1.2.1微生物的培养技术及应用课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

Fermentation engineering Chapter I Microbial 2.1微生物的 培养技术 1 从生活中来 你自己在家制作过酸奶吗？ 你是如何制作酸奶的？遇到了哪些问题? 原因是什么？如何解决这些问题？ 应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。需要应用无菌技术和微生物的培养技术。 2 难以用肉眼观察的微小生物，包括 细菌、真菌、病毒及一些原生生物等。 本章提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。 一.微生物 原生生物 病毒 细菌 真菌 微生物: _________________________________是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。 防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物 2.在实验室培养微生物的基本要求： ①为微生物提供合适的营养 ③确保其他微生物无法混入 ②为微生物提供合适的环境条件 ④将需要的微生物分离出来 培养基 培养环境 无菌技术 分离培养 一.微生物 二.培养基的配制 【①概念】: 培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。 【②作用】: 用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。 【③类型】: 液体培养基：呈液体， 不含凝固剂（如琼脂）。 固体培养基：呈固体, 含凝固剂（如琼脂）。 【③类型】: 化学 成分来源 划分 培养基种类 特点 用途 功能用途划分 含化学成分不明确的天然物质 工业生产 分类、鉴定 天然培养基 合成培养基 用已知成分的化学物质配制 在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长 培养、分离出特定微生物 培养基中加入能与目的菌的代谢产物发生显色反应的指示剂，用以鉴别不同种类的微生物 鉴别不同种类微生物 选择培养基 鉴别培养基 二.培养基的配制 【任务一】 结合提供的资料和教材中“表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成”，分析培养微生物的培养基的种类和营养构成。 组分 含量 提供的主要营养 牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素 蛋白胨 10g 氮源和维生素等 NaCl 5g 无机盐 H2O 定容至1000mL 水 二.培养基的配制 【④基本成分】: 水、碳源、氮源和无机盐 无机碳源： I 碳源 有机碳源： CO2、CO32-、HCO3-等 葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等 无机氮源： II 氮源 有机氮源： NH4＋、NO3-、NH3等 牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等 自养微生物 异养微生物 注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源 * 一般情况下，不添加氮源培养基可用来培养_________微生物 Ca、K 、Mg等为大量元素 III 无机盐 Zn、Cu、Mn、Co、Mo等为微量元素 固氮 二.培养基的配制 【④基本成分】: 水、碳源、氮源和无机盐 特殊成分 : 还需pH、特殊营养物质 以及氧气的需求。 主要指生长因子：维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等 ●几种常见菌种对营养的特殊要求： ①培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加 。 ②培养霉菌时需将培养基的pH调至 。 ③培养细菌时将培养基的pH调至 。 ④培养厌氧微生物时需要提供 的条件。 维生素 酸性 中性或微碱性 无氧 思考：所有微生物是否都可以用培养基进行培养? 否。病毒是没有细胞结构的微生物,必须在活细胞内寄生并以复制的方式增殖,因此不能用培养基进行培养。 二.培养基的配制 牛肉膏：新鲜牛肉经过消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。 牛肉膏蛋白胨培养基（应用最广泛普通的细菌培养基） 蛋白胨：一般用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白（肉类）和植物蛋白（豆类）等两种。 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成 组分 含量 提供的主要营养 牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素等 蛋白胨 10g 氮源和维生素等 NaCl 5g 无机盐 H2O 定容至1000ml 水 思考：牛肉膏蛋白胨培养基是天然培养基 or 合成培养基？ 二.培养基的配制 11 成分不明确的天然物质。 成分明确。 