专题5 第18讲 PCR的原理和应用 （课件）-【步步高】2024年新高考生物考前三个月（鲁湘辽吉）

专题五　生物技术与工程 第18讲　 PCR的原理和应用 内容索引 PCR的原理和操作 PCR技术的应用 预测演练 考点1 考点2 典例示范 考点1　PCR的原理和操作 1.(2023·邯郸高三期末)人血清白蛋白(HSA)是血浆蛋白的主要成分，具有维持血浆渗透压和进行物质运输的功能。科学家利用转基因技术获得转 HSA基因的大肠杆菌，通过发酵工程，实现HSA的大量生产，图1表示HSA基因，图2表示所用质粒的结构，回答下列问题： PART ONE (1)PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______。在循环前常要进行一次94 ℃、5 min预变性，其目的是________________________ ___________________________。 复性 增加模板DNA彻底变性的概率(或使模板DNA充分变性) (2)在PCR反应体系中，加入dNTP(dCTP、dATP、dGTP和dTTP)的作用是____________________________；在PCR反应缓冲液中还要加入Mg2＋，其作用是_________________。目前在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶，主要原因是__________________________ _____________________________________。 提供合成DNA的原料和能量 激活DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活 (3)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增HSA基因。用于扩增HSA基因的引物需满足的条件是_____________________________ ____________________________________。已知DNA复制时，子链延伸的方向是从5′→3′。若要扩增出HSA基因并用于表达载体的构建，应选择的引物是__________________，其作用是______________________ _______________________________。 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 是一小段能与HSA基因母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 引物Ⅱ和引物Ⅲ (4)由图2可知，在构建基因表达载体时，最好选用的限制酶是________________。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________(填 “3′端”或“5′端”)。至少复制_____次即可得到含所需酶切位点的HSA基因。目的基因只有正确插入质粒的_______________之间才能正确表达。 图2中氨苄青霉素抗性基因的作用是________________________。 Pvit Ⅱ和EcoR Ⅰ 5′端 3 启动子和终止子 便于重组DNA分子的筛选 (5)将构建的重组质粒导入大肠杆菌，需要用钙离子处理，使大肠杆菌处于_____________________________。 容易吸收外源DNA分子的状态 1.PCR技术原理与条件 应用提炼 2.PCR技术的过程 变性：加热超过90 ℃，DNA解链 　　　　↓ 复性：冷却至50 ℃左右，引物与互补DNA链结合 　　　　↓ 延伸：加热到72 ℃左右，在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成子链 3.相关数据 项目 n轮循环 DNA分子数 2n 含引物A(或B)的DNA分子数 2n－1 同时含引物A、B的DNA分子数 2n－2 共消耗的引物数量 2n＋1－2 两端等长的DNA分子数 2n－2n 提醒：第3次循环后，才会出现两端等长的目的基因片段。 4.PCR技术中“引物”归类分析 (1)引物的作用：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链。不同引物可结合不同的目的基因并进行扩增。 (2)引物的处理 由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，引物5′端对扩增特异性影响不大，因此给予修饰不影响扩增特异性。引物5′端修饰包括加酶切位点、标记生物素、荧光等。为了使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列。其目的是保证目的基因定向插入载体并避免目的基因自身环化。 1.(2021·山东，25)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达 对点精练 的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 (1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是_______，在R末端添加的序列 SalⅠ 所对应的限制酶是__________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要____种酶。 