1.2 微生物的培养技术及应用（第2课时）课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1、尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。 2、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 CO(NH2) 脲酶 + H2O + CO2 NH3 尿素的相关内容 3、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 4、课题目的 ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 研究思路 ㈠.筛选菌株 ㈡.统计菌落数目 ㈢.设置对照 ㈠.筛选菌株 1.实例：PCR技术：一种在体外将少量DNA大量复制的技术。此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。 提出的问题—如何寻找耐高温的DNA聚合酶？ 解决问题的思路—寻找耐高温环境。 原因：因为热泉温度70～80℃，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。 获得启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。 2、实验室中微生物的筛选原理： 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基。 方法： ⑴抑制大多数微生物生长； ⑵造成有利于该菌生长的环境。 结果： 3、选择培养基 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止 其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。 定义： 4、配制选择培养基的依据 根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。 例如：培养基中不加入有机物可以选择培养________微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养________的微生物，加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。 自养型 固氮 15.0g 琼脂 1.0g 尿素 10.0g 葡萄糖 0.2g MgSO4`7H2O 2.1g NaH2PO4 1.4g KH2PO4 5、本课题使用的培养基的配方： （1）从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上划分呢？ 固体培养基，因为加入了凝固剂琼脂。从功能上看属于选择培养基。 （3）上述培养基选择分解尿素的微生物的原理： 培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。 （2）在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素 怎样证明此培养基具有选择性呢？ 以尿素为 唯一氮源 的培养基 牛肉膏 蛋白胨 培养基  是 分离 尿素 细菌 判断该 培养基 有无选 择性 实验组 对照组 培养基类型 是否 接种 目的 结果 只生长尿素细菌 生长多种微生物 是 总结 项目 选择培养基 鉴别培养基 特殊成分 加入某种化学物质 加入某种指示剂或化学药品 目的 抑制其他微生物生长，促进目的微生物生长 与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应 用途 培养、分离出特定微生物 鉴别不同的微生物 举例 培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素作唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌 可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈黑色) 补： 1、显微镜直接计数： ㈡.统计菌落数目： 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。 (1)原理： (2)具体做法： 每一个大方格边长为 1mm ，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。　 以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，一个大方格中的总菌数是多少? 5A 1ml菌液中的总菌数?(1ml=1cm3=1000mm3） 5AB×104 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察。 缺点： 优点： 能准确统计微生物的实际数目。 2.间接计数法（活菌计数法） （1）常用方法： 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 （2）原理： 稀释涂布平板法。 （3）统计原则： ①选 30∼300 个菌落的平板统计。 ②每个稀释度取3个平板取其平均值。 （4）统计结果： 统计的菌落数往往比活菌的实际数目____，因此统计结果一般用_________________ 表示。 低 菌落数而不是活菌数 稀释涂布平板法计算注意事项 ①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。 ②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。 ③统计的菌落往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。 ④涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。 例：两位同学用稀释涂布平板法测定同 一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为 106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ 提示：甲同学只涂布了1个平板，没有设置重复组，因此结果不有说服力。乙同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数值结果与另外2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值，这两位同学的实验都需要改进。在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。 3 .直接计数法和间接计数法的比较 设置对照的主要目的: ㈢.设置对照： 设置对照的方法： 条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素。 自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。 相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。 空白对照：不给对照组任何处理因素。 是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。 原因： ⑴土样不同， ⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质) 小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。 由其他同学用与A同学相同土样进行实验 将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 结果预测：如果对照组没有受污染，则证明A无误；如果对照组受污染，则证明A同学存在操作失误。 结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。 方案一： 方案二： 实验设计 实验设计的内容： 实验设计包括对实验方案，所需仪器、材料、用具 和药品，具体的实验步骤以及时间安排等的综合考 虑和安排。 1.土壤取样 3.样品稀释、取样涂布 4.微生物的培养、观察并记录结果 5.细菌的计数 2.制备培养基 实验步骤： 1.土壤取样 注意无菌操作： ◆取土样用的小铁铲和盛土样的信封等用具在使用前都要灭菌。 ◆应在火焰旁称取土壤。并在火焰附近将土样到入锥形瓶并塞好棉塞。 （1）取样的位置： 土壤——微生物的天然培养基，含有大量的微生物，土壤中70∼90％是细菌，细菌适宜在酸碱度接近中性的的潮湿土壤中生长。在富含有机质的土壤层的3∼8cm处中分布着绝大多数的细菌。 （2）取样要求： 铲去表层土。 2.制备培养基 牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，判断选择培养基是否 起到选择作用。 选用稀释倍数为103~107的稀释液。每个稀释度下需要3个选择培养基（平行重复原则），1个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基，准备好无菌试管和移液管。 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。 3.样品稀释、取样涂布 注意灭菌： ◆应在火焰旁称取土壤10g。 ◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行 （1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液 （2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液 （3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液 ◆分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因： 不同微生物在土壤中含量不同 目的： 保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板 ◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。 ◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30—300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。 4.微生物的培养、观察并记录结果 将涂布好的培养皿放在30℃下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。 细菌一般在30~37℃的温度下培养1~2d； 放线菌一般在25~28℃的温度下培养5~7d； 霉菌一般25~28℃的温度下培养3~4d。 　 一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如菌落形状、大小、隆起程度和颜色。 