1.2微生物的培养技术及应用课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

1.2 微生物的培养技术及应用 经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，在经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是制作过程中有杂菌混入。 酸奶 从社会中来 这需要应用无菌技术和微生物的培养技术 提供合适的营养和环境条件 确保其它微生物无法混入 培养基 无菌技术 19世纪中期，法国酿酒业曾一度遭到毁灭性打击，生产的葡萄酒出现了变酸变味的怪事… 法国科学家巴斯德发现，导致生产失败的根源在于发酵物中混入了微生物。 一.微生物的基本培养技术 个体无法用肉眼观察的微小生物。微生物包括：细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、显微藻类等在内的一大类生物群体。 微生物： 新冠病毒 细菌 草履虫 酵母菌 一.微生物的基本培养技术 在固体平板培养基上，单个微生物细胞或孢子可生长繁殖成一个具有特定形状、肉眼可见的子细胞群体，称为菌落。 一.微生物的基本培养技术 （1）培养基 1.培养基的配制 一.微生物的基本培养技术 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质——培养基，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。 培养皿 培养基 （2）培养基的分类 液体培养基 固体培养基 ：不含凝固剂、呈液体状态的培养基。 ：含有凝固剂、呈固体状态的培养基。 加入凝固剂（琼脂） ①物理性质 液体培养基 固体培养基 1.培养基的配制 一.微生物的基本培养技术 分离、计数、鉴定等 扩大培养、用于工业生产 选择培养基 鉴别培养基 ：根据某种微生物的特殊营养要求配置。 ：加入能与目的菌的代谢产物发生显色 反应的指示剂。 ②功能 （2）培养基的分类 1.培养基的配制 一.微生物的基本培养技术 选择 分离 鉴定 （2）培养基的分类 1.培养基的配制 一.微生物的基本培养技术 例:1.加入青霉素的培养基：分离酵母菌、霉菌等真菌； 2.不加氮源的无氮培养基：分离固氮菌； 3.不加含碳有机物的无碳培养基：分离自养型微生物 例:1.加入伊红美蓝的培养基：鉴别大肠杆菌 2.加入刚果红的培养基：鉴别纤维素分解菌 选择培养基：将某种类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。 鉴别培养基：用于鉴别不同类型的微生物 选择培养基 鉴别培养基 ：根据某种微生物的特殊营养要求配置。 ：加入能与目的菌的代谢产物发生显色 反应的指示剂。 ②功能 天然培养基 合成培养基 ：含化学成分不明确的天然物质 ：用已知的化学物质配制 ③成分来源 （2）培养基的分类 1.培养基的配制 一.微生物的基本培养技术 工业生产 分类鉴定 （3）培养基的成分 1.培养基的配制 一.微生物的基本培养技术 营养要素 来源 功能 碳源 无机碳源 CO2、NaHCO3等含碳无机物 构成细胞物质和一些代谢产物； 有机碳既是碳源又是能源 有机碳源 糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油等 氮源 无机氮源 N2、NH3，氨盐、硝酸盐等 将无机氮合成含氮的代谢产物 有机氮源 牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等 合成蛋白质、核酸和含氮的代谢废物 生长因子 维生素、氨基酸、碱基 酶和核酸的组成成分； 参与代谢过程中的酶促反应 水 外界摄入 良好的溶剂； 维持生物大分子结构的稳定 无机盐 无机物 提供除碳、氮以外的各种重要元素 （有机碳源、氮源：异养微生物）、 （无机碳源、氮源：自养微生物） ①一般成分 3.培养基的营养构成 维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等 （牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有） 表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成 组分 含量 提供的主要营养 牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素等 蛋白胨 10g 氮源和维生素等 NaCl 5g 无机盐 H2O 定容至1000ml 水 （3）培养基的成分 1.培养基的配制 一.微生物的基本培养技术 ②特殊成分 牛肉膏是采用新鲜牛肉经过消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。 蛋白胨是一种外观呈淡黄色的粉剂。一般用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白（肉类）和植物蛋白（豆类）等两种。 在主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长的条件有：对pH、特殊营养物质以及O2的需求。 例如：培养乳酸杆菌需添加维生素； 培养霉菌需调至酸性； 培养细菌需调至中性或弱碱性； 培养厌氧微生物需提供无氧环境。 pH要适宜：为维持pH的相对恒定，可在培养基中加人缓冲剂，常用磷酸氢二钾或磷酸二氢钾。 微生物培养基是否都需要人工添加碳源或氮源？ 培养基不一定都含有碳源、氮源，如培养自养型微生物的培养基中不需加入碳源，分离自生固氮菌的培养基中，不需加入氮源。 1.培养基的配制 一.微生物的基本培养技术 【典例1】下列四种生物的能源、碳源、氮源和代谢类型的描述，正确的是( ) A.硝化细菌 B.乳酸菌 C.酵母菌 D.衣藻 硝化细菌 乳酸菌 酵母菌 衣藻 能源 氧化NH3 分解乳酸 固定N2 利用光能 碳源 CO2 糖类 糖类 CO2 氮源 NH3 N2 N2 NO3- 代谢类型 自养需氧型 异养需氧型 异样需氧型 自养需氧型 AD 1.