3.1 重组DNA技术的基本工具-2024-2025学年高二生物同步高效教学课件（人教版2019选择性必修3）

第三章 基因工程 3.1 重组DNA技术的基本工具 基因的结构和功能 1.基因与DNA的关系？ 2.基因的基本单位是什么？ 3.基因的功能？ 基因是有遗传效应的DNA片段 CH2 H OH H H H H 碱基 磷酸 5’ 4’ 3’ 2’ 1’ 脱氧核苷酸 挖掘记忆 储存、传递、表达遗传信息 复制 转录 翻译 DNA RNA 逆转录 复制 蛋白质 　　指按照 ,进行严格的设计并通过 DNA重组和 等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的 。由于基因工程是在 上进行设计和施工的，因此又叫作 。 人们的愿望 体外 转基因 新的生物类型和生物产品 DNA分子水平 DNA重组技术 基因工程 P67 练.下列关于基因工程的叙述，不正确的是（ ） A．基因工程的原理主要是基因重组 B．运用基因工程技术，可使生物发生定向变异 C．一种生物的基因转接到另一种生物的DNA分子上， 属于基因工程的内容 D．是非同源染色体上非等位基因的自由组合 D 创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品 操作对象： 操作环境： 操作水平： 原理： 特点： 基本过程： 基因(DNA) DNA 分子水平 基因重组 生物体外 剪切→拼接→导入→表达 定向改造生物性状，彻底打破生殖隔离 水母的绿色荧光蛋白基因 表达的基础 重组DNA RNA 蛋白质 性状 复制 转录 翻译 翻译 拼接的基础 1. DNA的基本组成单位 。 2. 都遵循 原则 3. DNA分子的空间结构都是规则的 结构 相同（四种脱氧核苷酸） 碱基互补配对 双螺旋 1. 基因是控制生物 的结构与功能单位 2. 遗传信息的传递都遵循 法则 3. 生物界共用 。（相同的遗传信息在不同的生物体内表达出相同的蛋白质）。 中心 一套遗传密码 性状 到社会中去 番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭，当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。 DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些 “分子工具”各具有什么特征呢？ 环斑病毒的 非转基因木瓜 转基因木瓜 三种“分子工具” “分子手术刀” “分子缝合针” “分子运输车” 切割DNA分子 连接DNA片段 将基因导入 受体细胞的载体 基因工程的基本过程：剪切→拼接→导入→表达 1. 限制性内切核酸酶——“分子手术刀”，限制酶 ① 来源： 主要是原核生物，可人工合成 T A C G G C A T G C G C A T 5´ 3´ 5´ 3´ ④ 特点： ② 化学本质： 蛋白质 ③ 种类： 数千种 （限制酶不是一种酶，而是一类酶） 重组DNA技术的基本工具 能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列， 并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 P71旁栏思考：根据你所掌握的知识推测：限制酶存在于原核生物中的作用是什么？ 提示：主要起到切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的。 追问：为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 提示：含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ G 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ A 磷酸二酯键 T G C C G T A A 5' 3' 5' 3' 限制酶 一条链上相邻的两个核苷酸的磷酸基团与脱氧核糖之间。 限制酶 ⑤限制酶的识别序列 大多数限制酶的识别序列由 组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 思考·讨论： 中轴线 限制酶所识别的序列，呈现碱基互补对称。无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的，称为回文序列。 想一想限制酶所识别的序列有什么特点？ 6个核苷酸 EcoR I 限制酶 Sma I 限制酶 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 黏性末端 平末端 (识别GAATTC序列， 并在G与A之间切割) (识别CCCGGG序列 并在C与G之间切割) 思考：限制酶 EcoRⅠ和SmaⅠ识别的序列，以及切割的位点分别是？ 黏性末端 产生黏性末端或平末端 ⑥ 切割结果 DNA两条单链的切口处，伸出几个核苷酸，刚好能互补配对，这样的切口叫黏性末端。 切口处是平整的，这样的切口叫平末端。 *EcoRⅠ识别序列为GAATTC *EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键 *形成的黏性末端（从5’往3’读）为__________ *一个限制酶切割一次形成_______个黏性末端 *同一种限制酶切割形成的黏性末端_________ *两个黏性末端有__________个游离的磷酸基团。 AATT- 两 相同 2 EcoR Ⅰ （1）请用剪刀模拟EcoRI的识别序列和切割位点，将目的基因(Bt基因) 切割下来。 探究‧ 活动一、用剪刀模拟EcoRI 剪切目的基因(Bt基因)操作 5’...G 3’...CTTAA AATTC...3’ G...5’ 黏性末端 黏性末端 目的基因 (2)为获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？ 要切2个切口，断4个磷酸二酯键，产生4个黏性(平)末端。 黏性末端 黏性末端 (3)如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？ 会产生相同的黏性(平)末端 BamH Ⅰ________ Eco RⅠ________ Hind Ⅲ________ Bgl Ⅱ ________ GATC- AATT- AGCT- GATC- 练习1 .写出下列限制酶切割形成的黏性末端 不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端。 2. 请判断：以下黏性末端是由 种限制酶作用产生的。 3 注意观察识别序列和切割位点 ①找到切割位点 ②补全序列 阅读下面有关基因工程诞生过程的资料。 15 3. 基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，已知BamHⅠ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，Sau3AⅠ的识别序列和切点是—↓GATC— 酶切结果：BamHⅠ， 。Sau3AⅠ， 。 形成一个切口 形成两个DNA片段 使用 （限制酶）提取目的基因 Sau3AⅠ 注意： （1）DNA分子为链状。若限制酶切割后电泳出现两条电泳条带，则说明该DNA分子中含有一个限制酶的酶切位点；同理若限制酶切割后电泳出现三条电泳条带，则说明该DNA分子中含有两个限制酶的酶切位点，以此类推。 （2）DNA分子为环状。若限制酶切割后电泳出现一条电泳条带，则说明该DNA分子中含有一个限制酶的酶切位点；若限制酶切割后电泳出现两条电泳条带，则说明该DNA分子中含有两个限制酶的酶切位点，以此类推。 4.一种双链 DNA 分子被两种不同的限制酶进行三种切割,切割产物通过电泳分离,用大小已知的DNA片段的电泳结果作为相对分子质量大小标记(下图左边一列)。关于该双链 DNA,下列说法错误的是（ ） A. 呈环状结构 B. 分子质量大小为10kb C. 有一个NotⅠ和两个EcoRⅠ切点 D. 其NotⅠ切点与EcoRⅠ切点的最短距离为2kb D 标样　 请标出限制酶的切割位点　 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵。限制酶就是细菌的一种防御性工具，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 18 资料卡 P72 限制酶是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了三个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。限制酶的命名是根据细菌种类而定，以EcoRI为例: E：Escherichia （属名） co：coli （种加词） R：RY13 （品系） I：首先发现 在此类细菌中发现的顺序 EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶； SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。 练习：流感嗜血杆菌的d菌株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为： 。 HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵。限制酶就是细菌的一种防御性工具，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 19 如何将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 ? G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G 2. DNA连接酶——“分子缝合针” 重组DNA技术的基本工具 ①作用 ②种类 将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 大肠杆菌Ecoli DNA连接酶和T4 DNA连接酶均能恢复磷酸二酯键 黏性末端 平末端（Ecoli DNA连接酶效率低的多） ③作用部位 注意: 具有互补的黏性末端才能被DNA连接酶“缝合”起来! 旁栏思考（P72）：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ DNA聚合酶 相同点： 不同点： 都是催化磷酸二酯键形成的酶。 DNA聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板； DNA连接酶连接的是DNA片段，不需要模板。 ④几种相关酶的比较 名称 作用部位 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA(水解)酶 解旋酶 磷酸二酯键 碱基对之间的氢键 将DNA切成两个片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 将双链DNA分子局部解旋为单链 练. 以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是（ ） A.以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的 B.②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的 C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子 D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键 D ①④是由同一种限制酶切割而成的 C G DNA连接酶 如何将外源基因运入细胞呢？ 质粒、噬菌体、动植物病毒等 P73 来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 ①作用 ②种类 重组DNA技术的基本工具 合作探究：分析归纳载体需要具备的条件： 条件①：具有一个或多个限制酶切割位点； 条件②：能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制； 条件③：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 条件④：对受体细胞无害。 问题3：我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？ 问题2：要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？ 问题1：载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？ 供外源基因插入其中 使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量 如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等 有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。 不能被酶切破坏 能复制，并带着插入的目的基因一起复制 是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我 能力的环状双链DNA分子。 有切割位点 最常用的载体 —质粒： 复制 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过 改造的。 人工 30 标记基因的筛选原理： 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。（据图请尝试描述筛选的过程） 关键点拨 培养基中有几种类型的 大肠杆菌？ 什么样的大肠杆菌能够 在该培养基上存活并繁殖？ 质粒 人的DNA分子 用EcoRⅠ限制酶切割 用EcoRⅠ限制酶切割 用DNA连接酶缝合 计划让大肠杆菌表达人的胰岛素，请简单描述 胰岛素基因与质粒形成重组DNA分子的过程？ 请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI 的识别序列和切割位点。 然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。 …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… …TCCTAG …AGGATCTTAA GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG AATTCCATAC… GGTATG… GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG 探究‧ 活动二、P73思考讨论 重组DNA分子的模拟操作 1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？ 剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。 如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。 不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。 2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？ 3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？ …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG 4. DNA片段反向连接能成功吗？还有什么可能？ 【思考1】下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？ 选择BamH I 和 Hind III ① 防止目的基因、载体的自身环化 不能用E.coRI 的原因? ② 防止目的基因与载体反向连接 图1 图2 限制酶能切下目的基因且不破坏目的基因 至少保留一个完整的标记基因，便于筛选 SmaI? 变式1.图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。 （1）在基因工程的操作中，不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏__________ 和__________________________。 （2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，___________________________________________________。 目的基因 质粒上的抗生素抗性基因 目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中 （3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成______________________连接的环状产物以及_____________________连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是____________，后者可能会导致目的基因无法正常表达。 目的基因与目的基因 质粒片段与质粒片段 反向连接 变式2.某实验小组利用下图所示质粒和目的基因来构建基因表达载体,将目的基因导入大肠杆菌细胞并表达。下列叙述正确的是( ) A. 图中的质粒用酶A切割后,会产生8个游离的磷酸基团 B. 在构建重组质粒时,可用酶A和酶C切割质粒和目的基因 C. 成功导入目的基因的大肠杆菌可在含四环素的培养基中生长 D. 若用酶B和酶C切割,可以避免质粒的自身环化 D 选用哪种限制酶进行切割？ ①根据目的基因两端的限制酶切割位点确定； ②双酶切法：为避免目的基因和质粒的自身环化及目的基因与质粒的反向连接，可使用两种限制酶切割。 限制酶每切割一次，产生两个游离的磷酸基团 2.下列关于基因运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由均正确的是（ ） A.能够复制，以便目的基因插入其中 B.具有多个限制酶切割位点，便于目的基因的表达 C.具有某些标记基因，便于重组DNA分子的筛选 D.对受体细胞无害，便于重组DNA分子的筛选 C 3.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是（ ） 插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况 ① 能生长 能生长 ② 能生长 不能生长 ③ 不能生长 能生长 A.①是c；②是b；③是a B.①是a和b；②是a；③是b C.①是a和b；②是b；③是a D.①是c；②是a；③是b A 1.若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是？ 噬菌体 噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕 病毒对宿主细胞的侵染具有一定的物种（组织）特异性。 2．根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理？请解释。 合理，因为仅导入载体的和导入插入了目的基因的载体的受体细胞均能在该培养基中存活。 探究‧ 活动三、分析载体的种类和载体需具备的条件 限制酶 作用部位： 种类 E.coli DNA连接酶 运载 工具 条件 ③ 有一个至多个限制酶切割位点 质粒、噬菌体、动植物病毒 DNA连 接酶 作用部位： 切开DNA分子的磷酸二酯键 来源： 主要存在于原核生物中 特点： 具有专一性（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列） T4 DNA连接酶 ① 对受体细胞无害 ② 能自我复制或整合到宿主DNA上。 ④ 常有特殊的标记基因 种类： 磷酸二酯键 作用结果： 产生黏性末端或平末端 课堂小结 探究•实践 DNA的粗提取与鉴定 1.实验原理 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异， 可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。 DNA不溶于酒精溶液 但某些蛋白质溶于酒精 DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液 在一定温度下（沸水浴），DNA被二苯胺试剂染成蓝色 初步分离DNA和蛋白质 溶解DNA 鉴定DNA P 74页 0 0.14 NaCI浓度（mol/L） DNA溶解度 43 DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。 1.选材： 2. 材料用具 （1）选什么样的材料实验更易成功？ （2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？ 猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核和线粒体，几乎不含DNA，不适合； 鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。 含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。 鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。 析出DNA DNA的鉴定 研磨 称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。 过滤取上清液 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。 