第3章 第2节 基因工程的基本操作程序-【正禾一本通】2024-2025学年高中生物选择性必修3同步课堂高效讲义配套课件（人教版2019 单选）

第3章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序 任务一　目的基因的筛选与获取 自主预习 耐高温的DNA聚合酶 合作探究 学以致用 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 03 02 01 03 02 01 03 02 01 03 02 01 02 03 01 02 03 任务二　基因表达载体的构建 自主预习 上游 RNA聚合酶 mRNA 目的基因 下游 转录 目的基因 合作探究 学以致用 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 任务三　将目的基因导入受体细胞及 目的基因的检测与鉴定 自主预习 合作探究 学以致用 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 新情境命题 肝星状细胞活化的可视化报告系统的建立(科学探究) 课堂小结　巩固提升 课下巩固训练(十三)　 基因工程的基本操作程序 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 【学习目标】1.科学思维：基于抗虫棉的培育实例，采用文字和图示的方式说明基因工程的基本操作程序。 2.生命观念：基于PCR技术，运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等内容。 表达产物 编码蛋白质 已知结构和功能清晰 PCR 基因文库 1.目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞 或获得预期 等的基因，它主要是指 的基因。 2.筛选合适的目的基因 从相关的 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 3.获取目的基因的方法 性状 缓冲液 引物 脱氧核苷酸 耐高温的 温度 4.利用PCR获取和扩增目的基因 (1)PCR(聚合酶链式反应)：根据 的原理，在体外提供参与DNA复制的各种 与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行 的技术。 (2)PCR反应的条件：一定的添加Mg2＋的 、DNA模板、2种 、4种 、 DNA聚合酶，以及能自动调控 的仪器。 (3)PCR反应的过程 PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。在循环之前，常要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。 DNA半保留复制 组分 大量复制 引物 ①变性：当温度超过 时，双链DNA解聚为 。 ②复性：当温度下降到 左右时，两种 通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 90 ℃ 单链 50 ℃ ③延伸：当温度上升到 左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在 的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 (4)PCR产物的鉴定：常采用 来鉴定。 【深挖教材·P77】 (1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。 (2)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。 72 ℃ 琼脂糖凝胶电泳 5.生物体内DNA复制与PCR反应的比较 比较项目 体内DNA复制 PCR反应 解旋 在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分DNA双链解开 90 ℃以上高温下解旋，DNA双链全部解开，不需要解旋酶 酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶 耐高温的DNA聚合酶 引物 一小段RNA 可以是RNA或单链DNA分子片段 合成子链 在引物基础上，一条链连续合成；另一条链不连续合成，再由DNA连接酶连接 分别从两条链的引物的3′端开始延伸，都是连续合成 过程 循环次数 受生物体自身控制 30多次 产物 完整DNA 两个引物之间的DNA片段 相同点 都需要DNA模板、4种脱氧核苷酸、分别与两条模板链相结合的两种引物；都是半保留复制，严格遵循碱基互补配对原则 如图所示为PCR过程中部分原理示意图。 (1)结合上图分析PCR过程中为什么需要引物？DNA链复制的方向是怎样的？ 提示：DNA聚合酶不能从开始合成子链，只能把游离的脱氧核苷酸连接到已经存在的片段上。DNA链复制的方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 (2)PCR扩增目的基因时，复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在G—C含量高时，对复性温度的设定有什么要求？说明理由。 提示：设定的复性温度要高一些，因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。 (3)在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因(可用相关图解解释)? 提示：第3轮，如图所示： 1.