专题5 第19讲 基因编辑、酵母双杂交和蛋白质工程 （课件）-【步步高】2024年新高考生物考前三个月（鲁湘辽吉）

专题五　生物技术与工程 第19讲 基因编辑、酵母双杂交和蛋白质工程 内容索引 基因编辑 酵母双杂交和蛋白质工程 预测演练 考点1 考点2 典例示范 考点1　基因编辑 1.(2022·苏州高三期末)单细胞生物并没有免疫系统，但是科学家发现细菌中存在清除入侵病毒DNA的功能系统，并发明了CRISPR/Cas9基因编辑技术。该系 统主要包含单链向导RNA和Cas9蛋白两个部分，能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。请回答下列问题： PART ONE (1)如图为CRISPR/Cas9系统作用示意图，该系统能精准识别相关基因的原理是单链向导RNA与目标DNA发生______________，Cas9蛋白可催化____________(化学键名称)水解，剪切特定DNA片段。 (2)CRISPR/Cas9系统广泛存在于原核生物中，细菌这种清除入侵病毒DNA的生理意义是_______________________________________________ _______。 碱基互补配对 磷酸二酯键 防止外源基因插入并表达，保证了细菌遗传性状的 稳定 (3)真核生物中没有编码Cas9蛋白的基因，若要对真核生物的基因进行编辑，要借助现代生物技术将CRISPR/Cas9基因导入相关细胞，此项技术的原理是____________。 基因重组 (4)水稻不育系的选育是杂交水稻育种工作中的关键环节，TMS5基因是控制水稻育性的关键基因。为了获得某水稻品种的不育系，研究人员对该水稻品种的TMS5基因进行编辑。 ①Cas9蛋白将TMS5基因剪切后，断裂后的DNA分子会自动进行修复，修复过程中断点处插入碱基A之后两个片段在____________酶作用下得到编辑成功的TMS5基因，此过程导致的变异属于____________。 DNA连接 基因突变 ②在编辑成功的TMS5基因上游连接启动子后组装形成基因表达载体。再通过农杆菌侵染水稻愈伤组织，并整合到水稻细胞的____________上，愈伤组织再经过________过程形成水稻幼苗。 ③基因编辑中插入碱基A，会导致翻译提前终止，使TMS5基因表达的蛋白质不能产生，最终导致水稻花粉不育。用抗原—抗体杂交技术检测TMS5基因编辑是否成功，若________(填“出现”或“未出现”)杂交带，则表明基因编辑成功。 染色体DNA 再分化 未出现 (5)华人科学家张锋是首个将CRISPR基因编辑技术应用于哺乳动物和人类细胞的科学家，为此项技术广泛应用于生命科学和医学领域作出了不可磨灭的贡献。但是更多的学者提出了CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”，实验发现RNA的序列长短影响成功率，越短脱靶率越____。试分析脱靶最可能的原因是_____________________ _______________________________________________________。 其他DNA序列也含有与向导RNA互补配对的序列，造成向导RNA错误结合而脱靶 高 1.基因编辑的含义 对基因进行定点修改，以改变目的基因的序列和功能，进行基因治疗和物种改良。 2.应用最广泛的技术：CRISPR/Cas9基因编辑技术。 应用提炼 3.CRISPR/Cas9的组分及功能 短链RNA (sgRNA、向导RNA) 作为“向导”，部分序列通过碱基互补配对，与目的基因中希望被编辑的DNA序列结合 细菌的核酸酶Cas9 与短链RNA结合，切割与向导RNA结合的DNA，使DNA双链断裂 4.CRISPR/Cas9技术的主要应用 (1)基因敲除。(2)特异突变引入。(3)定点转基因。 5.CRISPR/Cas9技术的风险 (1)基因编辑技术本身存在着识别准确性等方面的问题。 (2)对人类基因进行“改造”时要严格遵守法律法规，不能违反人类的伦理道德。 1.CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，科研人员对其进行了一系列改造。 对点精练 (1)Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体(如图1)。复合体中的________与目的基因特异性结合，__________切割目的基因造成双链断裂，细胞在修复断裂的DNA时会随机插入、删除或替换部分碱基，从而引发___________。 sgRNA Cas9蛋白 基因突变 sgRNA可通过碱基互补配对与目的基因特异性结合，进而特异性地识别目的基因；随机插入、删除或替换部分碱基将导致基因结构的改变，属于基因突变。 (2)将编码Cas9蛋白的基因改造后形成新基因dCas9，与Cas9蛋白相比，dCas9蛋白失去剪切活性，但与sgRNA结合等功能不变。构建能够表达dCas9蛋白的质粒A，设计一系列与红色荧光蛋白基因(RFP基因)上游不同部位结合的sgRNA序列(如图2)，并以此为依据构建能表达sgRNA的质粒B，将质粒A、B共同导入含有RFP基因的大肠杆菌，测定大肠杆菌红色荧光强度，实验结果如图3所示。 