过阈值而没有检测出；也可能是在样本运输、检测中出现了损坏和污染，导致新冠病毒核酸破坏而无法检测；还可能是病毒相应关键序列发生了基因突变，导致探针失效而无法检测，因此a、b、c正确。 答案：(1)逆转录　Taq DNA聚合　引物　Taqman探针　(2)新冠病毒RNA内部的一段序列(或新冠病毒RNA逆转录形成的DNA的部分序列)　假阳性　(3)催化RNA(Taqman探针)的水解　(4)扩增次数　样品中病毒初始数量(或病毒样品模板RNA含量)　原料、引物和探针数量(或Taq DNA聚合酶活性)　(5)a、b、c $$