1.2微生物的培养技术及应用第2课时课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节 微生物的培养技术及应用（2） 李映珠 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶 思考·讨论 1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌( Thermus aquaticus)，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)。 实验室中微生物的筛选，也可以应用同样的原理，即人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等) ，同时抑制或阻止其他微生物的生长。 1.为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？ 这是因为水生栖热菌能在 70~80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。 2.如何从众多的微生物中筛选出单一菌种？ 实验室筛选微生物原理： 人为提供____________________的条件（包括_____、_____和_____等），同时_______________________________ 根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 有利于目的菌生长 抑制或阻止其他微生物的生长 营养 温度 pH 耐热微生物 耐寒微生物 石油分解菌 一、选择培养基 一、选择培养基 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 1.概念： 2.方法： 分离得到酵母菌、霉菌等 分离固氮菌 分离自养型微生物 不加含碳有机物的培养基 不加氮源的培养基 加入青霉素的培养基 （1）在培养基中加入某种化学物质。 分离得到金黄色葡萄球菌 加入高浓度食盐的培养基 （2）改变培养基中的营养成分。 （3）改变微生物的培养条件。 耐高温微生物 高温环境下培养 兼性厌氧型微生物 无氧环境下培养 一、选择培养基 培养基中加氨苄青霉素 具有抗氨苄青霉素能力的菌落 没有氨苄青霉素抗性的细菌 选择培养基 培养基+氨苄青霉素 培养基 没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰 怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌? 一、选择培养基 思考·讨论：培养基配方的设计 尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。 (细菌生长的氮源) 尿素 NH3 脲酶 尿素分解菌 一、选择培养基 1、你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？ 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 思考·讨论：培养基配方的设计 培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。 2、该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 该培养基与普通培养基相比较，共同点是都认有机碳（如葡萄糖）作为碳源，都有水和无机盐；不同点是该培养基以尿素作为唯一氮源，使只有能以尿素作为氮源的微生物生长。 一、选择培养基 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000ml 培养基一 KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 培养基二 2.从用途上来讲，培养基二属于 培养基，目的是为了获得 。 3.两种培养基共有的培养基成分有： 。 培养基一的碳源为 ，氮源为 ； 培养基二的碳源为 ，氮源为 。 1.从物理性质来讲，两者属于_____ 培养基，判断依据是______________________。 固体 添加了凝固剂琼脂 选择 能分解尿素的微生物 碳源、氮源、无机盐、水 牛肉膏 蛋白胨 葡萄糖 尿素 思考·讨论 一、选择培养基 4.是否能根据选择培养基和完全培养基上的菌落数目来证明选择培养基具有筛选作用？ 思考·讨论 完全培养基的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数 5.将土壤稀中能分解纤维素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 设计一种选择培养基，用纤维素作为唯一碳源，可以将分解纤维素的细菌分离出来 6.将土壤中能分解石油的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 设计一种选择培养基，用石油作为唯一碳源，可以将分解石油的细菌分离出来 一、选择培养基 情境问题：某研究小组想知道1g土壤样品中有多少能分解尿素的细菌，方法是？ 分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物 计数：测定分解尿素的细菌的数量 分离方法：稀释涂布平板法 二、微生物的选择培养 2、实验的具体操作： （2）土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。 先铲去表层土3cm左右，再取样， 将样品装入事先准备好的信封中。 取土样用的小铁铲和盛土样 的信封在使用前都要灭菌 （1）制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基 1、稀释涂布平板法 是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 二、微生物的选择培养 （3）样品的稀释 将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 9 mL 无菌水 90mL无菌水 二、微生物的选择培养 （4）涂布平板： 滴 灼 取少量稀释液（不超过0.1ml ），滴加到培养基表面 冷 涂 各梯度分别涂布3个平板，1个不涂布作空白对照 二、微生物的选择培养 二、微生物的选择培养 （5）培养与观察 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。 二、微生物的选择培养 培养条件： 观察： 一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 （5）培养与观察 防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。 每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。 三、微生物的数量测定 1.为什么通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中的活菌数？ 阅读教材P18，回答下列问题： 2.统计菌落数目时，选择菌落数范围为多少的平板？ 3.在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数求平均值的原因是什么？ 4.统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，原因是什么？ 在稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液 中的一个活菌。 30—300 重复实验，减少偶然误差，保证实验的准确性和精确性。 