方案一：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，一个方向轻缓搅拌，白色丝状物。 方案二：或者离心，要沉淀物 取两支试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混匀后，沸水中加热5min。 3. 实验步骤 破坏细胞壁等， 释放DNA。 鸡血细胞呢？ 无需研磨， 直接加入清水，细胞吸水涨破 滤纸会大量吸附DNA 低温抑制DNA水解酶活性，防止DNA水解 95%酒精：析出DNA 不白：杂质：核蛋白，多糖等 实验组 水浴加热5min，冷却后 对照组 蓝色 小结： ①研磨液 ②体积分数为95%的酒精 ③2mol/L 的NaCl溶液 ④二苯胺试剂 ⑤蒸馏水 ——溶解并提取DNA ——析出DNA ——溶解DNA ——鉴定DNA，要现配现用 研磨液、二苯胺的配制方法 见课本P117 ——定容研磨液 1.取一段长约2cm的去皮香蕉，剪碎置于玻璃杯中； 2.加入10mL温水，2g食盐，5滴洗洁精，充分研磨； 3.用双层纱布过滤研磨液，收集滤液； 4.向滤液中加入2g嫩肉粉，混合均匀； 5.将滤液置于55-60℃的水浴中加热5-10min； 6.冷却，加入等体积、冷却的高度酒； 7.静置2-3min，用玻璃棒（或筷子）挑取白色絮状析出物。 参考方案 “家庭版”DNA的粗提取 1.下列有关基因工程中载体的说法，正确的是 ( ) A.在基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒 B.作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和筛选的标记基因 C.携带目的基因的重组质粒只有整合到受体细胞的DNA上才会复制 D.质粒是真核细胞细胞核或原核细胞拟核中的具有自我复制能力的环状双链DNA分子 D 2.某研究所的研究人员拟将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌的细胞内，已知质粒中存在两个抗性基因：A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，目的基因要插入基因B中，且大肠杆菌本身不带有任何抗性基因。下列叙述正确的是( ) A.导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒 B.抗生素抗性基因是目的基因表达的必要条件 C.成功导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基上生长 D.能在含链霉素的培养基中生长的大肠杆菌不一定符合生产要求 D 3、 限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是-C↓AATTG-和-G↓AATTC-．如图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是（ ） A 4. 用限制酶 EcoRV单独切割某普通质粒，可产生14kb（1kb即1000个碱基对）的长链，而同时用限制酶EcoRV、MboⅠ联合切割该质粒，可得到三种长度的DNA 片段，如图5（其中*表示EcoRV限制酶切割后的一个黏性末端）。若用Mbo Ⅰ限制酶单独切割该普通质粒，则产生的DNA片段的长度为 A. 25和5.5 B. 25和6 C. 5.5和8 D. 6和8 D 总长度14，两个酶I切位点 5. 基因工程中，需使用特定的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制性核酸内切酶I的识别序列和切点是一G↓GATCC一，限制性核酸内切酶Ⅱ的识别序列和切点是一↓GATC一，根据图示判断下列叙述正确的是( ) A. 质粒用限制性内切核酸酶II切割,目的基因用限制性内切核酸酶I切割 B. 用限制性内切核酸酶切割获得目的基因时,有四个磷酸二酯键被水解 C. 限制性内切核酸酶I和限制性内切核酸酶II切割后获得的黏性末端不同 D. 质粒中标记基因的作用是便于筛选出目的基因已经表达的细胞 B 6、进行基因编辑是生物学研究的重要手段，下图是对某二倍体生物B基因进行定点编辑的过程，用sgRNA可指引限制性内切核酸酶Cas9结合到特定的切割位点。下列说法错误的是（　） A.基因定点编辑前，需要设计与片段Ⅱ两端碱基序列配对的sgRNA B.Cas9通过断裂脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键实现对片段Ⅱ切除 C.通过分析破坏B基因后的生物体功能变化，可推测B基因的功能 D.通过基因编辑技术改造后的B基因与编辑前的B基因不是等位基因 D 课本P74【概念检测】 1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ） A. 能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端 2. 在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ） A. 大肠杆菌的质粒 B. 切割DNA分子的酶 C. DNA片段的黏性末端 D. 用来识别特定基因的DNA探针 A C 【扩展应用】 1. 想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 教材P75 是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。 教材P75 【扩展应用】有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶切speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ, XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 (1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶speⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？ XbaⅠ。 因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。 (2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？ 识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。 例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。 限制酶 DNA连接酶 载体 ①对受体细胞无害； ②有一个至多个限制酶切割位点； ③有特殊的标记基因； ④能自我复制或能整合到宿主DNA上。 质粒、 噬菌体、动植物病毒 小结 基因工程的基本工具 作为载体的条件 种类: 磷酸二酯键 来源： 主要来源于原核生物 特点： 作用部位： 具有专一性 结果： 形成黏性末端或平末端 连接部位： 磷酸二酯键 种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶 作用： 把两条双链DNA片段拼接起来 Lavf55.48.100 Lavf58.20.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.3.79 $$