第3章 第2节 第1课时 获取目的基因并构建基因表达载体-【勤径学升】2024-2025学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程同步练测（人教版2019）

?高中生物学·选择性必修3(人教版) 6.如图为 DNA分子的切割和连接过程。 -EcoR I切此位点一 GAATTC GAATTC CTTAAG CTTAAG EcoR I切此位点 双链断开 G[AATTC G AATTC CTTAA]G CTTAAC 不同来源的DNA 片段结合 G AATTC CTTAA G (1)EcoR I是一种 _酶，其识别序列是 ,切割位点是 与 __之间的 键。切割产生的 DNA片段末端形式为 。 (2)不同来源的 DNA片段结合，在这里需要 的酶应是 连接酶，此酶是在 与 之间形成 键，从而起“缝合”作用。还有一种 也可以连接平末端的连接酶是 。 (3)根据你所掌握的知识，分析限制酶在原核 生物体内的作用： 提示、请完成《素能提升训练》训练十二 第 2节 基因工程的基本操作程序 第1课时 获取目的基因并构建基因表达载体 [学习目标] 1.运用系统思想解释基因工程的基本步骤和原理。 2.结合资料和示意图阐明 PCR的原理，说出 PCR所需的条件及其反应过程。 3.结合模式图说出基因表达载体的组成，并理解构建目的。 自主学习探新知 课前预习 双基落实 一、目的基因的筛选与获取 1.筛选合适的目的基因 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中， 用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物 等的基因。目的基因主要是指 的基因。 (2)筛选方法：从相关的已知结构和功能清 晰的基因中进行筛选是较为有效的方法 之一。 实例：利用 Bt基因培育转基因抗虫棉 科学家掌握了 的已知 因此选取 Bt 结构 序列信息 基因作为培 育转基因抗Bt抗虫蛋白只在某类昆 虫棉的目的功能 虫肠道的 环境中才 基因清晰 表现出毒性，对人和牲畜 无影响 (3)认识基因结构和功能的技术方法： 技术、 数据库、 工具。 2.利用 PCR 获取和扩增目的基因 (1)PCR的含义：PCR 是 的缩写，它是一项根据 _的 原理，在体外提供 _的各种 组分与反应条件，对 进行大量复制的技术。 68 第3章 基因工程 (2)条件：DNA模板、分别与两条模板链结合 2.基因表达载体的组成(填图) 的2种 、4种 和。 启(位置：目的基因的_功能{驱动基因的 :人们所需要的基因 终止子{功能：终止转录一 识别和结合的部位， 表达载体(3)过程 ①变性：温度上升到 90 ℃以上，目的基因 :用于目的基因的检测与筛选DNA 。 3.基因表达载体的构建②复性：温度下降到50 ℃左右时， 首先用一定的 切割载体，使它 出现一个切口，然后用 限制酶或 的限制酶切割目的基因的 DNA片段，再利用 将目的 基因片段拼接到载体的切口处。 通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合。 ③延伸：温度上升到 72 ℃左右时，溶液中 在耐高温的 的作用下加到引物的 端合成子链。 概念检测④重复循环多次。 判断正误，正确的打“√”,错误的打“×”。(4)结果：每次循环后目的基因的量增加一 倍，即成 形式扩增(约为2”,其中 n 为扩增循环的次数)。 (1)PCR 过程使用的是耐高温的 DNA 聚 合酶。 ( ) (2)PCR过程中引物是一小段 DNA,至少要 有两种。 ( ) (5)产物鉴定： 。 二、基因表达载体的构建 (3)由于整个 PCR 过程中需要不断调节温 度，DNA聚合酶必须耐高温。 ( ) 1.构建基因表达载体的目的 (1)使目的基因在受体细胞中 并且可以 给下一代。 _, (4)基因表达载体中含有起始密码子和终止 密码子。 ( )(2)使目的基因能够 和发挥作用。 互动探究解疑难 要点归纳 重难突破 知识点一 目的基因的筛选与获取 思考讨论 (2)什么是引物?如果在某基因组定位了一 个目的基因X,但是其核苷酸序列未知，现已 知X邻近区域的上、下游的部分 DNA序列， 此时如何设计引物? 获取目的基因的方法很多，现在常用PCR 特异性地快速扩增目的基因。PCR 是聚合酶 链式反应的缩写，是根据 DNA 半保留复制的 原理，在体外提供参与 DNA复制的各种组分 与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大 量复制的技术。 (1)利用 PCR技术扩增目的基因需要提供哪 些条件? ⋯的 ?