实验结果显示，对照组的红色荧光强度约为sgRNA 3组的_____倍。由实验结果可以得出：_______________________________________________ ___________________。 100 sgRNA结合部位距离转录起始点越近，抑制目的基因表达的作用越强 (3)VP64蛋白可结合RNA聚合酶，激活基因的转录，但VP64蛋白无法识别或结合特定的DNA片段。科研人员欲利用上述系统和VP64蛋白促进特定基因表达，请设计促进细胞中已存在的基因X表达的方案。 _______________________________________________________________________________________________________。 根据基因X的序列设计sgRNA，使其能识别X基因的RNA聚合酶识别序列，让VP64蛋白与该sgRNA结合形成复合体 VP64蛋白可结合RNA聚合酶，激活基因的转录，但VP64蛋白无法识别或结合特定的DNA片段，而sgRNA具有识别作用，可根据基因X的序列设计sgRNA，使其能识别X基因的RNA聚合酶识别序列，让VP64蛋白与该sgRNA结合形成复合体。 可实现定点诱变、特异性抑制某些有害基因或致病基因的表达 (4)请写出CRISPR/Cas9及其改造产品在科学研究中的应用_____________ _____________________________________________。 2.(2023·娄底高三三模)CRISPR/Cas9基因编辑的主要作用机理是通过对靶基因的剪切和DNA自我修复来实现靶基因的定点突变。小鼠体内的BMAL1基因具有控制生物节律的功能，某科研小组采用 CRISPR/Cas9基因组编辑技术对小鼠受精卵中的BMAL1基因进行敲除。该过程用sgRNA指引Cas9蛋白剪切与sgRNA特异性结合的基因中的靶序列，操作原理如图所示。回答下列问题： (1)sgRNA特异性结合BMAL1基因中的靶序列时，sgRNA单链与BMAL1基因单链的碱基之间通过______相结合。Cas9蛋白能在BMAL1基因的特定位置进行切割，其作用的化学键为____________。 (2)科研人员构建CRISPR/Cas9重组表达载体，若已知BMAL1基因靶序列是5′－CCTTTCAGCTCATGGTATACAA－3′，根据该靶序列设计的sgRNA中的相应序列是5′－_________________________________－3′。构建CRISPR/Cas9重组表达载体时主要利用的工具酶有_______________ ________。 氢键 磷酸二酯键 UUGUAUACCAUGAGCUGAAAGG 限制酶和DNA 连接酶 (3)在对BMAL1基因进行编辑的过程中，若发生了对其他基因进行编辑的现象，最可能的原因是_____________________ ______________________，所以运用该技术时要注意防范风险，一是基因组编 辑技术本身存在识别准确性等方面的问题；二是对人类基因进行“改造”时要____________________________________________。 其他基因中也具有能与 sgRNA互补的碱基序列 严格遵守法律法规，不能违反人类的伦理道德 (4)与正常鼠相比，培育出的BMAL1基因敲除小鼠细胞中，由于该基因的转录和翻译过程无法正常进行，故该小鼠体内无_______________________________。 (5)基因组编辑技术可用于疾病治疗，请 从癌症的产生机理出发，运用该技术为癌症的治疗设计思路： _____________________________________________________________________________________________________________________________________。 相关的mRNA分子和蛋白质分子 利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将人体内变异的原癌基因或抑癌基因进行敲除，移入正常的原癌基因或抑癌基因，从而起到治疗癌症的作用 考点2　酵母双杂交和蛋白质工程 2.(2023·秦皇岛高三质检)甜柿鲜果肉中含丰富的可溶性糖、微量元素、维生素和β－胡萝卜素等多种成分，营养价值高，深受消费者喜爱。甜柿自然脱涩的涩味程度与乙醛代谢关键酶基因(PDC)的表达情况有关。为筛选PDC基因调控蛋白，科研人员利用质粒A和质粒G(如图甲、图乙所示)，进行了相关研究。 典例示范 PART TWO (1)启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的位点，同时启动子区域存在着许多调控蛋白的结合位点，RNA聚合酶和调控蛋白共同影响了基因的______水平。 转录 (2)PDC基因的启动子序列未知，为获得大量该基因启动子所在的片段，可利用限制酶将基因组DNA进行酶切，然后在____________的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游，根据___________________________设计引 DNA连接酶 接头片段和PDC基因编码序列 物进行PCR扩增，在扩增过程中使用的DNA聚合酶具有________的特点，在该酶的作用下可以将4种脱氧核苷酸加到引物的一端。 