第3章 第2节 第1课时 获取目的基因并构建基因表达载体(课件PPT)-【勤径学升】2024-2025学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程同步练测（人教版2019）

单击此处添加文本具体内容 第3章　基因工程 第2节　基因工程的基本操作程序 第1课时　 获取目的基因并构建基因表达载体 [学习目标] 1.运用系统思想解释基因工程的基本步骤和原理。 2.结合资料和示意图阐明PCR的原理，说出PCR所需的条件及其反应过程。 3.结合模式图说出基因表达载体的组成，并理解构建目的。 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 [对应学生用书第68页] 一、目的基因的筛选与获取 1.筛选合适的目的基因 （1）目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。目的基因主要是指 　编码蛋白质　⁠的基因。 （2）筛选方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 编码蛋白质　 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 （3）认识基因结构和功能的技术方法： 　测序　⁠技术、 　序列　⁠数据库、 　序列比对　⁠工具。 测序　 序列　 序列比 对　 实例：利用Bt基因培育转基因抗虫棉 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 2.利用PCR获取和扩增目的基因 （1）PCR的含义：PCR是 　聚合酶链式反应　⁠的缩写，它是一项根据 　DNA半保留复制　⁠的原理，在体外提供 　参与DNA复制　⁠的各种组分与反应条件，对 　目的基因的核苷酸序列　⁠进行大量复制的技术。 （2）条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种 　引物　⁠、4种 　脱氧核苷酸　⁠和 　耐高温的DNA聚合酶　⁠。 聚合酶链式反应　 DNA半保留复 制　 参与DNA复制　 目的基因的 核苷酸序列　 引物　 脱氧核苷酸　 耐高温的DNA聚合酶　 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 （3）过程 ①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA 　受热变性后解为单链　⁠。 受热变性后解为单链　 ②复性：温度下降到50 ℃左右时， 　两种引物　⁠通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 ③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中 　4种脱氧核苷酸　⁠在耐高温的 　DNA聚合酶　⁠的作用下加到引物的 　3'　⁠端合成子链。 两种引物　 4种脱氧核苷酸　 DNA聚合 酶　 3'　 ④重复循环多次。 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 （4）结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成 　指数　⁠形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。 （5）产物鉴定： 　琼脂糖凝胶电泳　⁠。 指数　 琼脂糖凝胶电泳　 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 二、基因表达载体的构建 1.构建基因表达载体的目的 （1）使目的基因在受体细胞中 　稳定存在　⁠，并且可以 　遗传　⁠给下一代。 （2）使目的基因能够 　表达　⁠和发挥作用。 稳定存在　 遗传　 表达　 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 2.基因表达载体的组成（填图） 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 3.基因表达载体的构建 　　首先用一定的 　限制酶　⁠切割载体，使它出现一个切口，然后用 　同种　⁠限制酶或 　能产生相同末端　⁠的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用 　DNA连接酶　⁠将目的基因片段拼接到载体的切口处。 限制酶　 同种　 能产生相同末端　 DNA连接酶　 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 判断正误，正确的打“√”，错误的打“×”。 （1）PCR过程使用的是耐高温的DNA聚合酶。（　√　） （2）PCR过程中引物是一小段DNA，至少要有两种。（　×　） （3）由于整个PCR过程中需要不断调节温度，DNA聚合酶必须耐高温。 （　√　） √ × √ （4）基因表达载体中含有起始密码子和终止密码子。（　×　） × 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 [对应学生用书第69页] 知识点一　目的基因的筛选与获取 　　获取目的基因的方法很多，现在常用PCR特异性地快速扩增目的基因。PCR是聚合酶链式反应的缩写，是根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 （1）利用PCR技术扩增目的基因需要提供哪些条件？ 提示：需要模板、酶、原料、引物以及适宜的温度和pH等条件。即以DNA两条链为模板，在耐高温的DNA聚合酶的作用下，4种脱氧核苷酸（A、T、C、G）作为合成子链的原料，从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。反应过程中，缓冲溶液维持反应的pH，并保证变性、复性和延伸需要的适宜温度。 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 （2）什么是引物？如果在某基因组定位了一个目的基因X，但是其核苷酸序列未知，现已知X邻近区域的上、下游的部分DNA序列，此时如何设计引物？ 提示：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸；虽然目的基因X的核苷酸序列未知，但X临近区域的上、下游的部分DNA序列已知，因此可根据X临近区域的上、下游已知序列设计引物。 （3）一个目的基因（DNA）分子在第3次扩增时，需要几种引物？需要几个引物？ 提示：一个目的基因（DNA）分子在第3次扩增时，需要两种引物；第三轮是在第二轮的基础上进行的，第二轮得到四个DNA分子，共八条链，因此需要8个引物。 