高中生物学·选择性必修3(人教版) (3)一个目的基因(DNA)分子在第 3次扩增 时，需要几种引物?需要几个引物? 2.PCR 中与引物有关的易错点 (1)设计引物的依据通常是目的基因两端的 核苷酸序列。 (2)用于 PCR 的引物长度通常为 20～30个 核苷酸。若引物长度过短，则引物与模板链 结合的特异性较差。 (4)研究发现，复性温度与设计的引物(如长 度、碱基组成)有关，请分析原因。 (3)两种引物须符合以下要求，否则引物失 效，得不到扩增产物。 ①每种引物内部不能发生局部碱基互补配 对，否则会导致自身折叠。 ②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配 对，否则会导致引物自连。(5)PCR技术扩增目的基因实际上是在体外 模拟 DNA 复制过程。请从酶的角度分析 PCR技术扩增 DNA与 DNA体内复制的不 同点。 (4)为了便于扩增的 DNA片段与表达载体 连接，需在引物的5端加上限制酶的酶切位 点，且常在两种引物设计上加入不同的酶切 位点，主要目的是保证目的基因与载体的正 向连接。 口能力强化 1.下列关于 PCR技术的说法不正确的是( ) 素养提升 A.PCR技术获取目的基因的前提是要有一 段已知目的基因的核苷酸序列 1.PCR技术与细胞内 DNA 复制的比较 比较项目 细胞内 DNA 复制 PCR技术 B. PCR 过程中只需要两个引物分子 C. PCR 的主要过程包括变性、复性、延伸， 其中延伸阶段需要耐高温的 DNA 聚 合酶 解旋 DNA 在高温下变 解旋酶催化 方式 性解旋 区别 场所 主要在细胞核内 细胞外 D.PCR 过程中 DNA合成方向是5′到3′ 耐高温的 DNA 聚 酶 解旋酶、DNA聚合酶 合酶 2.如图表示利用 PCR 技术扩增目的基因的部 分过程，其原理与细胞内 DNA 复制类似。 下列叙述错误的是 ( )控制 温度，需在不温度 细胞内温和条件 同温度下进行 变性扩增特定的 DNA 结果 合成整个 DNA分子 片段或基因 复性第一轮 循环 引物B①模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料：均为4种脱氧核苷酸 相同点 ③酶：均需要 DNA聚合酶 ④引物：都需要引物，使 DNA聚合酶从引 物的末端开始链的合成 引物AⅢ 延伸 变性 70 第3章 基因工程 A.从理论上推测，第二轮循环产物中含有引 物 A的 DNA片段占3/4 B.在第二轮循环产物中开始出现两条脱氧 核苷酸链等长的 DNA片段 C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对 则不能扩增目的基因 D.耐热的 DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷 酸连接到3'端 知识点二 基因表达载体的构建 思考讨论 构建基因表达载体是基因工程的核心步 骤。目的是让基因在受体细胞中稳定存在，并 且遗传给下一代；同时，使目的基因能够表达和 发挥作用。结合下列构建基因表达载体图解， 讨论解决相关问题： 质粒 外源DNA (3)构建基因表达载体时往往用两种限制酶 分别切割目的基因的两端以及载体，请分析 原因。 限制酶切割- -DNA连接酶- 基因表达载体 (1)为什么必须构建基因表达载体? 素养提升 1.启动子和终止子、起始密码子和终止密码子 的区别 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 成分 DNA片段 DNA mRNA上三 mRNA上三 片段 个相邻碱基 个相邻碱基 (2)假设图中利用同一种限制酶切割质粒和 外源 DNA片段，分别产生几个黏性末端? 位置 基因首端 基因尾端mRNA首端mRNA尾端 RNA 聚合 酶识别 和 结合 的 部 作用 位，驱动基 因转 录 出 mRNA 决定转录 翻译的 决定翻译 的结束 起始信号 过程的结束 2.基因表达载体的构建过程 (1)用同一种限制酶或能产生相同末端的限 制酶切割含目的基因的 DNA 和质粒，使其 产生相同末端。 71 ?高中生物学·选择性必修3(人教版) (2)将切下的目的基因片段与切开的质粒混 合，再加入适量 DNA连接酶，使目的基因插 入质粒的切口处，形成一个重组 DNA分子 (重组质粒)。构建过程如下图所示： 质粒 外源DNA 同一种限制酶切割 四环素抗性基因 BamH I 质粒 启动子 图1 Bel I BamHI Hind Ⅲ 氨苄青霉素 抗性基因 一个切口， 两个黏性末端 DNA连接酶— 基因表达载体 两个切口， 获得目的基因 BamH I 引物甲 Ⅲ HindⅢ 能力强化 3.