耐高温 (3)AD基因表达出的 AD蛋白与启动子足够靠近时，能够激活后续基因转录，据此可利用与AD蛋白形成的融合蛋白来筛选待测蛋白。利用质粒A构建含有PDC基因启动子片段的重组质粒并导入代谢缺陷型酵母菌，用不含_______的培养基可 尿嘧啶 筛选出成功转化的酵母菌Y1。将从甜柿中提取的总mRNA经逆转录合成不同片段的cDNA，然后分别插入质粒G中的_____(填序号1～5)位点以获得不同的重组质粒(G1、G2……)，理由是___________________________ ______________________________________。 2 插入位点需要在AD基因的启动子和终止子之间，且不能破坏AD基因 由：__________________________________________________________ ______________________________________________________________________________________________________________________。 待测蛋白与AD蛋白形成了融合蛋白，若待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，就能与PDC基因启动子结合，AD蛋白也能靠近PDC基因启动子并激活金担子素基因的表达，使酵母菌表现出金担子素抗性 (4)将携带不同 cDNA 片段的重组质粒 G1 、G2……分别导入酵母菌 Y1 中，然后分别置于含___________的培养基上培养。若能在培养基上生长，则该酵母菌含有的cDNA 所表达的蛋白质即为PDC基因调控蛋白。请结合图丙简述作出该推测的理 金担子素 (5)筛选出PDC基因的调控蛋白后，为满足生产上的需要对其进行改良，这种技术属于蛋白质工程，该工程是指以_____ ___________________________________作为基础，通过对______的修饰或合成，对现有蛋白质进行改造，或制造出一种 蛋白 质分子的结构规律及其与生物功能的关系 基因 新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，该工程的起点是________ ____________。 白质的功能 预期蛋 应用提炼 1.酵母双杂交原理 酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物转录调控过程的认识。真核生物中基因转录需要转录激活因子的参与，真核生物的转录激活因子含有两个不同的结构域：DNA结合结构域(DNA binding domain，DNA－BD)和DNA转录激活结构域(Activation domain，AD)，这两个结构域可以独立分开，功能互不影响。BD和AD分别单独作用并不能激活转录反应，只有当二者在空间上充分接近时，才呈现完整的转录激活因子活性，使下游基因得到转录。根据这一原理，可设计酵母双杂交系统。 将两待研究蛋白(蛋白X与蛋白Y)分别与BD、AD结构域构建融合质粒。将构建好的两个质粒转入同一酵母细胞中表达，如果两蛋白之间不存在相互作用，则下游基因(报告基因)不会转录表达；如果两个蛋白存 在相互作用，则BD与AD两结构域空间上很接近，从而下游基因(报告基因)得到转录。通过报告基因表达与否，即可判断两蛋白之间是否存在相互作用。原理如图所示。 2.蛋白质工程 3.(2023·南通高三调研)酵母双杂交技术是筛选能与已知蛋白互作的蛋白质的方法，其主要原理如图1。黄瓜花叶病毒(CMV)可侵染200多种植物，病毒的外壳蛋白(CMV CP)直接参与病毒的细胞间转移、症状表现等。研究人员利用酵母双杂交技术，从CMV感染的番茄叶片cDNA文库中筛选出CMV CP互作蛋白基因，图2为构建CMV CP诱饵载体(能表达出BD－CP融合蛋白)的流程。请据图回答下列问题： 对点精练 (1)图1中，获得BD－X蛋白的关键是将相应序列连接形成融合基因。X与Y的结合能使转录因子的BD和AD同时结合到启动子上，进而招募酶X催化LacZ基因的转录，酶X是________ ______。 RNA聚 合酶 (2)图2中，过程①提取总RNA时选择有明显感染症状叶片的原因是______ ________________________________________________________________。过程②中通常利用RT－PCR技术获得cDNA，上述技术中不同循环次数的 感染症状明显的叶片细胞中含有大量CMV病毒，有丰富的CMV CP基因 扩增产物电泳结果如图3，则最适宜的循环次数是____次，依据是_____ _________________________________________________________。 2号条带比1号条带宽，而3号条带较弥散(或2号条带最明亮、整齐) 18 (3)图2过程③构建诱饵载体时，为保证CP cDNA能定向插入到指定位置，需要在过程②设计PCR引物时，__________________________________ __________________。