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 原因： 不同种类的微生物，往往需不同的培养温度和培养时间，每隔24h统计1次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 要求1、 不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、 光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度 的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。 以“稳定菌落”为观察对象。 原因： 要求2、 微生物的培养与观察 5.细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。 操作提示 1、无菌操作 （1）去土样的用具在使用前都需要灭菌。 （2）应在火焰旁称取土壤，并在火焰附近将称好的土样倒 入锥形瓶中，塞好棉塞。 （3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁。 本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好使用前就做好标记 2、做好标记： 37 4、菌种鉴定： （1）原理： 分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，是培养基的碱性增强。 （2）方法： 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。 对于耗时较长的实验，要事先制定计划，以便提高工作效率。 3、规划时间： 探究1、根据选择培养基的原理，如何筛选出耐酸菌？ 提示：可将培养基的pH调至酸性，在接种培养。 探究2、如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数? 提示：统计某一稀释度下的平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上菌落数的平均值，然后按照公式进行计算。 问题探究 提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值偏小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微技术法计数的结果比实际值偏大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。 探究3、稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？分析原因。 探究4、为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？ 当测定时为什么要将稀释的范围放宽一些？ 探究5、在稀释涂布平板法中，为何需涂布3个平板？ 提示：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的；为确保能从中选择出菌落数在30-300之间的平板进行计数。 提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。 探究6、统计菌落数目的理论依据是什么？ 探究7、为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？ 提示：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。 提示：尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落。 问题探究 原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长 选择培养基 概念：允许特定种类微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基 接种方法： 稀释涂布平板法 活菌计数法 重复实验 对照实验 计算公式：每克样品中的菌株数=（C/V）×M C C D 检测培养基平板灭菌是否合格 3.8×107 灼烧 将聚集的菌体逐步稀释 以便获得单个菌落 B 溶解氧 营养物质 能将尿素转化为氨的微生物种类比较多：幽门螺杆菌是栖息在胃粘膜的革兰氏阴性螺旋状短杆菌，具有强的尿素酶活性，能将尿素分解成氨和二氧化碳，其代谢类型属于异养厌氧型； 一种特殊类型的支原体，可分为两个群体，个体呈球杆状，常寄生于人的尿道、口腔及呼吸道上皮内，它也具有将尿素分解成氨的性能，代谢类型也属于异养厌氧型； 一种尿酸菌能使胃粘膜部位的尿素分解成氨，而氨使胃酸中和，同时，氨还会破坏胃粘膜表面细胞膜，造成胃粘膜细胞损伤，而影响人体对中药汤剂中有效成分的吸收，这种尿酸菌代谢类型也属于异养厌氧型； 许多细菌如变形杆菌、沙门氏菌和葡萄球菌，可将尿中的尿素分解成氨，其代谢类型大都属于异养厌氧型； 大肠杆菌可将大便中的尿素分解成氨，其代谢类型属于异养、兼性厌氧型。 eq \a\vs4\al\co1()激趣应用1 ——为筛选菌株而配制的培养基有何特点？ 筛选菌株所用的培养基具有能满足需筛选微生物正常生长所需的营养物质或条件，而不利于非筛选微生物的生长。 此类培养基可通过哪些方法来实现其选择作用？ 提示：(1)在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在培养成分的基础上加入。 (2)改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；缺乏碳源时可以分离自养微生物。 (3)改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物。 [随堂基础巩固] 1．在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制 或阻止其他种类微生物生长的培养基称做 (　　) A．鉴别培养基　　　　　 B．加富培养基 C．选择培养基 D．基础培养基 解析：鉴别培养基是在培养基中加入某种特殊化学物质，微生物的代谢产物与特殊化学物质发生特定化学反应，产生明显特征变化；加富培养基一般用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物；基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基，例如牛肉膏蛋白胨培养基；选择培养基是在培养基中加入特殊营养物质或化学物质，抑制不需要微生物的生长，有利于所需微生物生长的培养基。 答案：C　 2．请选出下列正确的操作步骤 (　　) ①土壤取样　②称取10 g土壤，加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中　③吸取0.1 mL进行平板涂布　④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度 A．①→②→③→④ B．①→③→②→④ C．①→②→④→③ D．①→④→②→③ 解析：在分离土壤中某细菌时，应先选取土样(10 g)，然后加无菌水获得土壤浸出液，并进行不同倍数稀释，最后将稀释液涂布到培养基表面进行培养，并分离和计数。 答案：C　 3．某研究小组欲研究被石油污染过的土壤中细菌的数量，并 从中筛选出能分解石油的细菌。下列操作错误的是 (　　) A．称取和稀释被污染的土壤时应在火焰旁 B．用以石油为唯一碳源的培养基进行筛选 C．分离菌种时可采用稀释涂布平板法接种 D．对细菌进行计数时宜采用平板划线法接种 解析：微生物的分离和培养的关键技术是无菌操作，因此在微生物的分离和培养的过程中称取和稀释土壤时应在火焰旁进行；阅读题干可知实验目的是筛选出能分解石油的细菌，培养基的配方应以石油为唯一碳源；对微生物进行分离和计数，应该用稀释涂布平板法；分离菌种常用的接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法，但对活菌进行计数常用稀释涂布平板法而不能用平板划线法。 答案：D　 4．(全国卷Ⅱ)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定 了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题： (1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是__________________________；然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为________________________________________________。 (2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过________灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是_____________。 (3)示意图A和B中，________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。 (4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中____________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高________的利用率。 解析：(1)为了检测培养基平板灭菌是否合格，可在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间。(2)0.1 mL稀释液中平均有38个活菌，可推测每升水样中的活菌数＝38×10×100×1 000＝3.8×107(个)。(3)接种环、接种针或其他金属用具直接在酒精灯火焰的外焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，其目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。(3)比较两图可以看出，A是用平板划线法接种培养后得到的结果，B是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。 (4)由于振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，还可以使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率，因此振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。 答案：(1)检测培养基平板灭菌是否合格 3．8×107　(2)灼烧　将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落　(3)B　(4)溶解氧　营养物质 $$