表1 牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌)的营养组成 组分 含量 提供的主要营养 牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素等 蛋白胨 10g 氮源和维生素等 NaCl 5g 无机盐 H2O 定容至1000ml 水 表2 查氏培养基（培养霉菌）的营养组成 蔗糖（C12H22O11） 10g 硝酸钠（NaNO3） 3g 磷酸氢二钾（K2HPO4） 1g 硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.5g 氯化钾（KCl） 0.5g 硫酸亚铁（FeSO4·7H2O） 0.01g 琼脂 15～20g H2O 定容至1000mL ①天然培养基 ②合成培养基 蛋白胨 牛肉膏 二.培养基的配制 成分明确。用于分类、鉴定 成分不明确的天然物质。用于工业生产 牛肉膏是采用新鲜牛肉经过消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。 蛋白胨是一种外观呈淡黄色的粉剂。一般用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白（肉类）和植物蛋白（豆类）等两种。 微生物接种操作时为什么要“全副武装”和在专门的设备内进行？ 三.无菌技术 1.获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。 2.无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括消毒和灭菌。 ①消毒 成分明确。用于分类、鉴定 成分不明确的天然物质。用于工业生产 牛肉膏是采用新鲜牛肉经过消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。 蛋白胨是一种外观呈淡黄色的粉剂。一般用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白（肉类）和植物蛋白（豆类）等两种。 两个 方面 消毒 灭菌 对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒 将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌 三.无菌技术 使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。 煮沸消毒法 巴氏消毒法 化学药物消毒法 紫外线消毒 1. 消毒： 100℃煮沸5~6min。 可杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。 62~65℃煮30min或80~90℃下处理30s~1min,适合不耐高温的液体，如牛奶。不破坏牛奶的营养成分。 用70-75%酒精擦拭双手、 用氯气消毒水源等。 对接种室、接种箱或超净工作台用紫外线照射30min，以杀死物体表面或空气中的微生物。 三.无菌技术 用强烈的理化方法杀死物体内外的所有的微生物，包括芽孢和孢子。 某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成的抗逆性强的休眠体。芽孢萌发可形成细菌体。 芽孢 孢子 2. 灭菌: 细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的生殖细胞，能直接发育成新个体。 芽孢和孢子具有高度的耐热性，可抗化学药物和抗辐射。 三.无菌技术 2. 灭菌: 高压蒸汽灭菌锅，100kPa、121℃条件下维持15～30min。 ①湿热灭菌法 【原理】： 高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性。 【优点】： 操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的微生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。 基本保持培养基的营养成分不被破坏。 【对象】： 培养基、培养皿等 注：使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境。 三.无菌技术 2. 灭菌: 干热灭菌箱内160～170 ℃下加热2～3h。 干热灭菌法 【原理】： 使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等。 【对象】： 耐高温，需保持干燥的物品，适用于: 玻璃器皿 (如试管、培养皿、吸管、注射器) 金属器具 (如针头、 镊子、剪刀等)的灭菌 三.无菌技术 2. 灭菌: 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧 灼烧灭菌法 【效果】： 迅速、彻底 【对象】： 接种的金属工具如接种环、接种针，以及接种过程中的试管口或瓶口等易被污染部位。 【原理】： 使微生物燃烧 三.无菌技术 注意：消毒和灭菌工作之后 （1）避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。 （2）为避免周围微生物污染，实验操作都应在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。 消毒 VS 灭菌 对微生物作用效果 类型 理化因素作用强度 消灭微生物数量 芽孢和孢子能否被消灭 消毒 灭菌 较为温和 强烈 部分微生物 全部微生物 一般不能 能 三.无菌技术 1. 牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是什么？ 在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。 