用获得的诱饵载体先转化大肠杆菌，再用______________法将菌液接种到含__________的选择培养基上，挑取阳性单菌落细胞进行测序，确认插入的基因序列正确。 在两种引物的5′端分别添加BamHⅠ和EcoRⅠ识别序列 稀释涂布平板 卡那霉素 由图2可知，CP基因插入到BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点间，所以引物设计需要在两种引物的5′端分别添加BamHⅠ和EcoRⅠ识别序列；接种菌液用稀释涂布平板法，载体上的标记基因是卡那霉素抗性基因，所以培养基中添加卡那霉素。 (4)获得CMV CP诱饵载体转化的酵母菌后，研究人员进一步开展CMV CP互作蛋白的筛选研究，其主要实验流程是：构建感染CMV的番茄cDNA文库→构建一系列靶蛋白载体→_____________ _______________________________→接种培养，获取呈____色的菌落细胞→筛选、鉴定互作蛋白。 分别将靶蛋白载体导入诱饵载体转化后的酵母菌 蓝 4.(2022·湖南，22)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题： (1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是___________________，物质b是________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是________________。 氨基酸序列(多肽链) mRNA 密码子的简并性 (2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有___________________________、_______________________________ ____________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是__________________。 从基因文库中获取目的基因 通过DNA合成仪用化学方法直接 人工合成 DNA半保留复制 (3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的______(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是_________________________________________________ ___________________________________________。 种类 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理所用的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏 将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大。水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定；经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降。 经酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，且差异明显。据此推测两种酶处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。 (4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路。 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ____________________________。 取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号3支试管中，静置相同时间，统计3支试管中血液凝固时间 1.(2023·盐城高三模拟)CRISPR/Cas9广泛存在于细菌等原核生物体内，而CRISPR/Cas9基因编辑技术是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。其 1 2 3 4 5 预测演练 原理是由一条单链向导RNA(sgRNA) 引导Cas9蛋白到一个特定的基因位点进行切割，通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割，如图所示。回答下列问题： PART THREE 1 2 3 4 5 (1)Cas9 蛋白借助向导 RNA 对目标 DNA分子进行精准定位，在使用 Cas9 蛋白对不同目标 DNA 进行编辑时，应使用 Cas9蛋白和_______(填“相同”或“不同”)的向导 RNA 进行基因编辑。将切下的基因片段与另一段 DNA进行拼接时，需要用到____________酶。 