(2024·山东高考)制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①～④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有(　　) 反应管 加入的单链DNA ① 5′－GCCGATCTTTATA－3′ 3′－GACCGGCTAGAAA－5′ ② 5′－AGAGCCAATTGGC－3′ ③ 5′－ATTTCCCGATCCG－3′ 3′－AGGGCTAGGCATA－5′ ④ 5′－TTCACTGGCCAGT－3′ A.①② B.②③ C.①④ D.③④ 解析：选D。分析反应管①～④中分别加入的适量单链DNA可知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3′端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对 的双链DNA区，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3′端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3′端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有③④。 2.(2024·四川成都高二期末)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板经过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。它在需要诱变的位置合成两个带有变异基因碱基的互补引物，然后分别与引物1和引物4做PCR，这样得到的两个PCR引物产物都带有突变基因，并且彼此重叠，再将重叠部位进行重组PCR就能得到诱变PCR产物，如图所示。下列叙述正确的是(　　) A.由于引物2和引物3能碱基互补配对，因此PCR1和PCR2需分别进行 B.PCR1和PCR2反应系统中均进行一次复制，共产生2种双链DNA分子 C.PCR3反应体系中，也可选择含引物2和引物3的核苷酸链进行重叠延伸 D.PCR反应系统中耐高温的DNA聚合酶的浓度过低会引起非特异性扩增产物增多 解析：选A。由图可知，引物2和引物3分别与目的基因两条链的对应位置结合，因此二者之间存在互补配对片段，为防止扩增时引物2与引物3之间进行配对，需将其置于不同反应系统中，A正确；引物1和2(PCR1)位于一个反应系统中，引物3和4(PCR2)位于另一个反应系统中，这两个反应系统均进行一次复制，能产生3种双链DNA分子，即引物1(或4)扩增的双链DNA，引物2扩增的双链DNA，引物3扩增的双链DNA，B错误；PCR扩增DNA的过程中，新合成的两条单链延伸方向均为5′端到3′端，PCR3反应体系中，为得到完整的DNA分子，需要选择含引物1和引物4的核苷酸进行重叠延伸，C错误；复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，非特异性产物增加，D错误。 3.(2024·浙江宁波高二期末)图中阴影部分表示DNA片段中的某目的基因序列，现利用PCR技术对该目的基因进行扩增，其中Ⅰ～Ⅳ表示引物结合位置。下列叙述正确的是(　　) A.2种引物与模板链结合的位置分别对应图中的Ⅰ和Ⅳ B.该反应除模板、引物外，还需要原料和耐高温的DNA酶 C.初始的1个目的基因经历3轮PCR循环需要消耗16个引物 D.复性阶段若温度偏低，可能导致产物中非目的基因片段增加 解析：选D。引物需要与模板链的3′端结合，2种引物与模板链结合的位置分别对应图中的Ⅱ和Ⅲ，A错误；该反应除模板、引物外，还需要原料和耐高温的DNA聚合酶(而非DNA酶)，B错误；初始的1个目的基因经历3轮PCR循环得到23＝8个DNA分子，共16条链，由于模板的两条链不需要引物，共需要消耗16－2＝14个引物，C错误；复性的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，故复性阶段若温度偏低，可能导致产物中非目的基因片段增加，D正确。 遗传 表达 1.构建基因表达载体的目的 (1)使目的基因在受体细胞中 ，并且可以 给下一代。 (2)使目的基因能够 和发挥作用。 2.基因表达载体的组成 稳定存在 3.基因表达载体的构建过程 (1)首先用一定的 切割载体。 (2)然后用 限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 (3)再利用 将目的基因片段拼接到载体的切口处。如图所示： 限制酶 同种 DNA连接酶 2.启动子和终止子与起始密码子和终止密码子相同吗？ 提示：不相同。启动子和终止子位于DNA上，是基因表达必需的部分；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。 1.目的基因的插入位点是随意的吗？为什么？ 提示：不是。基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间，若目的基因插入启动子内部，启动子将失去原有的功能。 1.(2024·安徽蚌埠高二期末)科学家为了提高某种果实的储藏时间，从该植物体内提取Ers1基因(乙烯受体基因)，按照图示流程将Ers1基因重新导回该植物，致使该植物原有Ers1基因翻译受抑制。已知限制酶HpaⅠ切割后为平末端， XhoⅠ和BamHⅠ切割后露出的黏性末端碱基序列不同，据图分析，提取的目的基因两端需添加的限制酶的识别序列为(　　) A.目的基因A 端添加HpaⅠ的识别序列， B端添加XhoⅠ的识别序列 B.目的基因A 端添加XhoⅠ的识别序列，B端添加HpaⅠ的识别序列 C.目的基因A 端添加XhoⅠ的识别序列，B 端添加BamHⅠ的识别序列 D.目的基因A端添加HpaⅠ的识别序列， B端添加HpaⅠ的识别序列 解析：选B。