3.1基因工程及其技术（2）-PCR技术、基因工程的基本操作程序课件-2024-2025学年高二下学期生物苏教版选择性必修3

第三章 基因工程 第 1.2 节 PCR技术、基因工程的基本操作程序 目的基因的获取 基因表达载体的构建（核心） 将目的基因导入受体细胞 目的基因及其表达产物的检测与鉴定 基因工程的基本操作程序 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指编码蛋白质的基因。 一、目的基因的获取 （1）目的基因： （2）筛选合适的目的基因： 例如：培育转基因抗虫棉 目的 培育抗虫棉 已有研究成果 ①苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害； ②苏云金杆菌的杀虫作用与 Bt 基因有关； ③对 Bt 基因的序列信息和其表达产物 Bt 抗虫蛋白有了较为深入的了解 合适的目的基因 Bt 基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因 一、目的基因的获取 （3）目的基因获取的方法： 从生物组织中直接获取 化学方法直接人工合成 从基因文库中获取目的基因 利用 PCR 技术扩增目的基因 从生物组织中直接获取* ①从供体细胞直接获取目的基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。这种方法犹如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。 ②鸟枪法的具体做法：用限制酶将供体细胞中的 DNA 切成许多片段，将这些片段分别构建表达载体，然后通过载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的 DNA （外源 DNA ）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫作扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的细胞分离出来，如许多抗虫、抗病毒的基因都可以用该方法获得。 ③用“鸟枪法”获取目的基因的缺点是工作量大，具有一定的盲目性。 化学方法直接人工合成 ①反转录法*：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。 它以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA，其过程如下： 目的基因的mRNA 双链DNA（目的基因） 反转录 ②化学合成法：a.对比较小的目的基因，明确脱氧核苷酸序列后，可通过DNA合成仪直接人工合成； 一种DNA合成仪 化学方法直接人工合成 ②化学合成法：b.对于全基因或较大基因，采用半合成的方法。 合成基因的部分寡核苷酸片段 适当条件下退火得到模板—引物复合体 在 dNTP 存在的条件下，通过 Klenow酶将双链 DNA 的突出 5′ 端补平，合成相应的互补链，再用相应的 DNA 连接酶修复缺口，获得两条完整的互补双链 某种基因的化学合成过程示意图 从基因文库中获取目的基因 基因文库：将含有某种生物不同基因的许多 DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 ①基因文库的种类 基因组文库： 部分基因文库： 包含一种生物的全部基因 包含一种生物的一部分基因（如cDNA文库） ②cDNA文库：某种细胞中转录的全部 mRNA 经反转录产生的 cDNA 片段与适当的载体连接后导入受体菌，这样包含着细胞全部 mRNA 信息的 cDNA 克隆集合称为 cDNA 文库。 从基因文库中获取目的基因 ③基因文库的构建： a.基因组文库的构建 供体生物 → 全部DNA → DNA片段 → 体外重组 → 受体菌群 b.cDNA文库的构建 供体生物 → mRNA → cDNA → 体外重组 → 受体菌群 真核生物的基因结构及转录和加工过程图 从基因文库中获取目的基因 基因组文库与 cDNA 文库的比较* 文库类型 基因组文库 cDNA 文库 文库大小 基因中启动子（具有启动作用的DNA 片段） 基因中内含子（位于编码蛋白质的序列内的非编码的DNA 片段） 基因多少 物种间的基因交流 大 小 有 无 无 有 某种生物的全部基因 某种生物的部分基因 可以 部分基因可以 从基因文库中获取目的基因 ④用 DNA 探针从基因文库中准确提取目的基因 根据目的基因的核苷酸序列制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素标记，即成为探针。用这一探针探查基因文库中已经变性的 DNA 片段（单链），如果有一个 DNA 片段能和探针片段互补而结合成双链（分子杂交），这一片段即含有所需要的基因。 利用 PCR 技术扩增目的基因 ①含义：PCR 是聚合酶链式反应的缩写，是目的基因的体外扩增技术。 PCR 由穆里斯等人于 1985 年发明，为此，穆里斯于 1993 年获得诺贝尔化学奖。 ②原理： DNA 半保留复制 ③条件： 模板—— 原料—— 酶—— DNA母链 4种dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）（也可提供能量） 热稳定的DNA聚合酶（Taq 酶） 人工合成的DNA引物对——使DNA聚合酶能够从引物的 3’端开始连接脱氧核苷酸） 一定的缓冲液（含 Mg2+ ）——提供相应稳定的 pH 环境；真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 Mg2+ 激活 3’ 3’ 利用 PCR 技术扩增目的基因 ④过程： 5’ 3’ 3’ 5’ 待扩增的DNA片段 5’ 3’ 3’ 5’ 变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链 引物A 引物B 退火：当温度下降到约55℃，两种引物与对应单链结合 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 延伸：温度上升到72℃左右，4种脱氧核苷三磷酸在Taq酶作用下，根据碱基互补配对原则连接到引物3’后并延伸 3’ 5’ ↑ 第一次循环的产物 ↓ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ ↑ 第二次循环的产物 ↓ 5′ 5′ 5′ 3′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 第一轮 第二轮 3′ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 利用 PCR 技术扩增目的基因 ④过程： 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ ↑ 第二次循环的产物 ↓ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 第 三 次 循 环 的 产 物 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 含引物的DNA分子数 含引物A（或B）的DNA分子数 同时含两种引物的DNA分子数 共消耗引物的对数 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 2 4 8 2n 8 4 2 2n 1 3 7 2n-1 0 2 6 2n-2 1 3 7 2n-1 0 0 2 2n-2n PCR和体内DNA复制的差异 利用 PCR 技术扩增目的基因 比较项目 PCR 细胞核内DNA复制 场所 方式 起始位点 酶 反应条件 解旋 引物 产物 循环次数 试管中 细胞内 半保留全连续局部区域复制 半保留半不连续全链复制 引物3’端 复制起始位点 仅一种 DNA 聚合酶（Taq 酶） 多种酶 温度变幅大 温和 高温解旋 解旋酶解旋 DNA 片段，保留在复制的子链中 RNA 片段，不保留在复制的子链中 引物界定的片段 核基因组 人为设置 与细胞分裂同步 不仅要使目的基因进入受体细胞并有效表达，而且要能稳定存在且遗传给后代。 二、基因表达载体的构建（核心） （1）目的： （2）基因表达载体的组成： 是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 位于目的基因的上游 一段有特殊序列的DNA片段 ①启动子： 位置： 本质： 功能： 二、基因表达载体的构建（核心） （2）基因表达载体的组成： 是转录过程终止的信号 位于目的基因的下游 一段有特殊序列的DNA片段 ②终止子： 位置： 本质： 功能： ③标记基因： 功能： 类型： 初步筛选出接受了目的基因的受体细胞 抗性基因、生化标记基因 二、基因表达载体的构建（核心） （3）基因表达载体的构建过程： *同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割 二、基因表达载体的构建（核心） 如何选择限制酶？ 二、基因表达载体的构建（核心） （4）载体的种类： 按 功 能 划 分 克隆载体 表达载体 特点 特点 可以在宿主细胞中通过克隆获取目的基因 是最基本的载体 使外源基因在宿主细胞中表达 带有基因表达所需的各种调控元件 三、将目的基因导入受体细胞 转化： 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是将目的基因整合到受体细胞基因组中。 （1）将目的基因导入植物细胞 ——主要是农杆菌转化法 ①农杆菌的特点：农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；农杆菌细胞内含有的 Ti 质粒上的 T-DNA 可转移至受体细胞，并且将其整合到该受体细胞染色体 DNA 上。 三、将目的基因导入受体细胞 ②转化过程： 三、将目的基因导入受体细胞 （2）将目的基因导入动物细胞 ①常用方法： 显微注射技术 ②常用受体细胞： 受精卵 ③基本操作程序： 将含有目的基因 的表达载体提纯 受精卵 显微 注射 早期胚 胎培养 胚胎移植 发育成为具有 新性状的动物 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。 三、将目的基因导入受体细胞 （3）将目的基因导入微生物细胞 ①原核生物的特点： 早期的基因工程操作都用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。 ②操作过程： 对受体细胞的常用处理方法是氯化钙法。 