2 .为什么体积分数为70%～75%的酒精杀菌效果最好？ 若酒精浓度过高，菌体表面蛋白质变性过快而凝固成一层保护膜，酒精不能渗入其中；若酒精浓度过低，杀菌能力减弱。 3. 无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？ 无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。 想一想： 湿热灭菌（高压蒸汽灭菌） 干热灭菌 灼烧灭菌 化学药物消毒（酒精） 紫外线消毒 巴氏消毒法 1.以下所采用的灭菌或消毒方法依次是 化学药物消毒（次氯酸钠） 培养基 培养皿 接种环 实验操作者的双手 实验室 牛奶 有活性生物材料 巩固提升 2．下列有关无菌技术的说法，正确的是(　　) A．无菌技术的关键是杀灭实验室中的所有的微生物 B．培养微生物的试剂和器具都要进行湿热灭菌 C．经巴氏消毒法处理的食品因微生物未被彻底消灭，不能常温长期保存 D．无菌技术中，若处理对象为液体，则只能消毒，不能灭菌 3.(2021·天津等级考)下列操作能达到灭菌目的的是(　　) A.用免洗酒精凝胶擦手 B.制作泡菜前用开水烫洗容器 C.在火焰上灼烧接种环 D.防疫期间用石炭酸喷洒教室 巩固提升 C C 四.微生物的纯培养 请同学们自主阅读教材P11-13，完成以下问题： 1.相关概念：培养物？纯培养物？纯培养？（P11） 2.什么是菌落？单菌落？（P12） 3.获得单菌落的方法？（P12） 4.酵母菌的纯培养的基本步骤？（注意倒平板和接种的具体操作） 四.微生物的纯培养 纯培养物 培养物 纯培养 在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含有特定种类微生物的群体。 获得纯培养物的过程。 由单一个体繁殖所获得的微生物群体。 配制培养基 灭菌 倒平板 接种和分离 培养 制 备 培 养 基 25 四.微生物的纯培养 １. 实验原理 分散或稀释 繁殖 单个细胞 微生物群 单个菌落 ①分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。 念珠菌显色培养基 大肠杆菌培养基 酵母菌培养基 金黄色葡萄球菌和枯草杆菌培养基 一个菌落就是一个种群。 鉴别菌种：菌落的大小、形状、颜色、透明度、光泽度等是鉴定菌种的重要依据。 26 四.微生物的纯培养 １. 实验原理 分散或稀释 繁殖 单个细胞 微生物群 单个菌落 ②采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，　　 　之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。 稀释涂布平板法 平板划线法 27 四.微生物的纯培养 2. 实验目的 ① 学会配制培养酵母菌的培养基并倒平板 ② 学会进行无菌操作 ③ 尝试通过平板划线操作来获得纯化的酵母菌菌落 3. 材料用具 ①酵母菌培养液、马铃薯、葡萄糖(或蔗糖)、琼脂、蒸馏水 ②天平，小刀，纱布，烧杯，锥形瓶，棉塞、牛皮纸（或报纸） ③皮筋，培养皿，接种环，酒精灯，超净工作台 ④高压蒸汽灭菌锅，干热灭菌箱和恒温培养箱等 28 四.微生物的纯培养 配制培养基 称取去皮的马铃薯200g 切成小块 加水1000mL，加热煮沸至马铃薯软烂。 纱布过滤 得到滤液 滤液中加入20g葡萄糖，15~20g琼脂。 用蒸馏水定容至1000mL 4. 方法步骤 29 四.微生物的纯培养 配制培养基 灭菌 将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞。 包上牛皮纸， 并用皮筋勒紧。 压力100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15 ~ 30min。 取5 ~ 8套培养皿 培养皿叠成一束 用几层牛皮纸包紧 放入干热灭菌箱内，160 ~ 170℃灭菌2h。 4. 方法步骤 30 四.微生物的纯培养 配制培养基 灭菌 倒平板 培养基冷却到50℃左右，在酒精灯火焰附近倒平板。 倒平板： 刚刚不烫手 1 拔出锥形瓶的棉塞。 3 用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基倒入培养皿（10～20mL），立即盖上皿盖。 4 等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。 2 将瓶口迅速通过火焰。 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基 不能完全打开，以免杂菌污染培养基 防止皿盖上冷凝水滴落，造成污染。 4. 方法步骤 31 四.微生物的纯培养 （1）培养基灭菌后，需冷却至50 ℃左右时才能倒平板，温度过高会烫手，温度过低培养基又会凝固。 （2）整个操作在酒精灯火焰旁附近进行，避免周围环境中微生物的污染。 （3）平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 （4）倒平板时不要将培养基溅在皿盖与皿底之间，否则此培养基不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。 （5）将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。 【倒平板的注意事项】 倒平板注意事项： ①温度：50℃左右 ②操作：在酒精灯火焰附近 ③冷凝后平板倒置 32 四.微生物的纯培养 配制培养基 灭菌 倒平板 接种和分离 分离的方法 ——平板划线法 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经过数次划线后培养，可以分离到单菌落。 