由于质粒的启动子内有BamHⅠ的切割位点， 所以目的基因两端不能添加BamHⅠ的识别序列；若要使插入的目的基因能抑制原有Ers1基因的表达，该目的基因应反向插入T­DNA中，使其转录的mRNA与细胞中原有Ers1基因转录的mRNA互补而抑制其翻译，再结合目的基因的转录方向，可确定目的基因A 端添加XhoⅠ的识别序列，B端添加HpaⅠ的识别序列。 2.有关基因表达载体构建的说法，错误的是(　　) ①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子 ②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA ③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止 ④启动子是一段有特殊序列结构的RNA片段 ⑤必须在细胞内进行 A.②③⑤ B.①④⑤ C.①②⑤ D.③④ 解析：选B。基因表达载体的构建是基因工程的核心内容，基因表达载体是载体的一种，除了目的基因外，它还必须有启动子、终止子和标记基因等，①错误；启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，②正确；终止子控制着转录的结束，③正确；启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，④错误；基因表达载体的构建必须在细胞外进行，⑤错误。 3.(2023·新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 解析：选C。质粒和目的基因只用一种酶切割容易造成自身环化或目的基因在质粒中反向连接，且酶3切割形成平末端，而E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于T4 DNA连接酶，A不符合题意，用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，无法连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C符合题意；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D不符合题意。 1.将目的基因导入受体细胞 (1)转化的含义：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和 的过程。 表达 T­DNA 染色体 显微注射 受精卵 DNA分子 受体 导入方法 操作方式 植物细胞 花粉管通道法 ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入 中； ②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助 进入 农杆菌转化法 农杆菌细胞内的Ti质粒上的 可携带目的基因整合到受体细胞的 DNA上 动物细胞 技术 常用受体细胞： 原核细胞 Ca2＋处理法 用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中 的生理状态 子房 花粉管通道 胚囊 【深挖教材·P81】 下图为农杆菌转化法示意图，请将①～④的操作序号填写在图中相应的方框内。 ①转入农杆菌　②构建表达载体　③导入植物细胞　④将目的基因插入染色体DNA中 答案：A.②　B.④　C.①　D.③ 抗原—抗体 蛋白质 抗性程度 2.目的基因的检测与鉴定 (1)分子水平检测 ①通过 等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了 或检测目的基因是否转录出 。 ②从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行 杂交，检测目的基因是否翻译成了 。 (2)个体生物学水平鉴定 包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及 。 PCR 目的基因 mRNA 提示：Ti质粒上的T­DNA也称为可转移DNA，可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。 2.农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而大多数单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？说明原因。 1.为什么在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入到Ti质粒的T­DNA上？ 提示：能，可从双子叶植物中提取该化学物质，再用该化学物质处理单子叶植物细胞，然后就可以用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。 3.植物基因工程常用的受体细胞为什么可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？ 提示：植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。 4.从细胞器的功能上分析，若通过基因工程生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌作受体细胞吗？ 提示：不可以。因为糖蛋白中的蛋白质是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。 5.目的基因能在真核生物中稳定遗传的关键是什么？如何检测？ 提示：目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上。可以用PCR技术进行检测。 6.检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？ 