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 三、微生物的数量测定 方法一：活菌计数法（稀释涂布平板法） ①选 30-300个菌落的平板统计； ②每个稀释度取3个平板，取其平均值； 原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 在稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。 （1）原理： （2）统计原则： （3）结果: 三、微生物的数量测定 如何从平板上的菌落数推测出每克（每ml）样品中的菌落数？ 思考·讨论 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。 实例分析1：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？ （80+90+100）/3 0.1 × 105 =9 ×107个 三、微生物的数量测定 实例分析2：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ 乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 三、微生物的数量测定 方法二：显微镜直接计数法 不能区分死菌和活菌 血细胞计数板常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数 细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数； 这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 思考：统计的菌落数往往比活菌的实际数目多，原因是什么？ 三、微生物的数量测定 微生物的计数方法比较 内容 直接计数法 间接计数法 主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器 计数依据 菌株本身 培养基上菌落数 优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌 计算公式 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×1 0000×稀释倍数 每克样品中的菌株数:(C÷V)×M 　C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数 缺点 不能区分死菌与活菌 操作复杂，有一定误差，比如当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 结果 比实际值偏大 比实际值偏小 三、微生物的数量测定 进一步探究——鉴别培养基 资料：酚红指示剂是一种常用的酸碱指示剂，在PH为6.6—8.0时显示橙色，PH低于6.6显示黄色，PH高于8.4呈现红色。分解尿素的细菌能产生脲酶，脲酶将尿素分解成了氨，培养基PH升高，可使酚红指示剂变红。 结合所给资料，说出如何对分离的菌种进行鉴定？ 在以尿素为唯一氮源的选择培养基中加入酚红指示剂。 CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2 脲酶 呈碱性，遇酚红指示剂呈 色。 红 三、微生物的数量测定 测定饮水中大肠杆菌数量的方法 资料：是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红-美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。 课堂小结 微生物的数量测定 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 选择培养基 微生物的选择培养 科学实例 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数法 — 稀释涂布平板法 直接计数 —计数板计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 实验设计 （1）土壤取样 （2）样品的稀释 （3）稀释涂布平板法接种 （4）微生物的培养与观察 实验设计 平板划线法和稀释涂布平板法比较 方法 纯化原理 接种工具 单菌落的获得 用途 接种效果图 相同点 通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落 接种环 涂布器 从最后划线的区域挑取 稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落 分离纯化菌种， 获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落 ②用于计数 ①都能分离纯化菌种②都是在固体培养基上进行的 平板划线法 稀释涂布平板法 1、用稀释涂布平板法来统计样品中尿素分解菌的数目时，为了提高实验结果的可信度，往往要设置对照，对于对照组的要求可以不包括哪项( ) A.对照组培养基也严格灭菌，且不接触任何微生物 B.对照组和实验组培养基放在相同的条件下培养 C.所用培养基成分及pH完全与实验组一致 D.培养基的量的大小与实验组必须完全相同 练习∙反馈 D 2、某实验小组完成了“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验，下列关于实验的叙述正确的是( ) A.利用以尿素为唯一氮源的培养基培养土壤微生物，其上生长的均是能分解尿素的细菌 B.培养一段时间后，培养基中的营养成分会减少，有害成分积累，pH会升高 C.观察培养24h时的培养基，其菌落特征往往不稳定，最可能的原因是稀释倍数不当 D.用血细胞计数板在显微镜下观察计数，获得的个数就是该体积样品中活菌数与死菌数之和 练习∙反馈 B 3、 下列叙述中不正确的是( ) A.因为土壤中各类微生物的数量不同，所以，为获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离 B.测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同 C.牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显少于选择培养基上的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌种 D.如果得到了3个或3个以上菌落数目在30~300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数 练习∙反馈 C 4、 下列有关实验的操作中，错误的是(   ) ①加热消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢； ②接种操作要在酒精灯火焰附近进行； ③对于不耐高温的液体，如牛奶，用巴氏消毒法消毒； ④家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄都进行灭菌； ⑤培养基可采用高压蒸汽灭菌； ⑥加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌； ⑦接种环应采用火焰灼烧的方式灭菌 A.①③       B.②④       C.⑤⑦       D.④⑥ 练习∙反馈 D 练习∙反馈 练习∙反馈 （1）纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 （2）这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 谢谢 33 $$