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 （4）研究发现，复性温度与设计的引物（如长度、碱基组成）有关，请分析原因。 提示：长度相同但G—C含量高的引物需要设定的复性温度较高；若复性温度过高，则会破坏引物与模板的结合，可能导致PCR得不到任何扩增产物。 （5）PCR技术扩增目的基因实际上是在体外模拟DNA复制过程。请从酶的角度分析PCR技术扩增DNA与DNA体内复制的不同点。 提示：①PCR技术扩增DNA不需要解旋酶；②PCR技术需要的DNA聚合酶应具有耐高温性。 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 1.PCR技术与细胞内DNA复制的比较 比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术 区 别 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温下变性解旋 场所 主要在细胞核内 细胞外 酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶 温度 细胞内温和条件 控制温度，需在不同温度下进行 结果 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术 相同点 ①模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料：均为4种脱氧核苷酸 ③酶：均需要DNA聚合酶 ④引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物的末端开始链的合成 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 2.PCR中与引物有关的易错点 （1）设计引物的依据通常是目的基因两端的核苷酸序列。 （2）用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。若引物长度过短，则引物与模板链结合的特异性较差。 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 ②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对，否则会导致引物自连。 （4）为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5'端加上限制酶的酶切位点，且常在两种引物设计上加入不同的酶切位点，主要目的是保证目的基因与载体的正向连接。 （3）两种引物须符合以下要求，否则引物失效，得不到扩增产物。 ①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对，否则会导致自身折叠。 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 1.下列关于PCR技术的说法不正确的是（　　） A.PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 B.PCR过程中只需要两个引物分子 C.PCR的主要过程包括变性、复性、延伸，其中延伸阶段需要耐高温的DNA聚合酶 D.PCR过程中DNA合成方向是5'到3' 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 解析　PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，用于延伸子链，A正确；PCR过程中只需要两种引物分子，每条新的子链延伸都需要一个引物，B错误；PCR的主要过程包括变性、复性、延伸，其中延伸阶段需要耐高温的DNA聚合酶，C正确；PCR过程中DNA合成方向是5'到3'，D正确。 答案　B 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 2.如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是 （　　） 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 A.从理论上推测，第二轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4 B.在第二轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对则不能扩增目的基因 D.耐热的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3'端 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 解析　基因扩增中引物通常是一小段DNA或RNA片段，从理论上推测，第二轮中含引物A的比例为3/4，第三轮中占7/8，A正确；由于题图中的引物A和引物B均不在该片段的端点，因此第一轮循环后，得到的两DNA片段中两条脱氧核苷酸链都不等长；通过绘图可推知，第二轮中亦不会出现等长的引物，所以在第二轮循环产物中不会出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，第三轮循环产物中会出现，B错误；引物A和引物B必须与目的基因配对，如果引物之间或引物自身发生碱基互补配对则不能扩增目的基因，C正确；由于复制过程子链的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸，所以耐热的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3'端，D正确。 答案　B 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 知识点二　基因表达载体的构建 　　构建基因表达载体是基因工程的核心步骤。目的是让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使目的基因能够表达和发挥作用。结合下列构建基因表达载体图解，讨论解决相关问题： 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 （1）为什么必须构建基因表达载体？ 提示：构建的基因表达载体中包含复制原点、启动子、终止子等结构，可以控制目的基因的复制、转录等过程，目的基因只有和载体结合成基因表达载体才容易在受体细胞中稳定维持和表达，因此不能直接把目的基因导入受体细胞，必须构建基因表达载体。 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 （2）假设图中利用同一种限制酶切割质粒和外源DNA片段，分别产生几个黏性末端？ 