提示：用叶片饲喂棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。如果棉铃虫死亡，说明抗虫基因已经表达；否则，抗虫基因没有表达。 1.(2024·安徽安庆高二期末)下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。下列相关叙述正确的是(　　) A.②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与 B.②到③过程，需要钙离子处理，有助于促进重组Ti质粒转化到农杆菌细胞中 C.③导入④后，重组Ti质粒整合到④的染色体DNA上 D.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了不可遗传变异 解析：选B。②重组质粒的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与，DNA聚合酶一般用于DNA复制过程，A错误；将重组质粒导入农杆菌，常用钙离子处理，使农杆菌处于一种易于吸收周围的DNA分子的生理状态，有助于促进重组Ti质粒转化到农杆菌细胞中，B正确；③侵染④植物细胞后，重组Ti质粒上的T­DNA整合到植物细胞的染色体上，C错误；⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异，D错误。 2.(2024·安徽蚌埠高二期末)科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C 导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜，所用的 Ti 质粒如图所示。下列叙述正确的是(　　) A.该技术的原理是农杆菌的拟核DNA 与番木瓜基因发生重组 B.构建基因表达载体需要限制酶和耐高温的 DNA 聚合酶 C.可利用 PCR 技术筛选出含有抗病毒蛋白基因C 的受体细胞 D.可利用卡那霉素抗性基因检测是否成功构建抗病毒番木瓜 解析：选C。农杆菌的拟核DNA不会与番木瓜基因发生重组，和番木瓜基因发生重组的是农杆菌质粒上的T­DNA上的基因，A错误；构建基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶，B错误；可利用 PCR 技术扩增目的基因，进而筛选出含有抗病毒蛋白基因C的受体细胞，C正确；因为转入番木瓜的是重组Ti质粒的T­DNA，其中不含卡那霉素抗性基因，因此转基因抗病番木瓜不含有卡那霉素抗性基因，故不具有卡那霉素抗性，D错误。 3.为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是(　　) A.用限制性内切核酸酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒 B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞 C.用PCR技术检测C基因是否整合到菊花染色体上 D.在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞 解析：选D。目的基因(C基因)两端有EcoRⅠ切割位点，可用限制性内切核酸酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒，A不符合题意；一般用农杆菌等作为媒介去侵染植物的愈伤组织等，将含有目的基因的质粒导入细胞，B不符合题意；检测C基因是否整合到菊花染色体上，常采用PCR技术，C不符合题意；据图可知，质粒中含有潮霉素抗性基因，不含卡那霉素抗性基因，故无法用卡那霉素来筛选被转化的菊花细胞，D符合题意。 肝纤维化与肝细胞癌的发生密切相关，肝纤维化是指肝细胞外基质的病理性沉积，沉积物中Ⅰ型胶原蛋白是主要成分。研究发现活化的人肝星状细胞会大量合成和分泌Ⅰ型胶原蛋白沉积在肝小叶的窦间隙，大量产生Ⅰ型胶原蛋白是肝星状细胞活化的标志之一，人Ⅰ型胶原蛋白由2条Ⅰ型胶原蛋白α1肽链和1条α2肽链组成，它们分别由COL1A1和COL1A2编码。本研究旨在通过基因工程技术用人COL1A1启动子序列调控增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的表达，在LX­2细胞(永生化的人肝星状细胞)中建立一个人肝星状细胞活化的可视化报告系统。 【命题设计】 1.考查知识迁移能力与生命观念 (1)研究人员构建了如图1所示的基因表达载体，构建过程所需要的工具酶有_________；其中Kozak序列能增强EGFP基因的表达，已知EGFP基因的α链为转录的模板链，则应将图2中EGFP基因的______(填“A”或“B”)端与Kozak序列连接。除图1中所示元件外，基因表达载体还应具备_______(至少答两点)等元件。 2.考查实验分析能力与科学探究 (2)使用慢病毒包装系统将基因表达载体导入LX­2细胞中，并筛选得到了荧光强度最强的细胞株(LX­2­CE)进行扩大培养于后续研究。为验证LX­2­CE能通过EGFP表达来反映细胞表达COL1A1能力的改变，本研究选取了已知具有潜在抗肝纤维化作用的药物青蒿琥酯对LX­2­CE进行处理。实验分组中的阴性对照组为_______________，阳性对照组为加10 μg/L的TGF­β1诱导处理的LX­2­CE，实验组为加入不同浓度青蒿琥酯与10 μg/L的TGF­β1共处理的LX­2­CE。实验结束后，对各组LX­2­CE进行荧光检测，并分别通过________和_________技术检测相关基因(COL1A1和EGFP)是否转录出mRNA和翻译出蛋白质，与荧光检测结果相互印证。若实验组的荧光强度均______(“低于”或“高于”)阳性对照组的荧光强度，说明LX­2­CE荧光强度的改变可以反映青蒿琥酯的潜在抗肝纤维化作用。