连续划线法 分区划线法 4. 方法步骤 33 四.微生物的纯培养 ①灼烧接种环，直至金属丝烧红 ⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞。 ②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞 ③试管口通过火焰 ④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液。 ⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。 ⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。 分离的方法 ——平板划线法 防止温度太高杀死菌种 1 2 3 4 5 分区划线法 34 四.微生物的纯培养 【平板划线法注意事项】 1.接种环蘸取________次菌液，但要在培养基_______位置连续划线______次 2.划线________(可以/不可以)将最后一次的划线与第一次的划线相连。 3.每次 划线前灼烧接种环 进行灭菌；划线操作 结束后，仍需灼烧接种环。 仅一 不同 多 不可以 1. 划五次线，接种环需要灼烧几次？ 6次。 【思考与讨论】 1 2 3 4 5 35 （1）取菌种前灼烧： （2）每次划线前灼烧： （3）接种结束后灼烧： 思考：为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环的原因。 2. 灭菌，杀死接种环上原有微生物。 杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞。 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 【思考与讨论】 【思考与讨论】 5. 为什么划线时要注意不能划破培养基？ 3. 除第一次划线外，每次划线都从上一次划线的末端开始，目的是什么？ 将聚集的菌种进行稀释，以便获得单菌落。 ①一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的； ②存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。 4. 为什么不能将最后一次的划线与第一次的划线相连？ 第一次划线酵母菌数量多，最后一次划线酵母菌数量少，首尾相连，不容易得到单个菌落。 37 四.微生物的纯培养 配制培养基 灭菌 倒平板 接种和分离 培养 完成平板划线后，待菌液被培养基吸收， 将接种后的平板和一个未接种的平板 倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24~48h。 培养酵母菌: 划3个平板（重复实验）和1个不划线（空白对照） 防止皿盖上冷凝水滴落，造成污染。 在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。 警示 38 四.微生物的纯培养 【分析评价】： 在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？ 这些菌落的颜色、大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？ 正常情况下，菌落的颜色、大小是一致的。 如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。 正常情况下，未接种的培养基表面应该没有菌落生长， 如果有，说明培养基被杂菌污染。 39 微生物的纯培养实验视频 配制培养基 灭菌 倒平板 接种和分离 培养 请点击图片，观看视频 40 培养基的类型 培养基的营养物质 ——消毒、灭菌 微生物的基本培养技术 培养基 无菌技术 基本成分：碳源、氮源、水、无机盐 特殊需求：维生素（如乳酸杆菌）、碱基等 微生物的纯培养 制备培养基 接种与分离 培养 平板划线法 课堂小结 41 课堂检测 1.倒平板后，待平板冷凝之后需将其倒置( 　) 2.倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上 ( 　) 3.若皿盖和皿底之间溅上培养基，这个培养基不可再用( 　) 4.为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落( 　) 5.平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧( 　) 6.培养微生物的温度因菌种不同而稍有差异 ( 　) × √ × √ √ 7.下列关于平板划线的操作，正确的是（ ） A. 每次划线前都要蘸取菌液 B. 灼烧接种环后，要立即用接种环接种 C. 平板划线操作时划出了五个区域菌落数逐渐增多 D. 接种前，要将菌种试管口通过火焰 D √ 42 课堂检测 8. 如表是某微生物培养基的成分及含量,请据此回答下列问题: (1)上表培养基可培养的微生物类型是_______________ 。 (2)若除去成分②,加入(CH2O),该培养基可用于培养____________。 (3)表中营养成分共有________类。 (4)使用后的培养基在丢弃前,要进行的是__________。 (5)题表中各成分含量确定的原则是__________________________。 (6)若要利用题表培养基观察菌落,应该增加的成分是_________________。 自养型微生物 固氮微生物 3 灭菌 依微生物的生长需要确定 琼脂(或凝固剂) 43 $$