第54讲 基因工程-【高效备考】备战2025年高考生物一轮复习精品课件

第54讲 基因工程的基本工具和基本操作程序 一、重组DNA技术的基本工具 二、基因工程的基本操作程序 三、DNA的粗提取与鉴定 课标要求 核心素养 1．阐明基因工程的原理及技术(含PCR技术)。 2．举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的应用。 3．概述蛋白质工程的原理及应用。 4．实验：DNA的粗提取与鉴定。 1. 生命观念：举例说出植物基因工程、动物基因工程成果及其给人类带来的影响；说明基因的碱基排列顺序—蛋白质的结构—蛋白质功能的关系。 2．科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。 3．社会责任：认同蛋白质工程的重要意义。 一、重组DNA技术的基本工具 1.基因工程(重组DNA技术)概述 基因 分子水平 基因重组 赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品 定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍 原理： 操作对象： 操作水平： 结果： 意义： 转基因等技术 操作技术： DNA重组技术的基本工具(三种“分子工具”) 工具酶 准确切割DNA分子的”分子手术刀” 将DNA片段再连接起来的”分子缝合针” 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的 ”分子运输车” 载体 限制酶 DNA连接酶 剪切 拼接 导入 表达 一、重组DNA技术的基本工具 2.重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) 2.重组DNA技术的基本工具 来源： 特点： 结果： 主要是从原核生物中分离纯化来的 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 ②产生平末端 ①产生黏性末端 黏性末端 G C A A T T T A T A C G 5' 3' 3' 5' G C T T A A A A T T C G 平末端 C G C C G G G C G C G C 一、重组DNA技术的基本工具 [易错提醒]　限制酶作用的化学键是磷酸二酯键，不是氢键；在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割2次此DNA分子，产生4个末端。 (2)DNA连接酶 作用： 类型： 将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 E.coliDNA连接酶 T4 DNA连接酶 只连接黏性末端 缝合黏性末端和平末端（效率较低） 来源： 大肠杆菌 作用： 来源： 作用： T4噬菌体 一、重组DNA技术的基本工具 2.重组DNA技术的基本工具 (3)载体 环状双链DNA分子 种类： 特点： 作用： 质粒(常用载体)： 将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制 动植物病毒 噬菌体 ①稳定存在并能自我复制，或整合到受体DNA上同步复制 ②有一个至多个限制酶切割位点 ③具有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选 一、重组DNA技术的基本工具 2.重组DNA技术的基本工具 [易错提醒]　与膜载体的区别：基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。 　　　项目 种类　　　 作用部位 作用结果 图示 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA(水解)酶 解旋酶 磷酸二酯键 形成黏性末端或平末端 磷酸二酯键 连接DNA分子片段 磷酸二酯键 形成新DNA分子 磷酸二酯键 形成脱氧核苷酸 碱基对间的氢键 形成单链DNA分子 与DNA相关的五种酶的比较 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 基因工程 DNA复制 在两个DNA片段间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键 DNA连接酶和DNA聚合酶 如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。 所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 (1)不破坏目的基因原则： (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则： 限制酶的选择原则 通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ； 为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接）可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。 (3)确保出现相同黏性末端原则： 限制酶的选择原则 (1)EcolⅠ是一种 ,其识别序列是 ,切割位点是 与 之间的 键。切割结果产生的DNA片段末端形式为 。 (2)不同来源的DNA片段结合,在这里需要的酶应是 连接酶,此酶的作用是在 与 之间形成 键,而起“缝合”作用的。还有一种连接平末端的连接酶是 。 情境分析 限制酶 -GAATTC- 磷酸二酯键 黏性末端 E.coli DNA G A 磷酸二酯键 T4DNA连接酶 右图为DNA分子的切割和连接过程 G A (1)限制酶只能用于切割目的基因(　　) (2)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(　　) (3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(　　) (4)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因(　　) (5)E.coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(　 ) (6)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。( )　　　 (7)DNA连接酶能将两碱基间的氢键连接起来（ ） (8)限制酶也可以识别和切割RNA（ ） (9)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体（ ） 1.(2023·高考新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3 和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限 制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以 构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 √ 2.(2024·辽宁丹东高三质检)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(TetR)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题： (1)EcoRⅤ酶切位点为 ，EcoRⅤ酶切出来的线性载体P1为____末端。 解析：由题图可知，EcoR Ⅴ酶切出来的载体质粒为平末端。 平　 (2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为____________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质粒P3。 解析：由题图可知，目的基因的两端各有一个游离的腺嘌呤脱氧核苷酸，由于载体P1为平末端，所以载体P1的两端应该各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸，这样在DNA连接酶的作用下才能把目的基因和载体P1连接起来。 胸腺嘧啶(T) DNA连接　 (3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况见下表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是____(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_______________、___________________。 