实验中10 μg/L的TGF­β1的作用是_____________。 3.考查对问题的分析能力与社会责任 (3)系列实验结果表明，外源性COL1A1启动子调控的EGFP的表达能在一定程度上反映内源性COL1A1启动子调控的COL1A1的表达水平的变化。请你推测该人肝星状细胞活化的可视报告系统建立的意义是__________________。 解析：(1)基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，构建基因表达载体所需要的工具酶为限制酶和DNA连接酶。启动子在基因的上游，转录方向为5′→3′，转录模板链的方向为3′→5′，α链为转录的模板链，因此应将EGFP基因的B端与Kozak序列连接。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，故除图1中所示元件外，基因表达载体还应具备复制原点、终止子等。(2)为验证LX­2­CE能通过EGFP表达来反映细胞表达COL1A1能力的改变，实验分组中的 阴性对照组为无诱导处理的LX­2­CE。基因工程检测基因是否转录出mRNA应该用PCR，检测基因是否翻译出蛋白质应该用抗原—抗体杂交技术。根据实验设计分析可知，10 μg/L的TGF­β1可以活化LX­2­CE，模拟人肝纤维化，同时若LX­2­CE荧光强度的改变可以反映青蒿琥酯的潜在抗肝纤维化作用，则实验组的荧光强度应该低于阳性对照组的荧光强度。(3)根据题干可知人肝星状细胞活化的可视报告系统建立的意义是为抗肝纤维化药物的研究提供新的细胞模型。 答案：(1)限制酶和DNA连接酶　B　复制原点、终止子　(2)无诱导处理的LX­2­CE　PCR　抗原—抗体杂交　低于　活化LX­2­CE，模拟人肝纤维化　(3)为抗肝纤维化药物的研究提供新的细胞模型 【教材答疑】 从社会中来 P76 抗虫机制：转基因抗虫棉是指棉花细胞染色体上整合有外源抗虫基因的棉花品种，其体内能合成Bt抗虫蛋白。棉铃虫等取食后，Bt蛋白在昆虫的碱性肠道中转变为毒素，从而使害虫的肠道细胞受到破坏，短时间内使害虫死亡。步骤：获取苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因，构建基因表达载体，将基因表达载体通过农杆菌转化法导入棉花细胞，目的基因的检测与鉴定。 P79 mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 P80 这种方法针对性差，完全靠运气，且无法确定哪些基因导入了受体细胞。 [练习与应用·P83] 一、概念检测 1.(1)√　(2)×　(3)×　2.D 二、拓展应用 外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。 【体系构建】 【核心语句】 1.PCR每次循环都包括变性、复性和延伸三步。 2.基因表达载体的构建是基因工程的核心，基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3.目的基因导入植物细胞常用花粉管通道法和农杆菌转化法，导入动物细胞常用显微注射法，导入原核生物细胞常用Ca2＋处理法。 4.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或目的基因是否转录出了mRNA常用PCR等技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质常用抗原—抗体杂交技术。 【基础巩固练】 一、选择题 1.下列有关基因工程的叙述，正确的是(　　) A.限制性内切核酸酶只在获取目的基因时才用 B.重组质粒的形成是在细胞内完成的 C.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 D.目的基因必须与质粒连接后才能导入受体细胞 解析：选C。基因工程中基因表达载体的构建过程中，需要用同种限制性内切核酸酶切割目的基因和载体，A错误；重组质粒的形成在细胞外完成，B错误；蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料，从而通过人工合成的方式获得目的基因，C正确；外源目的基因必须与载体结合才能导入受体细胞，而质粒只是载体的一种，动植物病毒或噬菌体也可以作为载体，D错误。 2.下列关于目的基因导入受体细胞的叙述，错误的是(　　) A.培育转基因大米可用花粉管通道法导入目的基因 B.显微注射技术是将目的基因导入动物细胞采用最多的方法 C.目的基因导入大肠杆菌最常用的方法是Ca2＋处理法 D.农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法 解析：选A。水稻的花很小，不适合用花粉管通道法导入目的基因，A错误；将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，B正确；将目的基因导入大肠杆菌最常用的方法是用Ca2＋处理，使大肠杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态，C正确；将目的基因导入植物细胞常用的方法有农杆菌转化法，此外还有花粉管通道法，D正确。 3.某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施有效的是(　　) A.增加模板DNA量 B.延长变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度 解析：选D。