EcoRⅠ 6 据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中 的R端与荧光蛋白基因中限制酶MunⅠ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后， 两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有MunⅠ和XhoⅠ的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶MunⅠ和XhoⅠ所识别，故应该选用 添加限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，由图可知，限制酶MunⅠ识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoRⅠ识别并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ，在F1～F7末端添 加的序列所对应的限制酶是SalⅠ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoRⅠ的识别位点，故对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割。综上所述，对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ 切割，对扩增后的产物用限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的 整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、DNA连接酶。 (2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增 产物的受体细胞无荧光的原因是___________________________________ ____________________。 F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 受体细胞中已经除去BCL11A基因，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6与 R 扩增 产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。 (3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于______________________________________________， 引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 _______________________________________________________________________________________________。 理由是_____________________ _______________________________________________________________________________________________________________________________________ 根据有无荧光情况判断，F1～F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位 向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生BCL11A蛋白，BCL11A蛋白与BCL11A蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑 制；含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A蛋白的结合位点在引物F4与引物R之间的序列上；含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A蛋白结合位点在引物F5的上游 序列，故据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。 2.(2023·南通高三期末)COR基因是植物的冷调节基因，其编码的亲水性多肽能保护细胞免受冻害，具有增强植物抗寒性的作用。转录因子CBF(由CBF基因控制合成)能够特异性结合下游靶基因启动子区，从而激活COR基因的表达以提高植物的抗寒性。将不同植物中获取的CBF基因和COR基因组合起来构建抗寒基因超量表达载体，转入植物体内能有效提高植物的低温耐受性。 (1)研究小组获取了一段包含CBF基因的长DNA片段，根据已知CBF基因序列设计了适宜长度的引物A和引物B，则在PCR反应过程中至少需要经过_____次复制才开始出现与CBF基因长度和序列完全吻合的产物；经过4次循环形成的产物中同时含有引物A和引物B的DNA占_____，与CBF基因长度和序列完全吻合的产物占______。 3 7/8 1/2 (2)抗寒相关基因超量表达依赖于适宜的启动子。启动子可分为组成型启动子(每种组织器官中均发挥作用)、组织特异型启动子(特定组织器官中才能发挥作用)和诱导型启动子(特定条件刺激才能发挥作用)，构建基因表达载体时可单独使用某一类型的启动子，也可多种类型组合使用。从减少物质和能量消耗的角度出发，最好选择_________________________ __________(填启动子类型)使马铃薯块茎在寒冷刺激下才启动抗寒基因的表达。 