(北京十一中期中)下列有关基因表达载体的 ( )叙述，错误的是 A.能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割” B.能协助目的基因在受体细胞中复制 C.含有启动子和终止子协助目的基因表达 D.基因工程的核心是构建基因表达载体 4.研究人员用图1中质粒和图2 中含目的基因的 片段构建重组质粒(图中标注了相关限制酶切 割位点),将重组质粒导入大肠杆菌后进行筛选 及PCR鉴定。以下叙述不正确的是 ( ) Bcl I 目的基因 引物丙 图2 引物乙 A.构建重组质粒的过程应选用 Bcl I 和 Hind Ⅲ两种限制酶 B.使用 DNA连接酶将酶切后的质粒和目的 基因片段进行重组 C.能在添加四环素的培养基上生存的一定 是含有重组质粒的大肠杆菌 D.利用PCR鉴定含目的基因的大肠杆菌时 应选用引物甲和引物丙 素养发展 探究应用 [情境_ SARS病毒是一种单链 RNA病毒，外面包 裹着衣壳蛋白和囊膜，囊膜上存在刺突蛋白，能 特异性识别细胞膜上的 ACE2 受体，从而感染 细胞。常用“荧光 RT-PCR技术”进行检测，方法 是取检测者的mRNA逆转录出cDNA,并大量 扩增，同时用荧光标记的 SARS病毒核酸探针 来检测 PCR 产物中是否含有 SARS病毒的 cDNA。请回答下列问题： 探究] (1)上述“荧光 RT-PCR技术”所用的试剂盒 中通常都含有哪些物质? (2)由于核酸检测比较费时费力，现已开发出 多款针对 SARS病毒的抗原或抗体检测试剂 盒，可在更短时间内得出检测结果。假如你 是一名科研人员，现提供SARS病毒刺突蛋 白基因、能产生专一针对 SARS病毒抗体的 72 B淋巴细胞及其他相关的生物学材料，请运 用现代生物技术，设计一款能够快速大规模 生产、针对 SARS病毒抗原或抗体检测的试 剂盒，简要写出生产试剂盒的设计思路(只写 出针对抗原或抗体检测的一种方案即可)。 基因工程的基本操作程序 第3章 基因工程 I课堂小结Ⅱ 目的基因 筛选合适的目的基因 利用PCR获取和扩增目的 基因 目的基因的 筛选与获取 基因表达载体的构建 目的 -组成 构建过程 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 随堂巩固促应用 验证反馈 迁移运用 1.判断正误，正确的打“√”,错误的打“×”。 (1)根据不同的需要，目的基因是不同的，但 都是能编码蛋白质的基因。 ( ) (2)PCR 过程需要 DNA连接酶和耐高温的 DNA聚合酶。 ( ) (3)PCR扩增区域由两种引物来决定。( ) (4)启动子和终止子都是 DNA分子中具有 调控作用的脱氧核苷酸序列。 ( ) (5)基因表达载体中的标记基因就是抗性 基因。 ( ) 2.聚合酶链式反应是一种体外迅速扩增 DNA片 段的技术。下列有关叙述不正确的是( ) A.变性过程中破坏的是 DNA分子内碱基对 之间的氢键，也可利用解旋酶实现 B.复性过程中引物与 DNA模板链的结合是 依据碱基互补配对原则完成的 C.延伸过程中需要加入 DNA聚合酶、4 种核 糖核苷酸 D.与细胞内 DNA复制相比，PCR所需酶的 最适温度较高 3.下列关于 PCR 反应体系中所加物质作用的 描述，错误的是 ( ) A.耐高温的 DNA聚合酶用于催化 DNA子 链的合成 B.引物使 Taq 酶能从引物的 5′端延伸 DNA链 C.目标 DNA 母链用作合成 DNA 复制的 模板 D.dNTP为PCR 提供能量和原料 4.对 RNA病毒进行检测时可以采用实时荧光 RT—PCR(逆转录聚合酶链式反应)的方法， RT一PCR的具体过程如图。下列叙述错误 的是 ( ),3 53 5mRN ① 3DA B5% ② 33' ③ 4455年3' 5 A.过程①以 mRNA为模板合成单链 DNA B.过程②③拟对单链cDNA进行 n次循环 的扩增，理论上需要 n个引物 B C.游离的脱氧核苷酸只能从引物的 3'端开 始连接 D.该技术用于对某些微量 RNA 病毒的检 测，可提高检测的灵敏度 5.某目的基因酶切后的末端为平末端，科研人 员利用基因工程技术，借助中间载体P将目 的基因接入载体E,如下图所示，回答有关 73 ?高中生物学·选择性必修3(人教版) 问题： 复制原点 载体P Xho I EcoR V复制原点 Pst I Sma I 启动子 载体E XhoI Kpn I Pst I 终止子抗性基因 抗性基因 =8ACEAC二 -GATATC一—CTATAG— —CTGCAG— —cCCGGG——GGTACC——CCATGG— KpmI —GACGTC一 —GGGCCC—smXho I PxIEcoR V (1)基因工程的操作步骤： →基 因表达载体的构建→将目的基因导入受 体细胞→ _。 (2)结合上图分析，需要借助中间载体P的主 要原因是 ; 载体P只能作为中间载体，是因为其没有 表达该目的基因的 。 (3)为了便于该目的基因接入载体E应选用 限制酶 和 。 (4)若将构建好的重组质粒导入大肠杆菌中， 需用 处理大肠杆菌，使其处于_ 状态。 (5)若要检测目的基因是否转录，常用 __方法检测。 提示、请完成《素能提升训练》训练十三 第 2课时 将目的基因导入受体细胞并进行检测与鉴定 [学习目标] 1.基于实例分析，掌握目的基因的导入和检测方法。 2.结合聚合酶链式反应(PCR)扩增 DNA片段并完成电泳鉴定实验，掌握实验原理和操作。 自主学习探新知 课前预习 双基落实 一、将目的基因导入受体细胞 1.转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细 胞内 和 的过程。 2.目的基因导入受体细胞的方法 (1)目的基因导入植物细胞 ①花粉管通道法 I.用微量注射器将含目的基因的 DNA 溶 液直接注入 中。 Ⅱ.在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头， 将 DNA 溶液滴加在花柱切面上，使目的基 因借 _进入 。 ②农杆菌转化法 I.农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染 __植物和 植物；农杆菌的Ti 质粒上的 _能够整合到所侵染细胞 的 上。 Ⅱ.转化方法：将目的基因插入农杆菌 中，让农杆菌侵染植物细胞。 (2)目的基因导入动物细胞 ①常用方法： 法。 ②常用受体细胞： _。 (3)目的基因导入微生物细胞 ①方法：用 处理细胞，使细胞处于一 种能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状 态，然后将重组表达载体导入其中。 ②常用受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是 大肠杆菌)。 二、目的基因的检测与鉴定 1.分子水平检测 (1)通过 等技术检测受体细胞染色 体 DNA上是否插入了目的基因或检测目的 基因是否转录出mRNA。 (2)从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗 体进行 杂交，检测目的基因 是否翻译成了蛋白质。 2.个体水平鉴定 包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗 性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产 品活性进行比较等。 74 能力强化 4.C 图1表示在上清液中加入体积相等的、预冷的体积 分数为95??酒精溶液，DNA析出，用玻璃棒搅拌卷 起的丝状物就是粗提取的 DNA,图 2 中溶液 b是 2 mol/L的 NaCl的溶液，作为鉴定 DNA的对照组，A 正确；图1所示操作的原理是 DNA不溶于酒精，而蛋白 质等杂质能溶于酒精，B正确；图2 试管1的作用是证 明2 mol/L NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色，C错误； 图 2 所示实验操作中有一处错误，试管 2 中未将 DNA 溶于2 mol/L的 NaCl溶液中，可能导致试管 2 中蓝色 变化不明显，D正确。 5.A 在 DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨 液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，再取上 清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清 液，A正确；研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA 在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程 中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错 误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以 上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较 为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺 加热后可能变蓝的干扰，D错误。 