提示：由图示可知，用同一种限制酶切割质粒，产生一个切口，两个黏性末端；切割外源DNA片段需要在目的基因两侧分别切割，因此产生两个切口，四个黏性末端。 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 （3）构建基因表达载体时往往用两种限制酶分别切割目的基因的两端以及载体，请分析原因。 提示：如果用一种限制酶切割，目的基因两侧的末端以及载体切口的两个末端都是互补的，因此连接时可能会出现载体与载体、目的基因与目的基因、目的基因与载体三种连接情况，而符合要求的只有载体与目的基因的连接。 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 1.启动子和终止子、起始密码子和终止密码子的区别 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 成分 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻碱基 mRNA上三个相邻碱基 位置 基因首端 基因尾端 mRNA首端 mRNA尾端 作用 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 决定转录的结束 翻译的起始信号 决定翻译过程的结束 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 2.基因表达载体的构建过程 （1）用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含目的基因的DNA和质粒，使其产生相同末端。 （2）将切下的目的基因片段与切开的质粒混合，再加入适量DNA连接酶，使目的基因插入质粒的切口处，形成一个重组DNA分子（重组质粒）。构建过程如图所示： 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 4.研究人员用图1中质粒和图2中含目的基因的片段构建重组质粒（图中标注了相关限制酶切割位点），将重组质粒导入大肠杆菌后进行筛选及PCR鉴定。以下叙述不正确的是 （　　） 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 A.构建重组质粒的过程应选用BclⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶 B.使用DNA连接酶将酶切后的质粒和目的基因片段进行重组 C.能在添加四环素的培养基上生存的一定是含有重组质粒的大肠杆菌 D.利用PCR鉴定含目的基因的大肠杆菌时应选用引物甲和引物丙 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 解析　选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但BamHⅠ可能使质粒中的两种标记基因都被破坏，因此只能选BclⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶切割，A正确；酶切后的质粒和目的基因片段要用DNA连接酶连接，构建重组载体，B正确；能在添加四环素的培养基上生存的也可能是只含有质粒的大肠杆菌，C错误；PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反的方向合成子链，故所用的引物组成为图2中的引物甲和引物丙，D正确。 答案　C 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 [对应学生用书第73页] 1.判断正误，正确的打“√”，错误的打“×”。 （1）根据不同的需要，目的基因是不同的，但都是能编码蛋白质的基因。（　×　） （2）PCR过程需要DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶。（　×　） （3）PCR扩增区域由两种引物来决定。（　√　） × × √ （4）启动子和终止子都是DNA分子中具有调控作用的脱氧核苷酸序列。 （　√　） （5）基因表达载体中的标记基因就是抗性基因。（　×　） √ × 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 2.聚合酶链式反应是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。下列有关叙述不正确的是（　　） A.变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现 B.复性过程中引物与DNA模板链的结合是依据碱基互补配对原则完成的 C.延伸过程中需要加入DNA聚合酶、4种核糖核苷酸 D.与细胞内DNA复制相比，PCR所需酶的最适温度较高 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 解析　变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，使DNA双链得以打开，也可用解旋酶实现，A正确；复性过程中引物与DNA模板链的结合是依据碱基互补配对原则完成的，B正确；延伸过程需要耐高温的DNA聚合酶、ATP、4种脱氧核苷酸等参与，但这些物质在反应前就已经加入了，C错误；PCR技术是在较高温度下进行的，因此PCR与细胞内DNA复制相比所需的DNA聚合酶具有更高的耐热性，D正确。 答案　C 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 3.下列关于PCR反应体系中所加物质作用的描述，错误的是 （　　） A.耐高温的DNA聚合酶用于催化DNA子链的合成 B.引物使Taq酶能从引物的5'端延伸DNA链 C.目标DNA母链用作合成DNA复制的模板 D.dNTP为PCR提供能量和原料 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 解析　通过PCR技术扩增目的基因时，需要用耐高温DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸聚合形成DNA子链，A正确；在复制时，引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶从引物的3'端开始延伸DNA链，因此DNA合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸，B错误；PCR技术的原理是DNA双链复制，DNA复制时两条链均作为复制的模板，C正确；由于dNTP含有高能磷酸键，断裂后可以为PCR提供能量，同时产生的脱氧核苷酸可提供原料，D正确。 