平板类型 菌落类型 A B C 无抗生素 ＋ ＋ ＋ 氨苄青霉素 ＋ ＋ － 四环素 ＋ － － 氨苄青霉素＋四环素 ＋ － － B　 A类菌落含有P0　 C类菌落未导入质粒　 (4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物，结果从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp 片段，原因是___________________。 乙、丙　 目的基因反向连接 选择Ti质粒做载体的原因是什么? Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上 MAP30蛋白是一种能使Ⅰ型核酸核糖体失活的蛋白质，实验表明MAP30蛋白具有抗pvx病毒功能，为培育高效表达该基因的马铃薯新品种，科研团队利用农杆菌转化法将MAP30基因导入马铃薯细胞内 构建基因表达载体时为避免反向拼接应选择哪种酶识别切割质粒? Xbal和Hindlll 个体水平上，检测转基因马铃薯是否具有抗病毒的特性，具体做法是? 向转基因马铃薯植株和非转基因马铃薯植株接种pvx病毒，观察并对比它们的感染情况 情境分析 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 提取 表达Bt基因 导入 与载体拼接 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建（核心） 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 Bt基因 苏云金杆菌 请表述出培育转基因抗虫棉的四个步骤 二、基因工程的基本操作程序 二、基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 (1)目的基因： ①从相关的已知 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一 结构和功能清晰 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 (2)明确目的基因的方法： ②利用 和序列比对工具进行筛选。 序列数据库 ①通过构建基因文库来获取目的基因 前提： 基因比较小、核苷酸序列已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成 ③利用PCR特异性地快速扩增目的基因 ②人工合成目的基因 方法： (3)获取目的基因的方法 二、基因工程的基本操作程序 是一项在生物体外_____________________的核酸合成技术。 ②原理：_________________。 复制特定DNA片段 DNA半保留复制 (4)利用PCR获取和扩增目的基因 ①含义： ③条件： DNA模板： 引物(2种): 四种脱氧核苷酸： 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 提供DNA复制的模板 合成子链DNA的原料 Taq DNA聚合酶: 缓冲溶液: 一般添加Mg2+,激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶(催化形成磷酸二酯键) 1.目的基因的筛选与获取 ④PCR扩增过程： 变性 复性 延伸 90℃以上，双链DNA解聚为单链 50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。 ⑤PCR的结果： ⑥PCR产物的鉴定： 常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 每次循环后目的基因的量增加一倍,即成____形式扩增(约为2n) 二、基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 指数 [易错提醒]　变性过程双链DNA解聚为单链不需要解旋酶。 PCR技术与DNA复制过程比较 PCR技术 DNA复制 相同点 原则 原料 条件 不同点 解旋方式 场所 酶 结果 碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制 细胞内（主要在细胞核内） 耐高温的DNA聚合酶 解旋酶、DNA聚合酶 大量的DNA片段 形成整个DNA分子 1.PCR循环图示与规律 注：第三轮循环后，开始出现双链等长的目的基因片段。 循环次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物A(或B)的DNA分子数 1 3 7 2n－1 同时含引物A、B的DNA分子数 0 2 6 2n－2 共消耗的引物数量 2 6 14 2n＋1－2 1.PCR循环图示与规律 2.筛选出含有目的基因的受体细胞 (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如下图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。 2.筛选出含有目的基因的受体细胞 (3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如下图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如下图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如下图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 ① ; ② 。 启动子： RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录。 终止子： 终止转录 （1）构建基因表达载体的目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代 使目的基因能够表达和发挥作用 （2）组成 标记基因： 目的基因： 复制原点： 鉴别或筛选含有重组DNA分子的受体细胞 目的基因必须插入到 与 之间。 终止子 DNA复制的起始位点。 载体的种类： 质粒（常用）、噬菌体、动植物病毒 启动子 二、基因工程的基本操作程序 2.基因表达载体的构建——基因工程的核心 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 ______ _____ _______ _______ 位置 功能 ________________________________________________ ____________________________ _____________________ ________________________ DNA DNA mRNA mRNA RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸) 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 载体 （质粒） DNA分子 （含目的基因） 限制酶处理 带有黏性末端或平末端的切口 带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段 DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种 二、基因工程的基本操作程序 (3)基因表达载体的构建过程 2.基因表达载体的构建——基因工程的核心 [易错提醒]　若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：目的基因与目的基因连接；目的基因与质粒连接；质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。 二、基因工程的基本操作程序 3.将目的基因导入受体细胞 只有该步骤没涉及碱基互补配对原则 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 处理法 受体细胞 ________________ _______ 转化过程 农杆菌转化法 花粉管通道法（我国创造） 体细胞或受精卵 受精卵 Ca2＋ 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 显微注射法 原核细胞 表现出新性状的植株 植物组织培养 第一次导入 第二次导入 第一次拼接 第二次拼接 将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA上。 (非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 被拼接到受体细胞的染色体DNA上。 (非人工操作)含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞。 将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。 Ti质粒 T—DNA 目的基因 构建基因表达载体 重组 Ti质粒 转入农杆菌 导入植物细胞 农杆菌转化法 农杆菌转化法 二、基因工程的基本操作程序 3.将目的基因导入受体细胞 [易错提醒]　农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：第一次拼接是指将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指将插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是指将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。 二、基因工程的基本操作程序 类型 检测内容 方法 分子水 平的检测 个体生物学水平的鉴定 受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 目的基因是否转录出了mRNA PCR等技术 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原-抗体杂交技术 个体是否具有相应性状 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 4.目的基因的检测与鉴定 [易错提醒]　分子水平检测是否插入了目的基因和是否转录出了mRNA时，都遵循碱基互补配对原则；都使用基因探针，探针是放射性同位素或荧光标记的含目的基因的单链DNA片段。 (1)根据不同的需要，目的基因是不同的，但都是能编码蛋白质的基因(　　) (2)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制(　　) (3)表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点(　　) (4)PCR反应中温度的周期性改变是为了使DNA聚合酶催化不同的反应(　　) (5)农杆菌特点能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。( ) (6)用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物（ ） (7)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列（ ） (8)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体（ ） (9)应用PCR技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达（ ） 考向1　PCR及应用 1.(2024·广东梅州联考)PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP(四种脱氧核苷三磷酸)是DNA合成的原料。下列相关说法错误的是(　　) A．图示环节所需的温度比上一个环节的低 B．dNTP作为扩增的原料会依次连接到3′端 C．Taq DNA聚合酶催化磷酸二酯键的形成 D．经过1个循环后，获得的子代DNA的双链中脱氧核苷酸数量相同 √ 2. (2024·江苏百校联考）重叠延伸PCR是一种通过寡聚核苷酸链之间 重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR 扩增，获得目的基因的方法。该技术在扩增较长 片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的 定点诱变等方面具有广泛的应用前景，下图表示 利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。 下列叙述错误的是(　　) A．引物中G＋C的含量越高，引物与模板DNA结合的稳定性越高 B．在第一阶段由于引物2和引物3发生碱基互补配对，因此两者置于不同反应系统中 C．引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行一次复制后，共产生4种双链DNA分子 D．在引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图示双链DNA，至少要经过2次复制 √ 考向2　基因工程的操作程序 3. (2024·中原名校联盟）某质粒上有Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如下图所示。请回答下列问题： (1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是________；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为_______。该方法中农杆菌的作用是____________________________________________ ______________。 (2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ两种酶的好处是___________________________________ _________________________________________________________________。 Ti质粒　 T-DNA　 感染烟草细胞，把目的基因插入烟草细胞的染色体DNA上　 防止目的基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率，防止目的基因与质粒反向连接　 (3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已有目的基因？_____(填“是”或“否”)。为什么？_______________________________ __________________________。 含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏 否　 (4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如下图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。 答案： 4.(2024·湖北高三联考)基因敲减主要是指从转录水平或翻译水平使基因表达失活的技术，其中RNA干扰技术是常用的基因敲减技术，该技术首先要根据目的基因序列设计出反义RNA和正义RNA构建成双链RNA(shRNA)，然后用相关酶切割shRNA形成反义RNA片段，其可与目的基因转录的mRNA碱基互补配对，进而诱导相关酶水解mRNA，实现对基因的敲减。为检测设计出的shRNA是否能成功敲减基因还需要利用荧光酶报道基因系统进行验证。 图1表示敲减载体构建，图2表示荧光酶报道基因系统检测的原理。回答下列问题： (1)据图1分析，若要从含shRNA基因的DNA分子中扩增出shRNA基因并能使其在受体细胞中表达，则需要用到的引物是____________________，为使扩增出的shRNA基因能够和质粒构建敲减载体，在设计引物时需在引物的____ (填“5′”或“3′”)端分别添加__________________酶能够识别的序列。 解析：若要从含shRNA基因的DNA分子中扩增出shRNA基因并能使其在受体细胞中表达，则应包含启动子、终止子序列，且应在模板的3′端结合引物，故需要用到的引物是引物2、引物5；由题意可知，shRNA是根据目的基因序列设计出反义RNA和正义RNA构建而成的，结合题图1中限制酶的切割位点可知，为使扩增出的shRNA基因能够和质粒构建敲减载体，在设计引物时需在引物的5′端分别添加BamHⅠ、Hind Ⅲ酶能够识别的序列。 引物2、引物5 5′ BamHⅠ、Hind Ⅲ (2)已知mRNA末端缺失会导致mRNA水解。荧光酶报道基因与欲敲减的目的基因串联可构成荧光酶报道基因系统，荧光酶报道基因与目的基因的连接点是终止密码子对应的序列，而不是终止子，其原因是 __________________________________________________________________________________。 解析：终止子是一段特殊的DNA序列，位于基因的下游，转录过程在终止子处会终止，若连接点为终止子则不能实现两基因的mRNA的串联，故荧光酶报道基因与目的基因的连接点是终止密码子对应的序列，而不是终止子。 