组织特异型启动子和诱导 型启动子 (3)为将COR基因表达载体和CBF基因组合起来构建抗寒基因超量表达载体，应选择不同的限制酶分别切割COR基因表达载体和CBF基因的两端，目的是_________________________________________________________ _____________________________________________________。 (4)转录因子CBF特异性识别下游靶基因启动子区后，可能与___________酶结合形成复合体从而激活COR基因的表达。 保证COR基因表达载体和CBF基因的正确连接(或避免CBF基因和COR基因表达载体的自身环化以及CBF基因的反向连接) RNA聚合 (5)科学家成功培育出抗寒基因超量表达的转基因植物后，筛选到一个AtNUP160基因突变的植株(atnup160突变体)，已知AtNUP160基因表达产物能通过参与核孔复合体的形成影响RNA的出核转运，在植物抗寒过程中发挥重要的作用。研究发现，atnup160突变体中CBF基因的表达水平降低，进而影响了COR基因的表达，植物抗寒能力减弱。由此推断atnup160突变体抗寒能力减弱的机理是_____________________________ _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 atnup160突变体中AtNUP160基因表达产物减少，影响核孔复合体的形成，导致CBF基因转录形成的mRNA无法转运出核，转录因子CBF减少，使得COR基因的表达水平明显降低，产生保护细胞免受冻害的亲水性多肽减少，植物抗寒能力减弱 考点2　PCR技术的应用 2.(2023·盐城高三期末)下面是两个具体实验中的PCR技术应用，请根据资料回答下列问题： Ⅰ.重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。利用该技术可以实现基因的定点诱变。过程如图所示，图中“·”代表定点诱变的位点： 典例示范 PART TWO (1)PCR扩增DNA的过程中，引物a、b、c、d中，PCR1应选择图1中引物______，至少需要____轮循环才能获得产物AB。PCR1和PCR2在____个反应体系中进行，原因是_____________________________ _____________。大量扩增突变产物AD应选择引物_______。 a和b 2 2 引物b和引物c可以互补配对， 导致引物失效 a和d (2)重叠延伸时不需要引物的原因是__________________________________________，重叠延伸时不能选择AB下链和CD上链的原因是__________________ ________________________________________________________。 可以分别以AB上链和CD下链为引物进行延伸 子链的延伸方向只能从5′→3′，以AB下链和CD上链作模板时子链不能延伸 (3)重叠延伸PCR通过______________________实现定点突变。与X射线诱变相比，该突变技术的优点是_____________________。 在引物b和c上引入突变 目的性强、突变率高 Ⅱ.反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如图2、3所示。图中链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。 (4)不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增，原因是_______ ______________________________。 两端序列未知，无法设计引物 DNA (5)图3中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A延伸子链的延伸方向是________(填“顺时针”或“逆时针”)，PCR产物_______(填“含有”或“不含”)EcoR Ⅰ的酶切位点。 逆时针 含有 应用提炼 1.DNA片段的扩增及电泳鉴定 2.实时荧光定量RT－PCR技术检测RNA病毒核酸 RNA病毒感染的常规检测方法是实时荧光PCR技术。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部分序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA 聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测 到(如图甲)，通过实时荧光PCR检测RNA病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小，说明样本病毒核酸浓度越高。 3.PCR定点突变——重叠延伸PCR 主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(如图中引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。 水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性，原理如图所示。 4.PCR定点突变技术——大引物PCR 大引物PCR需要用三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段，原理如图所示。 5.反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列 当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理是：用限制性内切核酸酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对方向相反的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列，原理如图所示。 