答案　B 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 第1课时　获取目的基因并构建基因表达载体 3．(北京十一中期中)下列有关基因表达载体的叙述，错误的是(　　) A．能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割” B．能协助目的基因在受体细胞中复制 C．含有启动子和终止子协助目的基因表达 D．基因工程的核心是构建基因表达载体 解析　基因表达载体不能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割”，A错误；基因表达载体在受体细胞中能够稳定存在，并且自我复制，使目的基因数目扩增，B正确；启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，能启动转录过程；终止子控制着转录的结束，所以基因表达载体含有的启动子和终止子可协助目的基因的表达，C正确。 答案　A ———————————素养发展　探究应用——————————— [情境] SARS病毒是一种单链RNA病毒，外面包裹着衣壳蛋白和囊膜，囊膜上存在刺突蛋白，能特异性识别细胞膜上的ACE2受体，从而感染细胞。常用“荧光RT­PCR技术”进行检测，方法是取检测者的mRNA逆转录出cDNA，并大量扩增，同时用荧光标记的SARS病毒核酸探针来检测PCR产物中是否含有SARS病毒的cDNA。请回答下列问题： [探究] (1)上述“荧光RT­PCR技术”所用的试剂盒中通常都含有哪些物质？ 提示：逆转录酶、热稳定DNA聚合酶、荧光标记的核酸探针、引物、4种脱氧核苷酸、缓冲体系。 (2)由于核酸检测比较费时费力，现已开发出多款针对SARS病毒的抗原或抗体检测试剂盒，可在更短时间内得出检测结果。假如你是一名科研人员，现提供SARS病毒刺突蛋白基因、能产生专一针对SARS病毒抗体的B淋巴细胞及其他相关的生物学材料，请运用现代生物技术，设计一款能够快速大规模生产、针对SARS病毒抗原或抗体检测的试剂盒，简要写出生产试剂盒的设计思路(只写出针对抗原或抗体检测的一种方案即可)。 提示：方案一(检测SARS病毒抗原)　将能产生专一针对SARS病毒抗体的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞整合，获得大量的单克隆抗体，并做成检测试剂盒用来检测SARS病毒。 方案二(检测SARS病毒抗体)　将SARS病毒的刺突蛋白基因整合到载体上，利用基因工程获得大量的刺突蛋白，并做成检测试剂盒用来检测(血浆中)SARS病毒的抗体。 4．对RNA病毒进行检测时可以采用实时荧光RT－PCR(逆转录聚合酶链式反应)的方法，RT－PCR的具体过程如图。下列叙述错误的是(　　) A．过程①以mRNA为模板合成单链DNA B．过程②③拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上需要n个引物B C．游离的脱氧核苷酸只能从引物的3′端开始连接 D．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度 解析　过程①是由mRNA形成单链DNA的过程，表示逆转录，A项正确；过程②③拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，根据DNA分子半保留复制特点可知，该过程理论上至少需要2n－1个引物B，B项错误；游离的脱氧核苷酸只能从引物的3′端开始连接，C项正确；利用实时荧光RT－PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测时可提高检测的灵敏度，是因为增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度)，D项正确。 答案　B 5．某目的基因酶切后的末端为平末端，科研人员利用基因工程技术，借助中间载体P将目的基因接入载体E，如下图所示，回答有关问题： (1)基因工程的操作步骤：____________→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→________________。 (2)结合上图分析，需要借助中间载体P的主要原因是_____________________ _____________________________________；载体P只能作为中间载体，是因为其没有表达该目的基因的____________。 (3)为了便于该目的基因接入载体E应选用限制酶________和________。 (4)若将构建好的重组质粒导入大肠杆菌中，需用________处理大肠杆菌，使其处于________状态。 (5)若要检测目的基因是否转录，常用________方法检测。 解析　(1)基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。(2)由图可知，由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，而目的基因酶切后只能形成平末端，使中间载体P接入载体E，中间载体P既能产生黏性末端，又能产生平末端，可同时连接载体E和目的基因，载体P只能作为中间载体，是因为其没有表达该目的基因的启动子与终止子。(3)由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，据图可知，中间载体P和载体E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶识别序列，故可 选用XhoⅠ和PstⅠ酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcoRⅤ识别位点，并且其切割的为平末端，可以用于连接目的基因，SmaⅠ酶虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于XhoⅠ和PstⅠ酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割。(4)将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法，即用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于感受态。(5)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 答案　(1)目的基因的获取　目的基因的检测与鉴定 (2)载体E只有产生黏性末端的酶切位点，而目的基因酶切后只能形成平末端，使中间载体P接入载体E，中间载体P既能产生黏性末端，又能产生平末端，可同时连接载体E和目的基因　启动子与终止子 (3)XhoⅠ和PstⅠ　EcoRⅤ (4)Ca2＋　感受　(5)分子杂交 $$