增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异条带，A不符合题意；延长变性的时间和延长延伸的时间会影响变性、延伸过程，但对引物与单链DNA的结合配对影响不大，故不能有效减少非特异条带，B、C不符合题意；非特异产物增加的原因可能是复性温度过低造成的引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异条带的产生，D符合题意。 4.番茄叶片受害虫的损伤后，叶肉细胞迅速合成蛋白酶抑制剂，抑制害虫的消化作用。人们尝试将番茄的蛋白酶抑制剂基因导入玉米，以抵御玉米螟。下图为培育转基因抗虫玉米的流程图，下列相关叙述正确的是(　　) C.重组Ti质粒应有DNA聚合酶识别和结合的部位，以启动蛋白酶抑制剂基因的转录 D.若将目的基因导入二倍体玉米的花粉细胞，通过花药离体培养，再用秋水仙素处理单倍体植株，可获得稳定遗传的转基因玉米 A.用限制酶切割番茄的DNA得到的产物就是蛋白酶抑制剂基因 B.用氯化钙处理玉米受体细胞，有利于含目的基因的重组质粒导入 解析：选D。用限制酶切割番茄的DNA得到的产物不一定是蛋白酶抑制剂基因，需要进行筛选，A错误；将番茄的蛋白酶抑制剂基因转入玉米细胞时，最常采用的方法是农杆菌转化法，氯化钙用于处理原核生物，B错误；重组Ti质粒应有RNA聚合酶识别和结合的部位，即启动子，以启动蛋白酶抑制剂基因的转录，C错误；若将目的基因导入玉米花粉细胞，通过花药离体培养和秋水仙素处理可获得稳定遗传的转基因玉米，D正确。 5.在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述不正确的是(　　) A.该载体最可能为环状DNA分子 B.两种限制酶在载体上各有一个酶切位点 C.限制酶R1与R2的切点最短相距约200 bp D.限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂 解析：选D。当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶分别切割产生的DNA片段等长，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；两种限制酶同时切割时则产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点至少相距200 bp，C正确；限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点上两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。 6.(2024·浙江杭州高二期末)PCR技术是在DNA聚合酶作用下，在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物技术。下列叙述正确的是(　　) A.双链DNA在高温下氢键和磷酸二酯键断裂形成2条DNA单链 B.PCR结果出现较多非目的基因片段，可能是引物过短造成的 C.当温度上升到72 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 D.温度降低后，单链DNA和引物结合的部分碱基序列相同 解析：选B。双链DNA在高温下解旋使得DNA双链打开，破坏的是碱基对之间的氢键，磷酸二酯键没有断裂，A错误；引物过短，特异性差，可能会和非目的基因片段结合，导致PCR结果出现较多非目的基因片段，B正确；温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，当温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA，C错误；当温度降低时，单链DNA和引物结合的部分碱基序列互补，D错误。 7.(2024·北京昌平高二期末)为探究海鲷催乳素启动子(psbPRL)的关键功能位点，将启动子区域序列进行分段截短，分别构建含荧光素酶基因的重组质粒，检测启动子的启动能力，结果如下图。下列叙述错误的是(　　) A.将启动子序列插入荧光素酶基因的上游 B.用限制酶和DNA连接酶构建重组质粒 C.荧光值越高代表启动子的启动能力越强 D.150～700 bp之间具有提高启动能力的序列 解析：选D。启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，将启动子序列插入荧光素酶基因的上游，才能启动基因的转录，A正确；构建重组质粒时，用限制酶切割后需要在DNA连接酶的作用下才能连接重组质粒，B正确；据图分析，荧光值越高代表启动子的启动能力越强，C正确；据图分析，90～150 bp时具有提高启动能力的序列，D错误。 8.如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶。下列说法错误的是(　　) A.图示对质粒和目的基因切割用到了两种限制酶 B.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 C.构建基因表达载体时需要用到限制酶SmaⅠ D.除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 解析：选C。为防止酶切后单个含目的基因的DNA片段及质粒自身连接成环状，图示对质粒和目的基因切割用到了两种限制酶，A正确；卡那霉素抗性基因作为标记基因，主要作用是筛选含有目的基因的受体细胞，B正确；限制酶SmaⅠ的识别序列和切割位点位于目的基因上，因此构建基因表达载体时不能用限制酶SmaⅠ，应用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，C错误；基因表达载体一般包括目的基因(抗原基因)、标记基因(抗卡那霉素基因)、启动子和终止子等，D正确。 二、非选择题 9.(2023·全国乙卷·节选)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。 (1)构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。 (2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为________________；②为__________________，其作用是_________________________________；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是_______________。 (3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是______________(答出1点即可)。 (4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是_________________。 解析：(2)一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来。终止子位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来，该题中的氨苄青霉素抗性基因就可以作为这种基因。(3)结合题中信息可知，将构建好的基因表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现有的大肠杆菌发绿色荧光，即GFP蛋白的荧光颜色，推测发绿色荧光的可能原因是GFP基因 突变后编码的蛋白质与突变前相同。(4)基因工程的基本操作程序包括：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。欲通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可通过基因工程的方法将目的基因导入酵母菌，之后检测酵母菌是否发黄色荧光，如果发黄色荧光，则可证明YFP基因能在真核细胞中表达，否则，不能证明YFP基因能在真核细胞中表达。 答案：(2)终止子　启动子　被RNA聚合酶识别并结合，驱动GFP突变基因的转录　鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来　(3)密码子具有简并性，GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前相同　(4)选择合适的载体，利用合适的限制酶和DNA连接酶将YFP基因和载体连接起来，构建基因表达载体，之后将基因表达载体导入酵母菌，检测其是否会发黄色荧光 【综合提升练】 一、选择题 1.利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂，用于降解某种农药的残留，基本流程如图所示。下列叙述正确的是(　　) A.过程①的反应体系中需要加入逆转录酶和核糖核苷酸 B.过程②需使用限制酶、耐高温的DNA聚合酶以及DNA连接酶 C.过程③需要使用NaCl溶液处理大肠杆菌细胞 D.过程④可利用PCR技术鉴定CarE基因是否成功导入受体细胞 解析：选D。过程①表示通过逆转录法合成目的基因，该过程需要逆转录酶和脱氧核糖核苷酸，A错误；过程②是基因表达载体的构建，不需要使用耐高温的DNA聚合酶，B错误；过程③常用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C错误；过程④可利用PCR技术鉴定CarE基因是否成功导入受体细胞，D正确。 2.(2024·江西南昌高二期中)天然玫瑰没有生成蓝色翠雀花素所需的相关基因，因此蓝玫瑰被认为是不可能培育成功的。科学家利用链霉菌的蓝色翠雀花素合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图，PmeⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ、SacⅠ为不同限制酶)，通过农杆菌转化法导入天然玫瑰从而成功培育出了蓝玫瑰。下列叙述正确的是(　　) A.sfp和idgS基因表达时转录的模板链是T­DNA的同一条 B.将sfp基因和idgS基因插入Ti质粒时使用的限制酶分别是BamHⅠ和SpeⅠ、SacⅠ C.可用抗原—抗体杂交法检测idgS基因是否成功表达出了蓝色翠雀花素 D.农杆菌在自然条件下可侵染单子叶植物和裸子植物，而对大多数双子叶植物没有侵染能力 解析：选B。sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的，转录是以DNA的一条链为模板进行的，由启动子方向可知，两基因转录的模板不同，A错误；将sfp基因插入Ti质粒时，若使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ，则会将终止子一同切除，故只能用BamHⅠ，将idgS基因插入Ti质粒时使用的限制酶是SpeⅠ、SacⅠ，B正确；idgS基因的表达产物是蓝色翠雀花素合成酶，可用抗原—抗体杂交法检测idgS基因是否表达出相应的蛋白质，C错误；农杆菌在自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力，D错误。 3.(2024·山东济宁高二期末)双向启动子可同时结合两个 RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是(　　) A.可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞 B.为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C.在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞 D.