转录过程在终止子处会终止，若连接点为终止子则不能实现两基因的mRNA的串联　 (3)荧光酶报道基因系统与敲减载体一同导入受体细胞中可以根据荧光的有无检测敲减载体是否成功敲减目的基因，其机理是_________________________________________________________________ _____________________________________________________________。 解析：由题意可知，若敲减载体能够敲减目的基因，则荧光酶报道基因和目的基因转录形成的mRNA会被水解，荧光酶报道基因不能正常表达，无法检测到荧光，故荧光酶报道基因系统与敲减载体一同导入受体细胞中可以根据荧光的有无检测敲减载体是否成功敲减目的基因。 若敲减载体能够敲减目的基因，则荧光酶报道基因和目的基因转录形成的mRNA会被水解，荧光酶报道基因不能正常表达，无法检测到荧光 三、DNA的粗提取与鉴定 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 (1)提取的基本思路： (2)实验原理： ③在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 DNA溶解度 NaCl浓度 0.14mol/L 2mol/L ①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 ②DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同， 能溶于2mol/L NaCl溶液。 1.DNA的粗提取 DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。 能否选用牛、羊、马、猪等哺乳动物的红细胞做实验材料？ 注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。 (3)选材： 三、DNA的粗提取与鉴定 1.DNA的粗提取 三、DNA的粗提取与鉴定 (4)试剂： 试剂 作用 研磨液 体积分数为95%的酒精 2mol/L 的NaCl溶液 二苯胺试剂 蒸馏水 析出DNA 溶解DNA 鉴定DNA，要现配现用 1.DNA的粗提取 三、DNA的粗提取与鉴定 (1)取材研磨： (破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中) （5）方法步骤 抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出； (2)过滤或离心取上清液： 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。 直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。 上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？ 低温放置几分钟的作用： 方法一： 方法二： 1.DNA的粗提取 称取30g洋葱,切碎,然后放入研钵中,倒入10mL研磨液,充分研磨 可能含有核蛋白、多糖等杂质 三、DNA的粗提取与鉴定 (3)预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分； 方法一： 3.方法步骤 搅拌时应轻缓、并沿一个方向： 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子 低温抑制核酸水解酶活性,抑制DNA降解;低温抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；低温有利于增加DNA的柔韧性，减少断裂。 将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。 方法二： [易错提醒]　加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状物；本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)，可选用鸡血细胞作为材料。 酒精预冷的作用： 三、DNA的粗提取与鉴定 组别 试剂 处理 结果 对照组 实验组 (4)NaCl溶液溶解DNA并鉴定 实验组 对照组 水浴加热 溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关。 2mol/L的NaCl溶液5mL 2mol/L的NaCl溶液5mL 4mL的二苯胺试剂 4mL的二苯胺试剂 丝状物或沉淀物 3.方法步骤 三、DNA的粗提取与鉴定 (1)如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？ 将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。 利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。 进一步纯化DNA——用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。 4.进一步探究 (2)有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？ (3)有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？ 三、DNA的粗提取与鉴定 (1)取材原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。 (2)过滤含DNA的研磨液时不能用滤纸代替纱布，否则会因DNA被吸附到滤纸上，而导致DNA大量损失。 (3)鉴定DNA用的二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。 (4)在DNA进一步提纯时，选用预冷的95%的酒精的作用是溶解杂质和析出DNA。 (5)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。 三、DNA的粗提取与鉴定 2.DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)原理 ①PCR原理： ②电泳 在电场的作用下，带电分子向着与它所带电荷相反的电极移动的过程。 概念 DNA的热变性原理，即通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 原理 在凝胶中DNA分子迁移的速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关。 作用过程 带电性质差异 分子本身大小不同 分子本身性状不同 迁移速率不同 各种分子分离 方法 琼脂糖凝胶电泳（PCR产物一般都通过琼脂糖凝胶电泳鉴定） 三、DNA的粗提取与鉴定 (2)方法步骤 ①PCR扩增 准备→移液→混合→____________→反应。 离心 2.DNA片段的扩增及电泳鉴定 ②鉴定PCR产物：琼脂糖凝胶电泳法 配制琼脂糖溶液→制备琼脂糖凝胶→将电泳缓冲液加入电泳槽中→加样→电泳→取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 考向1　DNA的粗提取与鉴定 1.(2024·广东一模)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是(　　) A．新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取 B．DNA不溶于体积分数为95%的冷酒精而溶于 2 mol/L 的NaCl溶液 C．在研磨植物细胞时加入研磨液是为了溶解细胞壁 D．溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后即呈蓝色 √ 2. (2024·贵州遵义联考)下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，下列相关叙述正确的是(　　) A．图1中的丝状物不含有DNA B．图2所示实验操作中有一处明显错误， 可能导致试管2中蓝色变化不明显 C．图1所示操作的原理是DNA溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶酒精 D．图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 mol/L 的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色 √ 考向2　DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是(　　) A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理 B．