1.2.2 微生物的培养技术及应用（第2课时）课件 2024—2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

生物学（人教版） 选择性必修三 生物技术与工程 第2节 第2课时 微生物的选择培养和计数 第一章 发酵工程 PCR需要耐高温的DNA聚合酶。理论上，自 然界微生物中存在耐高温的DNA聚合酶，但是这 样的微生物类型并不常见。 1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉 中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐 高温的DNA聚合酶。 正因为水生栖热菌能在70～80℃的高温条件 下生存，而其他绝大多数微生物不能，所以这种 耐高温的酶才能被我们筛选出来。 这为我们筛选某种特定微生物提供了怎样的思路？ 科学史话 ▲ 美国黄石公园 目的菌的筛选 自然界中目的菌的筛选： 根据目的菌对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 耐热微生物 耐寒微生物 石油分解菌 纤维素分解菌 实验室中目的菌的筛选： 人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH）等，同时抑制或阻止其他微生物生长。 选择培养基 1. 概念： 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 2. 方法： （1）在培养基中加入某种化学物质 加入青霉素的培养基 → 分离得到酵母菌、霉菌等 加高浓度食盐的培养基 → 分离得到金黄色葡萄球菌等 （2）改变培养基中的营养成分 （3）改变微生物的培养条件 不加氮源的无氮培养基 → 分离得到固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基 → 分离得到自养型微生物 高温环境下培养 → 耐高温微生物 无氧环境下培养 → 厌氧型/兼性厌氧型微生物 微生物的选择培养 思考·讨论 尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。通常1g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中细菌的数量最多，能分解尿素的细菌只是其中的一部分。 ▲ 尿素分子模型 1.若让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。 2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。 3.怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若对照培养基中生长的菌落数多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 9 mL 无菌水 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 铲取土样，将样土装入纸袋中。 2 将10g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。 3 取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 90 mL 无菌水 微生物的选择培养 稀释涂布平板法 —— ① 梯度稀释 1×10 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 微生物的选择培养 稀释涂布平板法 —— ② 涂布平板 4 取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 5 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 6 将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 7 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 微生物的选择培养 培养观察 8 等待涂布的菌液被培养基吸收。 9 将平板倒置，放入30 ~ 37℃恒温培养箱中培养1 ~ 2d。 30 ~ 37℃ 48h 如何计数？ 培养基上的菌落 意味着什么？ 微生物的数量测定 一、稀释涂布平板法 1. 原理： 当样品的稀释度足够高时，涂布操作将菌分散得足够开时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 2. 计数原则： 一般选择菌落数为 30～300 的平板进行计数。 样品稀释度直接影响平板上的菌落数目 同一稀释度下，至少对3个平板重复计数，然后求平均值 微生物的数量测定 4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为________个。 3. 计数公式： 1.1×108 每g样品中的菌落数＝（C÷V）× M C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）； M：代表稀释倍数。 二、显微镜直接计数法 微生物的数量测定 1. 原理： 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。 细菌计数板：对细菌等较小的细胞进行观察和计数 血细胞计数板：常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数 血细胞计数板 （计数板厚、计数室深） 细菌计数板 （计数板薄、计数室浅） 2. 优点： 微生物的数量测定 快速、直观 3. 缺点： 不能区分死菌与活菌 不适于对运动细菌的计数 个体小的细菌在显微镜下难以观察 → 统计结果偏大 台盼蓝染液染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。 比较稀释涂布平板法和显微镜直接计数法 项目 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法 主要用具 显微镜、 血细胞计数板或细菌计数板等 培养基等 计数依据 菌株本身 培养基上的菌落数 优点 计数方便、操作简单 计数的都是活菌 缺点 死菌、活菌都计数在内 操作复杂、有一定误差 计算公式 每毫升原液含菌株数＝ 每小格平均菌株数×400×104×稀释倍数 每克样品中的菌株数＝ [某一稀释度下平板上生长的平均菌落数/涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）]×稀释倍数 两种纯培养方法的比较 项目 平板划线法 稀释涂布平板法 主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 接种工具 接种环 涂布器 单菌落的获得 从最后划线的区域挑取 稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落 用途 分离纯化菌种，获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数 培养结果 相同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征。 平板划线法不能达到对细菌进行计数的目的，因为平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。 稀释涂布平板法会进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌类的密度，再通过计算可以得知原液的菌落数。 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1. 提出问题： 土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？ 组分 含量 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g H2O 定容至1000 mL 2. 基础知识： 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 探究·实践 ①提供无机盐； ②调节 pH。 3. 实验设计： ①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿 ②取样部位：距地表约3～8 cm的土壤层 ③注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后一定要洗手。 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基 制备牛肉膏蛋白胨培养基（对照） 用无菌水稀释； 测细菌时，一般选用1×104、1×105、×106倍稀释的稀释液进行平板培养。在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。 土壤取样 制备培养基 梯度稀释与涂布平板 培养与观察 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 探究·实践 3. 实验设计： 土壤取样 制备培养基 梯度稀释与涂布平板 培养与观察 ①每个浓度至少设置_个平板： 1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复）、 4为牛肉膏蛋白胨培养基 （对照组）。 用以判断选择培养基是否具有选择作用： 若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目，则说明选择培养基具有筛选作用。 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 探究·实践 4 3. 实验设计： 土壤取样 制备培养基 梯度稀释与涂布平板 培养与观察 ②如何验证培养基中是否含有杂菌？ 设置2个平板作为对照： 不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。 若对照的培养基中无菌落生长，则说明未被杂菌污染。 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 探究·实践 3. 实验设计： 土壤取样 制备培养基 梯度稀释与涂布平板 培养与观察 ①培养： 根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d。 ②观察： a．观察方法：每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而遗漏部分菌落。 b．记录菌落的特征： 包括菌落的形状、大小和颜色等。 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 探究·实践 4. 进一步探究： 得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？ 分析：不一定，因为有些微生物可以利用能分解尿素的细菌的代谢物进行生长繁殖。对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。 土壤中分解尿素的细菌的鉴定 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性 CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3 脲酶 ①液体培养基可以直接看液体的变色情况； ②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 探究·实践 项目 鉴别培养基 原理 用途 举例 图示 选择培养基 加入不影响甚至促进目标微生物生长、而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质 加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应 鉴别不同的微生物 培养、分离出目标微生物 可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴别大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色/黑色，并有金属光泽)；用刚果红培养基鉴别纤维素分解菌 培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素作为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌 ——透明圈 比较鉴别培养基与选择培养基 课堂小结 $$