不同 DNA连接 1 2 3 4 5 在使用Cas9蛋白对不同目标DNA进行编辑时，由于向导RNA能识别并结合特定的DNA序列，所以应使用Cas9蛋白和不同向导RNA进行基因编辑。DNA连接酶可以连接DNA片段，因此将切下的基因片段与另一段DNA进行拼接时，需要用到DNA连接酶。 1 2 3 4 5 (2)若α链剪切点附近序列为—TCCACAATC—，则相应的识别序列为____________________，sgRNA 与目标DNA结合片段中最多含有____种核苷酸。 —UCCACAAUC— 8 1 2 3 4 5 若α链剪切点附近序列为—TCCACAATC—，则其互补链的碱基序列是—AGGTGTTAG—，由于RNA中无碱基T而有U，根据碱基互补配对可推知其相应的识别序列为—UCCACAAUC—；sgRNA 与目标DNA结合片段中最多含有8种核苷酸，分别是4种脱氧核苷酸和4种核糖核苷酸。 1 2 3 4 5 (3)CRISPR/Cas9基因组编辑技术存在一定的脱靶效应：正常情况下，sgRNA通过20个核苷酸长度的引导序列与目标DNA序列发生碱基互补配对，能够准确识别需要编辑的位点，然而有时会发生第18～20个碱基不匹配的情况，此时，Cas9蛋白可通过一个手指状的结构紧紧抓住错配区稳定住RNA－DNA双链，从而为Cas9蛋白切割DNA铺平道路，但这可能会导致Cas9蛋白在错误的基因位点切割双链DNA，从而引发潜在风险。请就如何降低脱靶效应，提出可能的思路：________________________ _________________________________________________________________________________________________________________。 设计Cas9酶，让其手指状结构远离DNA序列，从而在sgRNA和DNA错配时，不会用来稳定错配结构；设计出特异性较强的sgRNA，增强sgRNA的特异性 2.人体移植器官短缺是一个世界性难题。目前，科学家正试图利用基因工程方法对猪的器官进行改造，再结合克隆技术，培养出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。如图为科学家借助CRISPR/Cas9 基因编辑技术剔除猪抗原决定簇基因的示意图(不同的sgRNA可以识别不同的DNA序列)，请回答下列问题： 1 2 3 4 5 (1)DNA重组技术主要用到的工具酶包括DNA连接酶和___________________ __________，图中充当后者的物质是__________。 限制性内切核酸酶 (限制酶) Cas9蛋白 1 2 3 4 5 (2)Cas9－sgRNA复合体能够精准识别某核苷酸序列的原因可能是_________ _____________________________________________________。 sgRNA是单链，可与特定核苷酸序列即靶核苷酸序列碱基互补配对 (3)培育转基因猪时，应使用_________ 技术将剔除了猪抗原决定簇基因的基因 表达载体导入猪成纤维细胞中，再将该细胞的细胞核注入________的去核卵母细胞中，构建重构胚。 显微注射 MⅡ期 3.矮化育种能使水稻等作物品种具有抗倒伏和高产的优良特性，但同时会引起所育品种的氮肥利用率降低。研究发现，提高NGR5基因表达量既能保持矮化特征，又可以提高氮肥的利用率。为了进一步研究NGR5蛋白提高氮肥利用率的作用机制，研究人员利用酵母菌进行相关实验。回答下列问题： (1)酵母菌需要转录因子(一类蛋白质)才能开始转录过程，某种转录因子由BD(DNA 结合结构域)和 AD(转录激活结构域)两部分组成，在具备相应条件时，BD与AD会靠拢并结合，激活特定基因的转录。据此推测，BD能识别特定基因前段的__________并与之结合，但不能激活转录过程， 1 2 3 4 5 碱基序列 1 2 3 4 5 由题可知，BD是DNA结合结构域，可推测BD能识别特定基因前段的碱基序列并与之结合，但是不能激活转录过程，需要和AD结合才能激活转录过程。 (2)研究人员将NGR5基因连接到含有编码BD多肽基因的表达载体中，随后使用一定方法处理酵母菌细胞，并将该表达载体导入其中，使其能表达_____________________。 1 2 3 4 5 BD－NGR5 融合蛋白 将NGR5基因连接到编码BD多肽基因的表达载体中，导入细胞，使其进行转录和翻译，使其能表达BD—NGR5融合蛋白。 (3)提取水稻根部细胞的RNA，通过________合成不同片段的cDNA，随后分别连接到含有编码AD多肽基因的表达载体中，并导入上述酵母菌细胞中，使其能表达不同的AD—Xn融合蛋白(“Xn”表示不同cDNA片段表达的多肽)。 (4)若Xn能与NGR5蛋白相互作用，则AD—Xn融合蛋白和BD—NGR5融合蛋白就会被牵引靠拢，促使BD与AD结合，激活报告基因的表达。这能使酵母菌将培养基中的某特殊物质转化为蓝色，因此可选择______的菌落继续进行研究。 1 2 3 4 5 逆转录 变蓝 1 2 3 4 5 报告基因被激活后，酵母菌可以将培养基中的某特殊物质转化为蓝色，所以变蓝色的菌落为两种蛋白融合的菌落，可以继续研究。 (5)为寻找能与NGR5蛋白相互作用的蛋白质，研究人员最终完成的实验如表所示，设置3个对照组的目的是________________________________ ____________________________________________。 1 2 3 4 5 组别 表达的蛋白(多肽)1 表达的蛋白(多肽)2 对照组1 BD AD 对照组2 BD－NGR5 AD 对照组3 BD AD－Xn 实验组 BD－NGR5 AD－Xn 验证 BD 与 AD 之间、BD—NGR5 与 AD 之间、BD 与 AD—Xn 之间不会相互作用 1 2 3 4 5 由前面的题干可知，只有AD—Xn融合蛋白和BD—NGR5融合蛋白都存在时，才会相互作用，通过对照组1可以验证BD和AD蛋白不会相互作用，对照组2可以验证BD—NGR5 与 AD 之间不会相互作用，对照组3可以验证BD与 AD—Xn 之间不会相互作用。 4.(2023·保定高三期末)酵母菌细胞基因转录需要转录因子，转录因子包括 DNA 结合结构域(BD)和转录激活结构域(AD)，两结构域分开时不能激活转录。如果将待测蛋白质 X 与BD 融合，蛋白质Y 与AD 融合，蛋白质X 和 Y 有相互作用时，两结构域能重新呈现完整转录因子活性，并可激活报告基因的转录，过程如图 1 1 2 3 4 5 所示。已知报告基因LacZ表达的酶可以将无色化合物 X—gal 水解成蓝色产物。研究人员为了验证蛋白质X 和Y 是否具有相互作用，分别构建不同的酵母菌表达载体(如图 2 和图 3 所示)，其中AmpR为氨苄青霉素(抑制细菌细胞壁的形成)抗性基因，HIS 3和TRP I分别为控制组氨酸和色氨酸合成的基因。请回答下列问题： (1)研究小组采用了巢式 PCR 技术获取蛋白质X 和Y的基因编码序列，技术原理是利用两套PCR引物进行两轮 PCR扩增(如图 4所示)，首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在 DNA进行 15～30 个循环的扩增；第二轮扩增以第一轮扩增产物为 1 2 3 4 5 模板，利用第二对引物(内引物或巢式引物)进行 15～30 个循环扩增。相比于常规 PCR 获得的产物而言，巢式 PCR 获得的产物特异性____(填“强”或“弱”)，原因是_____________________________________________________ _________________________________________。 强 如果利用外引物扩增产生了错误片段，再利用内引物扩增在错误片段上进行引物配对并扩增的概率低 1 2 3 4 5 巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片段，第二对引物的功能是特异性地扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段。第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行 第二轮扩增，从而提高反应的特异性，获得的产物特异性更强，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。 1 2 3 4 5 (2)研究人员的主要技术路线如表所示，请完善表格： 实验目的 方法步骤要点(部分) 获取X 和Y 的基因编码序列 巢式PCR 扩增蛋白质Y 编码序列时需在两个①____(填“内” “外”或“内和外”)引物的 5′端分别添加序列②_________ _____________；为验证目的基因在PCR 扩增时是否发生了基因突变，可对PCR 产物进行③__________________ pLexA—JL和pB42AD 载体的构建 用特定限制酶切割目的基因和载体并连接，连接产物导入大肠杆菌后扩增；为确定质粒构建是否成功，需要抽提两种质粒并酶切，电泳后观察④______________________________ 内 GAATTC 和 CTCGAG DNA 测序(或测序) 是否出现预期大小的目标条带 1 2 3 4 5 实验目的 方法步骤要点(部分) 转化酵 母细胞 将成功构建的载体通过⑤_____________导入到营养缺陷型酵母菌细胞中，培养基中需添加的物质有⑥_____a.甲硫氨酸 b.色氨酸 c.组氨酸 d.X—gal e.琼脂(填字母) 实验验证 通过观察培养基中⑦________________________________来验证蛋白质X 和Y 是否具有相互作用 Ca2＋处理 ade 菌落的颜色(或菌落是否呈现蓝色) 1 2 3 4 5 据图可知，pB42AD中目的基因的两端是GAATTC 和 CTCGAG序列，因此巢式PCR 扩增蛋白质Y 编码序列时需在两个内引物的 5′端分别添加序列GAATTC 和 CTCGAG。 为验证PCR扩增时是否发生了基因突 变(判断基因中是否发生碱基的增添、缺失或替换)，可对PCR 产物进DNA 测序(或测序)。 1 2 3 4 5 构建好基因表达载体后，可以使用DNA电泳，观察电泳结果是否出现预期大小的目标条带，来确定表达载体构建是否成功。将目的基因导入微生物细胞常用Ca2＋处理。 