PCR利用了DNA的热变性原理 C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化 D．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换 √ 4.在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如下图所示。以下相关叙述中，错误的是(　　) A．该载体最可能为链状DNA分子 B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点 C．限制酶R1与R2的切点最短相距约200 bp D．限制酶作用位点会导致磷酸二酯键断裂 √ 1.(2021·高考全国卷乙)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如下图所示。  回答下列问题： (1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA 连接酶。上图中__________________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中__________________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。 解析：E.coli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来。T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。 EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ　 EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ　 经典真题 经典真题 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。 解析：DNA连接酶通过催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键，将目的基因片段与质粒载体片段连接起来。 磷酸二酯键　 经典真题 (3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能__________；质粒DNA分子上有__________________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是____________________________________________________。 解析：作为载体，质粒DNA分子上必须有复制原点，才能使质粒在受体细胞中能进行自我复制；质粒DNA分子上应具有一个至多个限制酶切割位点，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因，可以用添加特定抗生素的选择培养基培养经转化处理的宿主细胞，以达到筛选的目的。 自我复制　 一个至多个限制酶切割位点　 用添加特定抗生素的选择培养基培养已转化处理的宿主细胞　 经典真题 (4)表达载体含有启动子，启动子是指________________________________ ________________________________________________________________________________________。 解析：启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，RNA聚合酶与该区域结合可驱动基因转录出mRNA。 位于基因的上游、一段有特殊序列结构的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA 经典真题 2.(2022·广东选择考)“绿水逶迤去，青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。回答下列问题： (1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对________，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。 解析：利用PCR技术扩增目标酶基因的前提是根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物。 引物　 经典真题 (2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是__________________________________________，终止子的作用是_____________________________________。 解析：基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。终止子可终止转录，使转录在所需要的地方停下来。 作为标记基因，筛选含有目的基因的受体细胞　 终止转录，使转录在所需要的地方停下来　 经典真题 (4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了______________，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于_________ ___________________________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 解析：根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染排放企业排出的CO2等一碳温室气体为原料生产丙酮，实现了废物的资源化，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，利用该技术生产丙酮的过程中不仅不排放CO2，还可以消耗工业废气中的CO2，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 废物的资源化　 不仅不排放CO2，还可以消耗工业废气中的CO2 经典真题 3.(2023·山东等级考)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 经典真题 (1)与图甲中启动子结合的酶是___________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有____________________________________ ________________________(答出2个结构即可)。 解析：RNA聚合酶与图甲中启动子结合开始转录。作为载体必须具备的条件：要具有限制酶的切割位点；要有标记基因(如抗生素抗性基因)，以便于重组质粒的筛选；具有复制原点，能在宿主细胞中稳定存在并复制；是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。题图甲有启动子和终止子，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点。 RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点(答出2个结构即可)　 经典真题 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物_________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的______(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 F2和R1(或F1和R2)　 a链　 经典真题 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了________________，条带2所检出的蛋白_______(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 解析：据题图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J－V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 J－V5融合蛋白　 不是 $$