素养发展 探究应用 (1)提示：①遗传物质稳定，不容易突变，对受体细胞无 害；②含有1个至多个限制酶的酶切位点；③能进行自 我复制或整合到受体 DNA上，随受体 DNA同步复制； ④含有标记基因。 (2)提示：目的基因和腺病毒 DNA的化学组成和空间 结构相同(或具有相同的黏性末端或平末端)。 【随堂巩固促应用】 1.(1)×(2)×(3)√ (4)√ (5)× 2.B 限制酶能够识别并切割双链 DNA上特定的核苷酸 序列，多数限制酶能够识别由6个核苷酸组成的序列， 少数可以识别由4、5或者8个核苷酸组成的序列，A、C 错误；限制酶的化学本质是蛋白质，活性受温度影响， B正确；限制酶主要从原核生物中获得，同时在某些真 核生物(如酵母菌)细胞内也存在，D错误。 3.C T4 DNA 连接酶可用于连接黏性末端和平末端， A错误；E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补 的黏性末端连接起来，B错误；T4 DNA 连接酶既可以 连接黏性末端，又可以连接平末端，C正确；E.coli DNA 连接酶不能连接平末端，T4 DNA连接酶可连接平末端 但效率较低，D错误。 4.A 作为载体要携带目的基因进入受体细胞并使之表 达，必须能够在受体细胞内稳定地保存并大量复制，以 便通过复制提供大量目的基因。同时要具有某些标记 基因，是为了通过标记基因是否表达来判断目的基因是 否进入了受体细胞，从而进行筛选受体细胞。载体要具 有多个限制酶切割位点，则是为了便于与外源基因 连接。 5.D 利用 DNA不溶于酒精，而蛋白质溶于酒精，可将 DNA与蛋白质分离，A错误；高温能使蛋白质变性，对 DNA也有影响，B错误；将白色丝状物溶于2 mol/L的 NaCl溶液中，加入二苯胺并沸水浴加热才呈蓝色，C错 误；用二苯胺试剂鉴定提取的 DNA 时，需用沸水浴加 热，D正确。 6.解析 限制性内切核酸酶特异性切割 DNA分子，形成 互补的黏性末端，而将切割部位连接起来的是 DNA 连 接酶，形成的是磷酸二酯键。E.coli DNA连接酶只可 连接双链 DNA片段互补的黏性末端，而T4 DNA连接 酶还可连接平末端。原核生物容易受到自然界外源 DNA的入侵，但是生物在长期的进化过程中形成了一 套完善的防御机制，以防止外来病原生物的侵害。限制 酶就是细菌的一种防御性工具，当外源 DNA 侵入时， 细菌利用限制酶将外源 DNA切割掉，以保证自身的安 全，所以限制酶在原核生物中主要起切割外源 DNA并 使之失效的作用，从而达到保护自身的目的。 GAAAAG(或答案 (1)限制 性 内切核酸 -GAATTC-) 鸟嘌呤脱氧核苷酸 腺嘌呤脱氧核苷酸 磷酸二酯 黏性末端 (2)E.coli DNA 鸟嘌呤脱氧核苷酸 腺嘌呤脱氧核 苷酸 磷酸二酯 T4 DNA连接酶 (3)限制酶在原核生物体内主要起切割外源 DNA并使 之失效的作用，从而达到保护自身的目的 第 2节 基因工程的基本操作程序 第1课时 获取目的基因 并构建基因表达载体 【自主学习探新知】一、 1.(1)编码蛋白质(2)Bt基因 碱性(3)测序 序列 序列比对 2.(1)聚合酶链式反应 DNA半保留复制 参与 DNA复 制 目的基因的核苷酸序列(2)引物 脱氧核苷酸 耐高温的 DNA聚合酶(3)①受热变性后解为单链 ②两种引物 ③4种脱氧核苷酸 DNA 聚合酶 3 (4)指数 (5)琼脂糖凝胶电泳 二、 1.(1)稳定存在 遗传(2)表达 2.上游 RNA聚合酶 转录 目的基因 下游 标记 基因 3.限制酶 同种 能产生相同末端 DNA连接酶 概念检测 (1)√ (2)×(3)√ (4)× 【互动探究解疑难】 知识点一 思考讨论 (1)提示：需要模板、酶、原料、引物以及适宜的温度和 pH 等条件。即以 DNA 两条链为模板，在耐高温的 DNA聚合酶的作用下，4种脱氧核苷酸(A、T、C、G)作 为合成子链的原料，从引物的 3'端开始连接脱氧核苷 酸。反应过程中，缓冲溶液维持反应的 pH,并保证变 性、复性和延伸需要的适宜温度。 (2)提示：引物是一小段能与 DNA母链的一段碱基序 列互补配对的短单链核酸；虽然目的基因X的核苷酸 序列未知，但X临近区域的上、下游的部分 DNA 序列 已知，因此可根据X临近区域的上、下游已知序列设计 引物。 (3)提示：一个目的基因(DNA)分子在第 3次扩增时， 需要两种引物；第三轮是在第二轮的基础上进行的，第 二轮得到四个 DNA 分子，共八条链，因此需要8个 引物。 (4)提示：长度相同但 G—C含量高的引物需要设定的 复性温度较高；若复性温度过高，则会破坏引物与模板 13 的结合，可能导致 PCR 得不到任何扩增产物。 (5)提示：①PCR技术扩增 DNA不需要解旋酶；②PCR 技术需要的 DNA聚合酶应具有耐高温性。 能力强化 1.B PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目 的基因的核苷酸序列，用于延伸子链，A正确；PCR 过 程中只需要两种引物分子，每条新的子链延伸都需要一 个引物，B错误；PCR的主要过程包括变性、复性、延伸， 其中延伸阶段需要耐高温的 DNA聚合酶，C正确；PCR 过程中DNA合成方向是5′到3',D正确。 2.B 基因扩增中引物通常是一小段 DNA或RNA片段， 从理论上推测，第二轮中含引物 A的比例为3/4,第三 轮中占7/8,A正确；由于题图中的引物 A和引物B均 不在该片段的端点，因此第一轮循环后，得到的两 DNA 片段中两条脱氧核苷酸链都不等长；通过绘图可推知， 第二轮中亦不会出现等长的引物，所以在第二轮循环产 物中不会出现两条脱氧核苷酸链等长的 DNA片段，第 三轮循环产物中会出现，B错误；引物 A和引物 B必须 与目的基因配对，如果引物之间或引物自身发生碱基互 补配对则不能扩增目的基因，C正确；由于复制过程子 链的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸，所以耐热的 DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到 3′端， D正确。 知识点二 思考讨论 (1)提示：构建的基因表达载体中包含复制原点、启动 子、终止子等结构，可以控制目的基因的复制、转录等过 程，目的基因只有和载体结合成基因表达载体才容易在 受体细胞中稳定维持和表达，因此不能直接把目的基因 导入受体细胞，必须构建基因表达载体。 (2)提示：由图示可知，用同一种限制酶切割质粒，产生 一个切口，两个黏性末端；切割外源 DNA片段需要在 目的基因两侧分别切割，因此产生两个切口，四个黏性 末端。 (3)提示：如果用一种限制酶切割，目的基因两侧的末端 以及载体切口的两个末端都是互补的，因此连接时可能 会出现载体与载体、目的基因与目的基因、目的基因与 载体三种连接情况，而符合要求的只有载体与目的基因 的连接。 能力强化 3.A 基因表达载体不能防止目的基因被受体细胞限制 酶“切割”,A错误；基因表达载体在受体细胞中能够稳 定存在，并且自我复制，使目的基因数目扩增，B正确； 启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，能启动转录 过程；终止子控制着转录的结束，所以基因表达载体含 有的启动子和终止子可协助目的基因的表达，C正确。 4.C 选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但 BamH I可能使质粒中的两种标记基因都被破坏，因此 只能选 Bcl I和 HindⅢ两种限制酶切割，A正确；酶切 后的质粒和目的基因片段要用 DNA连接酶连接，构建 重组载体，B正确；能在添加四环素的培养基上生存的 也可能是只含有质粒的大肠杆菌，C错误；PCR技术要 求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反的 方向合成子链，故所用的引物组成为图 2 中的引物甲和 引物丙，D正确。 素养发展 探究应用 (1)提示：逆转录酶、热稳定 DNA 聚合酶、荧光标记的 核酸探针、引物、4种脱氧核苷酸、缓冲体系。 (2)提示：方案一(检测 SARS病毒抗原) 将能产生专 一针对 SARS病毒抗体的 B淋巴细胞与骨髓瘤细胞整 合，获得大量的单克隆抗体，并做成检测试剂盒用来检 测 SARS病毒。 方案二(检测 SARS病毒抗体) 将 SARS病毒的刺突 蛋白基因整合到载体上，利用基因工程获得大量的刺突 蛋白，并做成检测试剂盒用来检测(血浆中)SARS病毒 的抗体。 【随堂巩固促应用】 1.(1)×(2)×(3)√ (4)√ (5)× 2.C 变性过程中破坏的是 DNA分子内碱基对之间的氢 键，使 DNA双链得以打开，也可用解旋酶实现，A 正 确；复性过程中引物与 DNA模板链的结合是依据碱基 互补配对原则完成的，B正确；延伸过程需要耐高温的 DNA聚合酶、ATP、4 种脱氧核苷酸等参与，但这些物 质在反应前就已经加入了，C错误；PCR技术是在较高 温度下进行的，因此PCR与细胞内 DNA复制相比所需 的 DNA聚合酶具有更高的耐热性，D正确。 