鉴别培养基属于固体培养基，需要加 琼脂，报告基因LacZ表达的酶可以将无色化合物 X—gal 水解成蓝色产物，报告基因LacZ是否表达可以通过加入X—gal 后培养基中菌落 1 2 3 4 5 颜色来鉴定，另外还需要加入氨基酸作为营养物质(由于表达载体中含有控制组氨酸和色氨酸合成的基因，若转基因成功则能够在不含有色氨酸、组氨酸的培养基上生长，所以可以将该酵母菌接种在不含有色氨酸、组氨 酸的固体培养基上，以获得转基因成功的单菌落)，故培养基中需添加的物质有X—gal 、琼脂和甲硫氨酸。 1 2 3 4 5 由于只有当蛋白质X和蛋白质Y相互作用时，转录因子的DNA结合结构域(BD)和转录激活结构域(AD)才能发挥作用，进而激活报告基因的转录，进而得以表达，报告基因LacZ表达 的酶可以将无色化合物 X—gal水解 成蓝色产物，因此，可以通过检测菌落的颜色(菌落是否呈现蓝色)来确定蛋白质X和Y是否具有相互作用。 5.1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，导入工程菌获得胰岛素。这两种方法使用同一种质粒作为载体。 (1)AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列的原因是_____________________________。用____________(填“AB”“BCA”或“AB和BCA”)法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。 1 2 3 4 5 一种氨基酸可能对应多种密码子 AB和BCA 1 2 3 4 5 由于密码子的简并性，一种氨基酸可能对应多种密码子，所以AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。结合题干BCA法是利用人体胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，而在基因的结构中，启动子在非编码区，是不会被转录和翻译的，故AB和BCA法获取的目的基因中都不含人胰岛素基因启动子。 (2)如图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶________________的识别序列。通过添加保护碱基序列可以延长限制 1 2 3 4 5 XhoⅠ和MunⅠ 酶识别序列一端的碱基数，从而提高限制酶识别及切割的效率，保护碱基序列应添加在限制酶识别序列的____(填“3′”或“5′”)端。 5′ 根据上述信息，从以下序列中选择出适合的上游引物(GGG是保护碱基序列)：_____。 a：5′—GTAGTCGAACAATTGGGG—3′ b：5′—CAATTGGGGGTAGTCGAA—3′ c：5′—GGGCTCGAGATGCCAATC—3′ d：5′—ATGCCAATCCTCGAGGGG—3′ e：5′—CTCGAGGGGATGCCAATC—3′ f：5′—GGGCAATTGGTAGTCGAA—3′ g：5′—ATGCCAATCGGGCTCGAG—3′ h：5′—GTAGTCGAAGGGCAATTG—3 1 2 3 4 5 c 1 2 3 4 5 据图可知，SalⅠ和NheⅠ的作用位点在目的基因的中间，会破坏目的基因，则在引物设计时不能选用这两种限制酶，EcoRⅠ会破坏质粒上的标记基因，在引物设计时也不能选用EcoRⅠ，所以在设计PCR引 物时可添加限制酶XhoⅠ 和MunⅠ的识别序列。根据题干信息“通过添加保护碱基序列可以延长限制酶识别序列一端的碱基数， 1 2 3 4 5 从而提高限制酶识别及切割的效率”，保护碱基序列应添加在限制酶识别序列的5′端，引物的碱基序列应是5′—保护碱基＋限制酶识别序列＋引物配对区—3′，故适合的上游引物(GGG是保护碱基 序列)是c：5′—GGGCTCGAGATGCCAATC—3′。 (3)β－半乳糖苷酶可以分解无色的X—gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。据此并结合图中信息简述将目的基因导入大肠杆菌，并筛选工程菌的过程________________ 1 2 3 4 5 __________________________________________________________________________________________________________________________。 肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，再将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X—gal的培养基上培养，筛选出的白色菌落即为工程菌 经Ca2＋处理的大 (4)科学家利用蛋白质工程技术，研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。写出获取赖脯胰岛素的流程：从__________________出发→设计预期的蛋白质结构→_________________ ________→找到相对应的脱氧核苷酸序列→获得所需要的蛋白质。 1 2 3 4 5 预期的蛋白质功能 推测应有的氨基 酸序列 $$