培养基的配制 一.微生物的基本培养技术 【典例2】该表为某培养基的配方，下列叙述错误的是(　　) 成分 NaNO3 KH2PO4 MgSO4·7H2O 含量 3 g 1 g 0.5 g 成分 (CH2O) 蒸馏水 青霉素 含量 30 g 定容至1 000 mL 0.1万单位 A．根据物理性质划分，该培养基属于液体培养基 B．根据用途划分，该培养基属于选择培养基 C．根据培养基的配方可知，该培养基培养的微生物同化作用类型是异养型 D．固体培养基中加入少量水即可形成液体培养基 D 1.培养基的配制 一.微生物的基本培养技术 解析：固体培养基和液体培养基的区别在于是否加入凝固剂(如琼脂)，题表所示的培养基配方中没有琼脂，因此属于液体培养基，A项正确、D项错误；加入青霉素可分离得到酵母菌和霉菌等，因此该培养基属于选择培养基，B项正确；该培养基中的(CH2O)可作为有机碳源，因此其培养的微生物的同化作用类型是异养型，C项正确。 【典例3】下表是牛肉膏蛋白胨培养基的配方，分析回答： 材料 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 水 用量 5 g 10 g 5 g 20 g 定容至1 000 mL (1)根据培养基的物理性质，该培养基属于________培养基，理由是_____________________________________________________________。 (2)该培养基中主要提供碳源和氮源的物质分别是什么？属于有机物还是无机物？________________________________________________________。 (3)该培养基培养的微生物同化作用类型是_____________，理由是_________________________________________________________。 固体 该培养基的配方中含有凝固剂琼脂 牛肉膏主要提供碳源，蛋白胨主要提供氮源。二者均属于有机物 异养型微生物　 该微生物的碳源和氮源是有机物 1.培养基的配制 一.微生物的基本培养技术 （1）无菌技术的操作对象 ① 实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。 ② 培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 ③ 实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 ▲注意： 为了避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。 培养皿 接种环 培养基 2.无菌技术 一.微生物的基本培养技术 在微生物研究、医疗操作、食品生产中采取的防止其他微生物污染的技术，就是无菌技术。 （2）无菌技术的分类 2.无菌技术 一.微生物的基本培养技术 获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。 是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。 ①消毒 ②灭菌 是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染，无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开主要包括消毒和灭菌。 19 【芽孢】：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。 芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。 【孢子】：细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。 2.无菌技术 一.微生物的基本培养技术 孢子是脱离亲本后能直接或间接发育成新个体的生殖细胞。有时候可直接由营养细胞通过细胞壁加厚和积贮养料而形成，能抵抗不良环境条件。 一.微生物的基本培养技术 又称内生孢子，是细菌休眠体。芽孢含水量极低，抗逆性强，能经受高温、紫外线，电离辐射以及多种化学物质灭杀等。恶劣环境下，一个细菌产生一个芽孢，条件适宜时重新成为一个细菌。 芽孢： 一.微生物的基本培养技术 接种室、接种箱或超净工作台可用紫外线照射30min 100℃煮沸5-6 min 62-65℃下煮30 min或80-90℃处理30s-1min ①常用的消毒方法 用70%酒精擦拭双手；氯气消毒水源等 煮沸消毒 巴氏消毒 化学药剂消毒 紫外线消毒 2.无菌技术 一.微生物的基本培养技术 高压蒸汽灭菌效果最好 常用于接种工具 ②常用的灭菌方法 常用于玻璃器皿和金属器具 湿热灭菌 灼烧灭菌 干热灭菌 2.无菌技术 一.微生物的基本培养技术 小结： 2.无菌技术 一.微生物的基本培养技术 3.微生物的纯培养 在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物 由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物 获得纯培养物的过程就是纯培养 纯培养步骤： 包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。 一.微生物的基本培养技术 微生物群 分散或稀释 单个细胞 单个菌落 繁殖 获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染，无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开主要包括消毒和灭菌。 26 (1)原理 采用平板划线法和稀释涂布平板法，能将单个微生物分散在固体培养基上之后，经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖而形成的菌落。 3.微生物的纯培养 一.微生物的基本培养技术 (2)步骤 A.