6.巢式PCR 第一步：目标的DNA模板与外引物(第一套引物)结合。外引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段(图中未显示可能的多种产物)。 第二步：使用内引物(第二套引物)对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。由于内引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此内引物不可能扩增非目的片段。 这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。原理如图所示。 3.(2023·无锡高三质检)巢式PCR是一种特殊的聚合酶链式反应，使用两组不同的引物实现目标DNA片段的扩增。第一组外引物扩增出的DNA片段(中间产物)长度超出目标区域，第二组内引物称为巢式引物，其结合部位在中间产物内部的目标区域，从而扩增出目标产物，具体过程如图1所示。请回答下列问题： 对点精练 (1)巢式PCR反应体系中需加入模板、_________________________________、_____________________、引物、Mg2＋、缓冲液等。 Taq DNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶) dNTP(4种脱氧核苷酸) (2)巢式PCR过程中反应温度最低的一步是______。巢式PCR中外引物的第一阶段扩增和内引物的第二阶段扩增通常在不同的试管中进行，可防止________在第一阶段PCR中与模板结合。 复性 内引物 PCR过程包括高温变性、低温复性、中温延伸。故巢式PCR过程中反应温度最低的一步是复性。巢式PCR两次扩增所用的引物是不同的，因此两个阶段反应不在同一试管完成的主要原因是防止内引物在第一阶段PCR中与模板结合。 (3)若直接用图1中的内引物对模板DNA扩增，则内引物与模板的非目标区域进行碱基互补配对的概率会______(填“上升”或“下降”)，不易得到目标产物。巢式PCR获得的产物特异性____(填“高”或“低”)。 上升 高 巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片段，第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段。第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存 在下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异性，获得的产物特异性更高。若直接用图1中的内引物对模板DNA扩增，则内引物与模板的非目标区域进行碱基互补配对的概率会上升，不易得到目标产物。 (4)家畜胚胎性别鉴定对畜牧业发展具有重要意义，科研人员利用多重巢式PCR技术同时扩增奶牛Y染色体上雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1)，进行早期胚胎性别鉴定和胚胎移植，获得高产奶牛。请完成如表相关内容。 实验目的 方法步骤要点 囊胚样品DNA提取 选取①________细胞提取DNA PCR引物的设计和合成 根据牛的SRY和CSN1S1基因序列设计合成4对引物 PCR扩增 预变性→变性→复性→延伸 鉴定分析 ②_________________________________________________ ③______________ 对受体奶牛注射前列腺素 胚胎移植 将符合要求的胚胎移植到受体奶牛的子宫内 滋养层 采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，确定胚胎性别 同期发情处理 对胚胎进行性别鉴定时，宜取囊胚期的滋养层细胞进行鉴定。采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，确定胚胎性别。在胚胎移植前需要对受体奶牛进行同期发情处理，便于移植。 (5)巢式PCR产物鉴定结果如图2所示，1～5号为取自不同胚胎的DNA样品，其中符合要求的胚胎是________________。下列方法也可鉴定奶牛胚胎性别的是________(填序号)。 ①染色体核型分析法　②核酸探针杂交法　③差速离心法　④抗HY血清免疫学法(HY抗原编码基因位于Y染色体上) 1号、2号、4号 ①②④ 题中利用多重巢式PCR技术同时扩增Y染色体上雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1)进行电泳，雌性个体没有SRY，只有一条带，雄性有 两条带，因此1号、2号、4号是雌性，3号、5号是雄性，其中符合要求的胚胎是1号、2号、4号。染色体核型分析法，XY染色体形态不同，因此可以进行性别鉴定，①符合题意； 核酸探针杂交法，Y染色体上雄性决定基因(SRY)制成探针可以鉴定性别，②符合题意； 差速离心法是分离各种细胞器的方法，不能进行性别鉴定，③不符合题意；抗HY血清免疫学法(HY抗原编码基因位于Y染色体上)，也可以鉴定性别，④符合题意。 4.(2023·连云港高三调研)RBD是某冠状病毒表面包膜S蛋白的受体结合域肽段。Fc为人源抗体IgGⅠ的部分重链，能通过二硫键相结合形成Fc二聚体。科研人员为研制重组蛋白疫苗，构建了融合表达RBD和Fc的重组质粒。实验流程如图，请回答下列问题： (1)通过重叠延伸PCR(重叠链相互搭桥、互为模板而延伸，最终将不同来源的DNA片段拼接起来)获取融合基因。 ①第一次PCR中，至少经____次扩增，可得到末端平齐且含引物2的产物；扩增n次后，末端平齐且含引物2的DNA分子数量为___________个； 2 2n－n－1 PCR的原理是DNA半保留复制，第一次 PCR 中，至少经2次扩增，可得到末端平齐且含引物 2 的产物；扩增n次后，共得到2n个DNA分子，其中有n个DNA分子末端长度不同，1个DNA分子末端平齐且只有引物1，故末端平齐且含引物 2 的 DNA 分子数量为2n－n－1个。 ②第二次PCR扩增表达Fc的DNA片段； ③经第三次PCR获取融合基因，第三次PCR比第一次PCR延伸所需时间____(填“长” 或“短”)，原因是_____________ ________________。 长 第三次PCR中 待扩增的片段长 由于第三次PCR中待扩增的片段长，故第三次 PCR 比第一次 PCR 延伸所需时间长。 (2)构建基因表达载体 分步实验目的 简易操作 酶切融合基因和质粒pCDNA3.1 37 ℃条件下，酶切8小时，电泳鉴定、回收；酶切位点应添加在引物①_____(填引物种类)的末端 获取重组质粒 将上述融合基因、质粒和②___________酶一起加入反应体系， 16 ℃反应过夜 利用大肠杆菌 ③____________ 将产物加入大肠杆菌培养液，培养过夜，提取更多重组质粒 1和4 DNA连接 扩增重组质粒 由于PCR扩增过程中，子链是从5′端向3′端延伸的，引物需要与模板的3′端结合，据图可知，酶切位点应添加在引物1和4的末端；重组质粒获取时，应在反应体系中添加融合基因、 质粒和DNA连接酶(连接目的基因和载体)；将产物加入大肠杆菌培养液，提取更多重组质粒的过程是利用大肠杆菌进行扩增重组质粒。 (3)将目的基因导入人胚胎肾细胞 将重组质粒、聚乙烯亚胺溶液加入状态良好的人胚胎肾细胞培养液中，培养4～5天，分离纯化融合表达蛋白，推测聚乙烯亚胺溶液的作用是_________________ ______________________。 使重组DNA进入受 体细胞(人胚胎肾细胞) (4)已知RBD二聚体疫苗比RBD单体疫苗效果更优，推断重组蛋白中Fc的作用是___________________________。 有效介导RBD二聚体的形成 结合题意，Fc为人源抗体IgG的部分重链，能通过二硫键相结合形成Fc 二聚体，而RBD二聚体疫苗比RBD单体疫苗效果更优，推断重组蛋白中Fc的作用是有效介导RBD二聚体的形成。 1.(2023·南京高三一模)人体肝脏细胞中的乙醛脱氢酶2(ALDH2)是人体酒精代谢中的关键酶。研究人员利用定点诱变技术对ALDH2基因进行改造后在大肠杆菌中表达，获得具有较好溶解性的乙醛脱氢酶2。所用质粒和操作过程如图，其中，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因。质粒的外侧链为a链，内侧链为b链。基因AmpR转录的模板链属于a链的片段。改造后的ALDH2基因编码区首端到末端(编码链，转录时没 1 2 3 4 5 预测演练 PART THREE 有用作模板的DNA链)的序列为5′－ATCCATGCGCTC…(中间核苷酸序列)…CAGTGAGTAGCG－3′。四种限制酶的识别序列及切割位点见表格。请回答下列问题： 1 2 3 4 5 限制酶 BamHⅠ PstⅠ XhoⅠ XbaⅠ 识别序列和切割位点(5′→3′) G↓GATCC C↓TGCAG C↓TCGAG T↓CTAGA (1)通过定点诱变技术可制备自然界原本________(填“存在”或“不存在”)的蛋白质。 1 2 3 4 5 不存在 (2)质粒复制的模板链是_______(填“a”“b”“a和b”或“a或b”)链，基因TetR转录的模板链属于______的片段。若用XhoⅠ切割质粒后，形成的单链末端碱基序列为_____________________。 1 2 3 4 5 a和b b链 TCGA－(或－AGCT) 1 2 3 4 5 质粒的a和b链都作为模板进行复制，TetR的转录方向与AmpR的转录方向相反，说明TetR的转录模板和AmpR转录模板不在一条链上，AmpR转录的模板链属于a链的片段，则TetR的转录模板链属于b链的片段。XhoⅠ的识别序列为C↓TCGAG，则若用XhoⅠ切割质粒后，形成的单链末端碱基序列为TCGA－(或－AGCT)。 (3)过程②需要的酶是______________________________________。过程③常采用_______________处理大肠杆菌以提高操作效果。经过程④，在培养基上能形成菌落的大肠杆菌类型有_____________________________ _____________________。 1 2 3 4 5 限制酶(或BamHⅠ、XbaⅠ)和DNA连接酶 Ca2＋(或CaCl2) 导入空白质粒的大肠杆菌和导入 重组质粒的大肠杆菌 1 2 3 4 5 质粒中有两个XhoⅠ识别切割位点，且均位于标记基因中，过程②是构建重组质粒，因此需要限制酶BamHⅠ、XbaⅠ切割目的基因和质粒，需要DNA连接酶将目的基因和质粒连接起来。过程③是将重组质粒导入受体细胞，一般需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态。重组质粒和空白质粒都可能导入受体细胞，所以经过程④，在培养基上能形成菌落的大肠杆菌类型有导入空白质粒的和导入重组质粒的大肠杆菌。 (4)为扩增目的基因，某同学设计了如下六种PCR引物，其中可选用的一对引物是______(填序号)。根据选定的引物，经过4次循环，最多可获得____个符合要求的目的基因。 ①5′－TCTAGAATCCATGCGCTC－3′ ②5′－TCTAGACGCTACTCACTG－3′ ③5′－CTGCAGATCCATGCGCTC－3′ ④5′－GGATCCCGCTACTCACTG－3′ ⑤5′－GGATCCATCCATGCGCTC－3′ ⑥5′－CTCGAGCGCTACTCACTG－3′ 1 2 3 4 5 ②⑤ 8 1 2 3 4 5 PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。根据ALDH2基因编码区首端到末端(编码链)的序列为5′－ATCCATGCGCTC…(中间核苷酸序列)…CAGTGAGTAGCG－3′，且引物5′端需要添加BamHⅠ、XbaⅠ的识别序列，可推测所选引物的脱氧核苷链为5′－TCTAGACGCTACTCACTG－3′，5′－GGATCCATCCATGCGCTC－3′，即②⑤符合题意。经过4次循环，最多可获得24－2×4＝8(个)符合要求的目的基因。 2.(2023·潍坊高三二模)同源重组是指发生在两个DNA 分子的同源序列(DNA序列相同或近似)之间直接进行交换的一种重组形式。利用同源重组的方法可以将目的基因插入到表达载体上，如图所示。该操作可通过PCR技术在任一位点实现质粒的线 1 2 3 4 5 性化，只要将目的基因两端带有与线性化质粒两端同源的DNA序列，在重组酶的作用下即可实现质粒上的同源重组，被称为体外重组。 (1)真核生物有性生殖过程中发生在_____ _______________________之间的基因重组，为体外同源重组提供了依据。图中B过程采用PCR技术扩增目的基因时，需要的正向引物和反向引物的序列中都由____________________________________________________两部分组成。 1 2 3 4 5 同源 染色体非姐妹染色单体 线性化质粒两端同源的 DNA序列和目的基因的部分序列 (2)通常采用双酶切法构建目的基因表达载体的优点是________________________ ____________________________________________________________________________。与双酶切法相比，同源重组法构建基因表达载体的突出优点是____________ ____________________________________ __________。 1 2 3 4 5 保障目的基因和线性质粒的正确连接(或防止目的基因、线性质粒的自身环化及目的基因与线性质粒的反接) 在重组酶的作用下可以实现载体上任一点与目的基因的重组 1 2 3 4 5 采用双酶切法构建目的基因表达载体产生的黏性末端不同，保障目的基因和线性质粒的正确连接，与双酶切法相比，同源重组法构建基因表达载体的突出优点是在重组酶的作用下可以实现载体上任一点与目的基因的重组，即同源重组 可通过PCR技术在任一位点实现质粒的线性化，只要将目的基因两端带有与线性化质粒两端同源的DNA序列，在重组酶的作用下即可实现质粒上的同源重组。 (3)表达质粒线性化和目的基因扩增后电泳结果分别如图甲、乙所示，将获得的目的基因与线性化质粒混合导入受体细胞中，不添加重组酶，该过程称为体内重组。为检测不同细胞的同源重组情况，一段时间后利用相应 1 2 3 4 5 的引物对三个细胞(标号1、2、3)中DNA进行PCR扩增，电泳结果如图丙所示。根据电泳结果可说明_______________________________________ _______________。 1号、2号细胞未实现同源重组，3号细胞实 现了同源重组 1 2 3 4 5 1号的条带小于3号，与图甲相同，说明没有实现同源重组；2号有两条带说明目的基因没有与载体相连，没有实现同源重组；3号条带最大，且长度是载体和目的基因之和，则说明实现了同源重组。 3.(2023·山东，25)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 1 2 3 4 5 (1)与图甲中启动子结合的酶是_________ ______。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有_________ _______________________________(答出2个结构即可)。 RNA聚 合酶 复制原点、标记基因、限制酶切割位点等 1 2 3 4 5 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物__________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的______(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 F1和R2(或F2和R1) a链 1 2 3 4 5 据图甲可知，引物F1与R2或F2与R1结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2或F2和R1。b是模板链，而根据图甲中启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右，对应的模板链方向应该是3′→5′，非模板链(a链)是5′→3′； 1 2 3 4 5 考虑到DNA复制的方向是子链的5′→3′，引物延伸的方向也是5′→3′，所以引物结合的单链延伸方向是3′→5′；图甲中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′→5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。 