3.B 通过 PCR 技术扩增目的基因时，需要用耐高温 DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸聚合形成DNA子链， A正确；在复制时，引物与 DNA母链通过碱基互补配 对结合后，DNA聚合酶从引物的 3'端开始延伸 DNA 链，因此 DNA合成方向总是从子链的 5′端向 3'端延 伸，B错误；PCR 技术的原理是 DNA双链复制，DNA 复制时两条链均作为复制的模板，C正确；由于 dNTP 含有高能磷酸键，断裂后可以为PCR提供能量，同时产 生的脱氧核苷酸可提供原料，D正确。 4.B 过程①是由mRNA形成单链 DNA的过程，表示逆 转录，A项正确；过程②③拟对单链cDNA进行 n次循 环的扩增，根据 DNA分子半保留复制特点可知，该过 程理论上至少需要2"-1个引物 B,B项错误；游离的脱氧 核苷酸只能从引物的3'端开始连接，C项正确；利用实 时荧光 RT—PCR技术对某些微量 RNA病毒进行检测 时可提高检测的灵敏度，是因为增加了待测 RNA逆转 录产生的 DNA的数量(或浓度),D项正确。 5.解析(1)基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取 →基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→ 目的基因的检测与鉴定。(2)由图可知，由于载体E只 有产生黏性末端的酶切位点，而目的基因酶切后只能形 成平末端，使中间载体P接入载体 E,中间载体P既能 产生黏性末端，又能产生平末端，可同时连接载体E和 目的基因，载体P只能作为中间载体，是因为其没有表 达该目的基因的启动子与终止子。(3)由于载体E只有 产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体 P接入载体 E,同时防止载体 E自身环化，需要用两种限制酶分别 切割载体E和中间载体P,据图可知，中间载体P和载 体 E均含有 Xho I和 Pst I酶识别序列，故可选用 XhoI和PstI酶进行酶切，载体 P的这两种酶识别序 列中含有EcoRV识别位点，并且其切割的为平末端，可 以用于连接目的基因，Sma I酶虽然也能切割得到平末 端，但是其识别位点没有位于 Xho I和 Pst I酶识别位 点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割。(4)将 目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法，即用 Ca2+处理大肠杆菌，使其处于感受态。(5)目的基因的 检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染 14 色体的 DNA是否插入目的基因———DNA分子杂交技 术；②检测目的基因是否转录出了 mRNA--——分子杂 交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质————抗原— 抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴 定、活性鉴定等。 答案(1)目的基因的获取 目的基因的检测与鉴定 (2)载体E只有产生黏性末端的酶切位点，而目的基因 酶切后只能形成平末端，使中间载体P接入载体 E,中 间载体 P既能产生黏性末端，又能产生平末端，可同时 连接载体 E和目的基因 启动子与终止子 (3)Xho I和 Pst I EcoR V (4)Ca2+ 感受(5)分子杂交 第2课时 将目的基因导入受体细胞 并进行检测与鉴定 【自主学习探新知】一、 1.维持稳定 表达 2.(1)①I.子房 Ⅱ.花粉管通道 胚囊 ②I.双子叶 裸子 T-DNA 染色体 DNA Ⅱ.Ti质粒的 T-DNA (2)①显微注射 ②受精卵 (3)①Ca2+ 二、 1.(1)PCR (2)抗原—抗体 三、 1.(2)a.相反 b. DNA分子的大小 2.(2)0.8??1.2电泳槽 PCR 产物 指示分子 凝胶边缘 概念检测 (1)√ (2)×(3)√ (4)√ (5)×(6)√ 【互动探究解疑难】 知识点一 思考讨论 (1)提示：农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细 胞后，能将 Ti质粒上的 T-DNA(可转移的 DNA)转移 到被侵染的细胞，并且将其整合到该细 胞的染色体 DNA上。