配制培养基 ①制备培养基 【酵母菌的纯培养】 马铃薯琼脂培养基 3.微生物的纯培养 一.微生物的基本培养技术 (2)步骤 A.配制培养基 ①制备培养基 【酵母菌的纯培养】 马铃薯琼脂培养基 B.灭菌 放入干热灭菌箱内，160 ~ 170℃灭菌2h 压力100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15 ~ 30min 3.微生物的纯培养 一.微生物的基本培养技术 (2)步骤 A.配制培养基 ①制备培养基 【酵母菌的纯培养】 B.灭菌 C.倒平板 待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 将瓶口迅速通过火焰 稍大于瓶口的缝隙 倒转过来放置 ▲防止冷凝水滴落在培养基上引发污染 3.微生物的纯培养 一.微生物的基本培养技术 (2)步骤 【酵母菌的纯培养】 ②接种和分离酵母菌 通过接种环在固体培养基（平板）表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经数次划线后培养，可以分离得到由单个微生物繁殖而形成的单菌落。 3.微生物的纯培养 一.微生物的基本培养技术 (2)步骤 【酵母菌的纯培养】 ②接种和分离酵母菌 ▲注意： ①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次； ②划线首尾不能相接； ③每次划线前接种环进行灭菌； ④划线后,培养皿倒置培养。 第1区划线 接种环灭菌 第2区划线 接种环灭菌 第3区划线 接种环灭菌 接种环灭菌 3.微生物的纯培养 一.微生物的基本培养技术 (2)步骤 【酵母菌的纯培养】 ③培养酵母菌 完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右 (培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异) 的恒温培养箱中培养24 ~ 48h。 【典例4】(2019汇编)下列关于培养基的叙述，正确的是（ ） A.在配制培养基时，除满足营养需求外，还应考虑pH、O2及特殊营养物质的需求 B.碳源和氮源必须具有一定比例，碳元素的含量最多，其次为氮元素 C.可利用液体培养基上菌落的特征来判断和鉴别细菌的类型 D.每种微生物在培养时，培养基中都需要有水、碳源、氮源、无机盐 E.感染杂菌的培养基和使用过的培养基都必须经灭菌处理后才能丢弃 F.配制培养基时，溶化后分装前，必须要进行的是调整pH和灭菌 G.微生物平板培养需倒置平板，目的是防止冷凝水珠污染培养基 H.倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上 AEFG 一.微生物的基本培养技术 【典例5】（2018全国Ⅱ）在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题： （1）在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具_____（填“可以”或“不可以”）放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。 （2）牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法。与煮沸消毒法相比，两种方法的优点是_____________________________________________。 在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少 （4）水厂供应的自来水通常是经过_____（填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”）消毒的。 可以 （3）密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能 ___________在照射前，适量喷洒_______，可强化消毒效果 。 破坏DNA 消毒液 氯气 （5）某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是_____________________________。 未将锅内冷空气排尽 一.微生物的基本培养技术 有一段时间，水果“酵素”风靡各地。水果“酵素”制作的大致过程是：将洗净、切成块状的水果放入洁净的容器，再加入糖和水,密封，置于阴凉处发酵一至两周。有人说，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。请评估这一论点是否可信。追问以下问题可以帮助你分析。 “酵素”是什么？水果“酵素”的制作原理是什么？水果“酵素”中可能含有哪些成分？它是否含有人们无法从其他食品中获取但又是维护健康所必需的成分？水果“酵素”中的所有成分都有益于人体健康吗？ 如果要更加有力地支持或反驳水果“酵素”有益健康的论点，应该怎样获取证据？ 评估论点的可信程度 一.微生物的基本培养技术 评估论点的可信程度 所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。 这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括-些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果酵素可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。 一.微生物的基本培养技术 一、1.×√× 练习与应用（P14） 2.日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。干制可以降低食品的水分含量；腌制可以通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温则是通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。 