1 2 3 4 5 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了_________________，条带2所检出的蛋白______(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 J－V5融合蛋白 不是 1 2 3 4 5 重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平。分析题图可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体检测后，均有条带1，说明细胞内表达了J－V5融合蛋白。用抗J蛋白抗体检测后，出现条带2，而用抗V5抗体检测后，没有出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 80 4.(2023·江苏四校高三联考)IKK激酶由IKKα、IKKβ和IKKγ三种亚基组成，参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKKβ基因编码区第1 183位碱基T突变为C，导致IKKβ上第395位酪氨酸被组氨酸替代。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠，主要过程如图，请回答问题： 1 2 3 4 5 (1)在PCR反应体系中，需要加入引物和IKKβ基因外，还需要加入__________________________ _____________________________等。在图1获取突变基因过程中，需要以下3种引物： 引物A：5′—CCCCAACCGGAAAGTGTCA—3′(下划线字母为突变碱基) 引物B：5′—TAAGCTTCGAACATCCTA— 1 2 3 4 5 3′(下划线部分为限制酶HindⅢ识别序列) 引物C：5′—GTGAGCTCGCTGCCCCAA—3′ (下划线部分为限制酶SacⅠ识别序列) 则PCR1中使用的引物有_______________，PCR2中使用的引物有________和图中大引物的_____(填“①”或“②”)链。 Taq DNA聚合酶(耐高温的 DNA聚合酶)、4种脱氧核苷酸 引物A和引物C 引物B ② (2)图2模型鼠培育过程中杂合模型鼠(F0)的培育涉及了一系列现代生物技术，如表是其中的一些步骤，请根据题意完成表格内容。 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 过程 实验目的 步骤要点 导入 a.处理突变基因与载体 ①_______________________________________ ____________ b.构建重组载体 利用DNA连接酶催化突变基因和载体连接 c.导入目的基因 ②______________________________________ 发育 d.获取早期胚胎 利用专用培养液培养受精卵，并检测其发育状况 e.代孕获得小鼠 ③_________________________________ f.鉴定、筛选F0小鼠 利用PCR鉴定基因，筛选出杂合鼠F0 　 利用限制酶(SacⅠ、HindⅢ)分别处理突变基因和载体 利用显微注射将重组载体注入小鼠受精卵 利用合适的早期胚胎进行胚胎移植 (3)根据图2杂交结果，可以确认突变基因已经较稳定地整合到小鼠细胞的染色体上，在遗传时遵循__________定律。研究人员对三种基因型小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进行提纯和电泳，结果如图3。请依据此结果提出SCID患者免疫缺陷产生的机制为_____________________________________ _________________________。 1 2 3 4 5 基因分离 IKKβ基因突变导致IKKβ含量减少，IKK激酶活力降低，T细胞减少 5.(2023·常州高三期末)重叠延伸PCR技术是常规PCR技术的衍生，它依据需要连接的基因中核苷酸序列(或基因片段)设计出多对具有互补末端 1 2 3 4 5 的引物，先分段对模板进行扩增，再将PCR产物混合，其中的重叠链将相互搭桥、互为模板而延伸，最终实现不同来源的扩增片段重叠拼接起来的目的，如图1所示。请分析并回答下列问题： 1 2 3 4 5 (1)图1中的过程②在___个反应体系中进行，原因是__________________________。经过程②后，体系中存在不同长度的DNA片段，获取所需DNA的方法是_______________________。①中引物2和引物3的游离部分分别与___________________的部分序列同源。 2 引物互补配对影响PCR结果 (琼脂糖凝胶)电泳分离 外显子B、外显子A 1 2 3 4 5 (2)图1中的过程⑥________(填“需要”或“不需要”)另加引物，原因是_________________ ________________________________。进行过程②⑥⑧⑩时，需要在一定的缓冲溶液中进行，过程⑩除图示条件还需要加入_______________ _________________________________________。 不需要 两条重叠链可以作 为引物相互搭桥、互为模板而延伸 4种脱氧核苷酸 (dNTP)、耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 1 2 3 4 5 (3)重叠延伸PCR技术可用于基因的定点突变。基因定点突变是根据目的基因(如图2蛋白A基因)的序列，设计4条单链寡核苷酸片段为引物(图2中的引物A～D)，原理是取引物A、B进行PCR1反应，以及引物C、 D进行PCR2反应，然后将需要的两个片段混合、延伸并大量扩增。图2引物B和引物C中的“Λ”代表___________，引物B和引物C碱基序列间存在的关系是______。 突变碱基 互补 $$