目的基因应该插入到 Ti质粒上的T-DNA片 段中，以便T-DNA携带目的基因转移到受体细胞的染 色体 DNA上。 (2)提示： 过程 第一次 第二次 将目的基因拼接 插入目的基因的 T-DNA 拼接 到 Ti质粒的 被拼接到受体细胞的染色 T-DNA上 体 DNA上(非人工操作) 将含目的基因的 含目的基 因的 T-DNA 导入 Ti质粒导入农杆 导入受体 细 胞染色体 菌 DNA(非人工操作) (3)提示：叶片，取下圆形小片与农杆菌共培养→筛选转 化细胞→组织培养技术→植株；花序，直接浸没在含有 农杆菌的溶液中一段时间→农杆菌侵染受精卵→等待 植株种子成熟→对种子进行筛选、鉴定。 (4)提示：不行。动物体细胞分化程度高，全能性受到限 制，因此一般采用受精卵作为受体细胞，受精卵导入目 的基因后才能发育成为转基因动物。 (5)提示：二者产生的人胰岛素氨基酸序列相同。生物 活性不相同。由于大肠杆菌是原核细胞，没有内质网和 高尔基体，缺乏修饰加工，因此大肠杆菌生产的人胰岛 素没有生物活性，需要后期加工。酵母菌属于真核细 胞，生产的人胰岛素具有生物活性。 能力强化 1.C 将目的基因导入受体细胞时，通过限制酶和 DNA 连接酶将目的基因和载体连接起来，然后导入受体细胞 中；将毒蛋白直接注射到棉受精卵中和将编码毒蛋白的 DNA序列注射到棉受精卵中都是不对的，没有载体的 协助，它们不能在受体细胞中表达。 2.A 将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转 化法，该方法适用于双子叶植物和裸子植物，故选 A。 知识点二 思考讨论 (1)提示：利用 PCR等技术检测棉花的染色体 DNA中是 否插入 Bt基因或检测 Bt基因是否转录出了mRNA。 (2)提示：不一定。可从转基因棉花中提取蛋白质，用相 应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测 Bt基因是否翻译 成 Bt抗虫蛋白等。用 Bt抗虫蛋白做抗原制备出相应 的抗体，然后用该种抗体与从转基因棉花中提取的蛋白 质(抗原)反应，检测是否发生抗原抗体的特异性结合， 如果出现特异性结合，说明翻译成功。 (3)提示：用导入抗虫基因的棉花叶片饲养棉铃虫，观察 棉铃虫是否死亡。 能力强化 3.C 将人的生长激素基因导入小鼠受精卵中，由受精卵 发育成的小鼠体细胞中都有人生长激素基因，A项正 确；将目的基因导入动物细胞，一般用显微注射法，B项 正确；人的生长激素基因要在小鼠膀胱中定点表达，需 要在构建表达载体时将人生长激素基因与小鼠膀胱中 特异表达基因的启动子重组后再导入受体细胞，C项错 误；采用抗原—抗体杂交技术可检测外源基因在小鼠细 胞内是否成功表达，D项正确。 4.A 目的基因在真核细胞中能否稳定遗传的关键是目 的基因是否插入核 DNA 中，A 错误；检测目的基因是 否导入受体细胞、是否转录出了 mRNA可采用 PCR 等 技术，B正确；目的基因能成功表达，说明其首端含有启 动子，D正确。 知识点三 思考讨论 (1)提示：避免外源 DNA等因素的污染。 (2)提示：过高浓度的引物可能引发错配，导致非特异性 扩增；4 种脱氧核苷酸浓度过高可能对扩增起抑制 作用。 (3)提示：①DNA 的分子大小；②琼脂糖浓度；③DNA 构象；④电场强度；⑤碱基组成与温度；⑥电泳缓冲液的 组成等。 (4)提示：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性 或容易聚合形成二聚体；复性温度过低；DNA 聚合酶不 耐高温等。 能力强化 5.D 分析题图，当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生 一种长度的 DNA 片段，说明该载体最有可能为环状 DNA分子；当用两种限制酶切割载体时，产生两种长度 的 DNA片段，说明两种限制酶在载体上至少各有一个 酶切位点，A、B正确；由题图可知，两种限制酶切割载体 时，产生600 bp和 200 bp 两种长度的 DNA片段，说明 两种限制酶的酶切位点最短相距 200 bp,C正确；限制 酶作用于磷酸二酯键，不作用于氢键和肽键，D错误。 6.A 琼脂糖凝胶的浓度会影响 DNA分子在凝胶中的迁 移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离 的 DNA片段大小来选择的。对于较大的 DNA片段， 比如基因组 DNA或质粒 DNA,通常选择较低浓度的琼 脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对 15