二、（1）培养皿和培养基。（2）接种。（3）通过实验结果可以看到，洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。 2.（1）培养液中02含量不同 （2）培养液中02含量越高,酵母菌种群密度越大。 （3）这时候已经达到了环境容纳量 培养基的类型 培养基的营养物质 消毒 灭菌 微生物的实验室培养 【课堂小结】 培养基 无菌技术 按物理性质划分 按组成成分划分 按功能划分 基本成分：碳源、氮源、水、无机盐 特殊需求：维生素（如乳酸杆菌）、碱基等 煮沸消毒 巴氏消毒 紫外线消毒 化学药剂消毒 湿热灭菌 干热灭菌 灼烧灭菌 从社会中来 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶 聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。 1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。 美国黄石公园 那么，如何从众多的微生物中筛选出单一菌种？ 筛选原因： 水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。 （1）自然界中微生物的筛选 筛选原则：根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 耐寒微生物 耐热微生物 石油分解菌 二、微生物的选择培养和计数 1.选择培养基 （2）实验室中微生物的筛选 人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、和pH），同时抑制或阻止其他微生物的生长。 选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 加入青霉素的培养基 不加氮源的无氮培养基 不加含碳有机物的无碳培养基 分离自养型微生物 分离固氮菌 分离酵母菌、霉菌等真菌 分离金黄色葡萄球菌 分离能消除石油污染的微生物 加高浓度食盐 石油是唯一碳源 1.选择培养基 二、微生物的选择培养和计数 影印法转移加氨苄青霉素的培养基中培养 具有氨苄青霉素抗性的菌落 完全培养基培养 没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰 怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌? （2）实验室中微生物的筛选 1.选择培养基 二、微生物的选择培养和计数 尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。 1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 设计一种选择培养基,用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来 选择培养基配方的设计 （2）实验室中微生物的筛选 1.选择培养基 二、微生物的选择培养和计数 2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。 （2）实验室中微生物的筛选 1.选择培养基 选择培养基配方的设计 尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。 二、微生物的选择培养和计数 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000ml KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 培养基一 培养基二 1.选择培养基 讨论1：从物理性质看两种培养基属于哪类？依据是什么？培养基的主要用途是什么？ 都属于固体培养基。依据是添加了凝固剂琼脂，且比例为1.5%-2%。培养基的主要用途是分离、鉴定、计数。 （2）实验室中微生物的筛选 选择培养基配方的设计 二、微生物的选择培养和计数 讨论2：从用途上来讲，哪个属于选择培养基？将得到何种细菌？ 培养基二属于选择培养基； 其可获得能分解尿素的微生物。 1.选择培养基 （2）实验室中微生物的筛选 选择培养基配方的设计 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000ml KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 培养基一 培养基二 二、微生物的选择培养和计数 KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 讨论3：两种培养基中共有哪些成分？哪些作为碳源、氮源？ 共有成分： 碳源、氮源、无机盐、水 培养基一的碳源为_______，氮源为_______； 培养基二的碳源为_______，氮源为_______； 牛肉膏 蛋白胨 葡萄糖 尿素 1.选择培养基 （2）实验室中微生物的筛选 选择培养基配方的设计 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000ml 培养基一 培养基二 二、微生物的选择培养和计数 2.微生物的选择培养 （1）选择培养基的作用 分离并计数某种微生物的数量（例如，能分解尿素的细菌）。 稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 （2）微生物选择培养获取纯培养物的方法 二、微生物的选择培养和计数 1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？ 分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物 计数：测定分解尿素的细菌的数量 注意：稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 包括系列稀释（梯度稀释）和涂布平板两个步骤 2.