可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用 解析：选B。将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，A正确；如果用SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒，会破坏LUC基因，B错误；如果成功导入含有壮观霉素抗性基因的基因表达载体，受体细胞就具有抗壮观霉素的能力，在含有壮观霉素的培养基上能生存，因此可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C正确；双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β­葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光和生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。 4.(2024·河南信阳高二期中)在构建基因表达载体时，传统方法常受限于限制酶识别序列。科研人员研发了新的DNA重组方法：In­Fusion技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列)，然后用In­Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列。主要操作过程如图所示。下列叙述错误的是(　　) A.推测In­Fusion酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端、连接磷酸二酯键 B.载体A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化 C.形成重组质粒时，如果温度远高于50 ℃，黏性末端的碱基更容易互补配对 D.该技术对目的基因进行PCR，需要经历3次循环才能得到两端含引物1和引物2的目的基因 解析：选C。分析题意可知，本技术的过程是在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列)，然后用In­Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列，推测In­Fusion酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端，并且使目的基因与线性化质粒通过磷酸二酯键连接形成重组质粒，A正确；载体A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化，B正确；重组质粒形成时如果温度远高于50 ℃，氢键不容易形成，黏性末端的碱基不容易互补配对，C错误；根据DNA的半保留复制的特点，可知PCR第3轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链，即仅含引物之间的序列，因此，需要经过3轮循环才能得到两端含引物1和引物2的目的基因，D正确。 二、非选择题 5.金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题： (1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过____________得到__________用于PCR扩增。 (2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的__________位点。设计引物时需要避免引物之间出现____________，干扰引物与模板的结合。 (3)图中步骤1代表________，步骤2代表复性，步骤3代表________，这三个步骤组成一轮循环。 (4)PCR扩增时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏__________的碱基配对。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但____________的引物需要设定更高的复性温度。 (5)若PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有________。(填序号) ①升高复性温度　②降低复性温度 ③重新设计引物 解析：(1)利用PCR扩增目的基因，首先要有目的基因作为模板，所以从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA，从而用于PCR扩增。(2)构建重组质粒时，需要先对目的基因和质粒进行切割，因此在引物中需要增加适当的限制酶切割位点，便于切割和连接。设计的引物之间不能出现碱基互补配对，否则引物自连后，无法与模板连接。(3)步骤1是高温变性，使模板DNA 双链解聚为单链；步骤2代表复性，目的是使引物结合到相应的单链DNA上；步骤3代表延伸，进行DNA复制，这三个步骤组成一轮循环。(4)复性的目的是使引物结合到相应的单链DNA上，因此复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。G、C之间有3个氢键，A、T之间有2个氢键，氢键越多DNA的结构越稳定，因此对于G、C含量高的引物需要设定更高的复性温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，有可能是引物间自连，也可能是复性温度过高造成的，因此要采取降低复性温度和重新设计引物的改进措施，故选②③。 答案：(1)逆转录　cDNA　(2)限制酶切割　碱基互补配对　(3)变性　延伸　(4)引物与模板　G、C含量高　(5)②③ $$