微生物的选择培养 方法：稀释涂布平板法 二、微生物的选择培养和计数 梯度稀释 方法：稀释涂布平板法 2.微生物的选择培养 ①铲取土样，将样品装入纸袋中 ②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 1mL 1ⅹ10 90mL无菌水 1ⅹ107 1ⅹ106 1ⅹ103 1ⅹ102 1ⅹ104 1mL 1mL 1mL 1mL 9mL无菌水 1mL 1ⅹ105 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌 二、微生物的选择培养和计数 稀释倍数 ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 注意：各梯度分别涂布3个平板（重复实验）1个不涂布作空白对照。 注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。 涂布平板 方法：稀释涂布平板法 2.微生物的选择培养 1ⅹ107 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 二、微生物的选择培养和计数 恒温培养箱 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 细菌一般稀释倍104、105、106 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。 菌落培养 方法：稀释涂布平板法 2.微生物的选择培养 二、微生物的选择培养和计数 3.微生物的数量测定 稀释涂布平板法 显微镜直接计数法 间接计数法 直接计数法 原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 二、微生物的选择培养和计数 选择30-300个菌落的平板进行计数； 每个稀释度至少取3个平板取其平均值； 统计的菌落往往比活菌的实际数目低； 统计的结果一般用菌落数而不是活菌数； 计数原则: 当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 3.微生物的数量测定 稀释涂布平板法 二、微生物的选择培养和计数 如何从平板上的菌落数推测出每克（每ml）样品中的菌落数？ 统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按公式进行计算。 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数， V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)， M代表稀释倍数。 稀释涂布平板法 3.微生物的数量测定 二、微生物的选择培养和计数 【典例】两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释 倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。 二、微生物的选择培养和计数 【典例】某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的细菌数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）。（ ） A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4 B 每克样品中含菌数 = × 稀释倍数 某一稀释度下平板上平均菌落数 c 涂布平板时所取稀释液的体积 V （每毫升原液含菌数） 二、微生物的选择培养和计数 酵母菌是属于真核生物，可以用血细胞计数板对其进行种群数量的计数。 血细胞计数板只适用于真核细胞的计数。 要对细菌（原核细胞）进行计数则需要细菌计数板。 血细胞计数板和细菌计数板有没有区别？ 血细胞计数板和细菌计数板 原理： 二、微生物的选择培养和计数 3.微生物的数量测定 显微镜直接计数法 它们的区别就是计数室的高度不同， 细菌计数板计数室的高度是0.02 mm。 故细菌计数板计数细菌的计算是： 细菌细胞个数/mL= 每个小方格平均细胞数×400 2×10-5 ×稀释倍数 0.02mm3=0.02×10-3cm3=2×10-5mL 血细胞计数板和细菌计数板 二、微生物的选择培养和计数 3.微生物的数量测定 显微镜直接计数法 三、探究 • 实践 ： 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 1.提出问题 土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？ 每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？ 利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以分离。 自变量：________________________ 因变量：__________________________ 无关变量：______________________________ 是否以尿素为唯一氮源 能分解尿素细菌的生长情况 培养时间、培养基的pH、温度等 2.做出假设 3.实验设计 土壤 取样 制备 培养基 样品稀释 与取样涂布 微生物的 培养与观察 （1）实验目的 ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。 （2）实验原理 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分离尿素的细菌。 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 4.进行实验 三、探究 • 实践 ： 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 （3）实验步骤 ①提供无机盐； ②调节pH。 ①培养基的制备 制备选择培养基（尿素为唯一氮源） 制备牛肉膏蛋白胨培养基 对照作用， 证明选择培养基是否具有选择性 思考1：为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？ 4.进行实验 三、探究 • 实践 ： 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 ②土壤取样 A 取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。 B 取样过程：铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。 （3）实验步骤 4.进行实验 三、探究 • 实践 ： 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 测细菌数：一般用104、105、106稀释液。 测放线菌：一般用103、104、105稀释液。 测真菌数：一般用102、103、104稀释液。 ③样品的稀释与涂布平板 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。 （3）实验步骤 4.进行实验 三、探究 • 实践 ： 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 组别 具体组别 具体操作 作用 实验组 实验组1 涂布接种的选择培养基 三次重复排除偶然因素对实验结果的影响，用以分离并计数能分解尿素的细菌。 实验组2 涂布接种的选择培养基 实验组3 涂布接种的选择培养基 实验组4 涂布接种的牛肉膏蛋白胨培养基 实验组4与实验组1 、2、3组对比用以验证选择培养基是否具有选择作用。 对照组 对照组1 不涂布接种的选择培养基 对照组1与实验组1 、2、3组对比用以验证选择培养基中是否含有杂菌。 对照组2 不涂布接种的牛肉膏蛋白胨培养基 对照组2与实验组4 对比用以验证牛肉膏蛋白胨培养基中是否含有杂菌。 实验结果 实验组1、2、3分离得到尿素分解菌的单菌落； 第4组得到多种菌落； 第5、6组正常情况下无菌落。 注意：本实验实验组和对照组设计如下： （3）实验步骤 4.进行实验 三、探究 • 实践 ： 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）；整个实验还要设置2个平板：不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。 ③样品的稀释与涂布平板 （3）实验步骤 4.进行实验 三、探究 • 实践 ： 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。 观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 一般来说，在相同的培养条件 下，同种微生物表现出稳定的菌落 特征，如形状、大小和颜色等。 ④微生物的培养与观察 A B C （3）实验步骤 4.进行实验 三、探究 • 实践 ： 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 对土壤中分解尿素的细菌分离和计数 ⑤结果分析与评价 A 说出下列各组培养基目的 ▶1、2、3组接种的选择培养基： ▶4组接种的牛肉膏蛋白胨培养基： 判断选择培养基是否具有选择作用。 （3）实验步骤 4.进行实验 三、探究 • 实践 ： 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 验证选择培养基中是否含有杂菌。 ⑤结果分析与评价 A 说出下列各组培养基目的 ▶不接种的选择培养基： ▶不接种的牛肉膏蛋白胨培养基： 验证牛肉膏蛋白胨培养基中是否含有杂菌。 （3）实验步骤 4.进行实验 三、探究 • 实践 ： 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 说出以下现象对应的结果分析。 现象 分析 未涂布培养基上无菌落生长 未涂布培养基上有菌落生长 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数 培养基未被杂菌污染 培养基被杂菌污染 选择培养基具有选择作用 ⑤结果分析与评价 B （3）实验步骤 4.进行实验 三、探究 • 实践 ： 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。 细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。 三、探究 • 实践 ： 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红： ①液体培养基可以直接看液体的变色情况； ②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红-美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现金属光泽的深紫色菌落，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。 到生活中去 测定饮水中大肠杆菌数量的方法： 一、√√√ D 练习与应用（P20） 二、1.提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。 2.（2）纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 （3）这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 平板划线法和稀释涂布平板法的比较 一.微生物的基本培养技术 平板划线法和稀释涂布平板法的比较 一.微生物的基本培养技术 一.微生物的基本培养技术 Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 $$