首先用 Ca2+ 处理大肠杆菌细胞 → 感受态细胞 → 将重组表达载体 DNA分子与感受态细胞混合 → 感受态细胞吸收 DNA 分子。 注意说明 ①将基因表达载体（重组质粒）导入农杆菌的常用方法是 Ca2+ 处理法。 Ca2+（或 CaCl2 溶液）对微生物细胞的作用是增加细胞膜的通透性。 ②目的基因能否在植物细胞内稳定保存并表达的关键是目的基因是否插入到受体细胞染色体 DNA 上（原理是基因重组）。 ③不同种类的受体细胞：对于植物来说，受体细胞可以是受精卵和体细胞；对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，受精卵具有体积大、易操作、经培养可直接表达性状的优点。 四、目的基因的检测与鉴定 目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。 （1）分子水平的检测 a.DNA分子杂交技术： 检测受体细胞的染色体 DNA上是否插入了目的基因 在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，若出现杂交带，则目的基因插入成功。 四、目的基因的检测与鉴定 b.分子杂交技术： 检测目的基因是否转录出了mRNA 在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，若出现杂交带，则目的基因插入成功。 四、目的基因的检测与鉴定 c.抗原—抗体杂交技术： 检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质 从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。 四、目的基因的检测与鉴定 （2）个体生物学水平的鉴定 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）感染（抗病接种实验） 未出现病斑 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 走进实验室 利用 PCR 技术扩增 DNA 片段并完成电泳鉴定 （1）实验原理 ①DNA 片段的扩增 利用 PCR 可以在体外进行 DNA 片段的扩增。 PCR 利用了 DNA 的热变性原理，通过调节温度来控制 DNA双链的解聚与结合。 PCR 仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次 PCR 一般要经历30次循环。 ②DNA 片段的电泳鉴定 DNA 分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中 DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、 DNA 分子的大小和构象等有关。凝胶中的 DNA 分子通过染色（EB染色），可以在波长为 300 nm 的紫外灯下被检测出来。 走进实验室 利用 PCR 技术扩增 DNA 片段并完成电泳鉴定 （2）材料用具 PCR仪 微量离心管 电泳装置 推动杆 调节旋钮 卸枪头按钮 体积刻度 吸液杆 枪头 （注意：加不同样品 时，需要更换枪头） 走进实验室 （3）方法步骤 —— DNA 片段的扩增 利用 PCR 技术扩增 DNA 片段并完成电泳鉴定 ①PCR加样操作 按照右表，用微量移液器依次将各组分加入微量离心管中。（注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活） PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5 μL 20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1 μL 20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL 20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL H2O 28～33 μL 1～5 U/μL的Taq DNA聚合酶 1～2 U 模板DNA 5～10 μL 总体积 50 μL 注：模板DNA的用量为1gp～1μg 走进实验室 （3）方法步骤 —— DNA 片段的扩增 利用 PCR 技术扩增 DNA 片段并完成电泳鉴定 ②离心 盖严离心管，离心10s，使反应液集中在离心管底部。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min ③PCR 参照上表设置PCR循环程序。 走进实验室 （3）方法步骤 利用 PCR 技术扩增 DNA 片段并完成电泳鉴定 —— DNA 片段的电泳鉴定 ④制备凝胶 根据DNA片段大小，用电泳缓冲液配制适合浓度的琼脂糖溶液（一般为0.8%～1.2%）。琼脂糖用沸水浴或微波炉熔化，稍冷却加入适量核酸染料混匀。 将琼脂糖溶液倒入模具，并插入大小合适的梳子（用以形成加样孔）。 待凝胶凝固后，将梳子拔出。 ⑤电泳加样 将凝胶放入电泳槽，加电泳缓冲液没过凝胶约1cm。将PCR扩增产物与凝胶载样缓冲液（内含有指示剂）混合，用移液器缓慢注入加样孔。其中一个加样孔中加入Maker。 走进实验室 （3）方法步骤 利用 PCR 技术扩增 DNA 片段并完成电泳鉴定 —— DNA 片段的电泳鉴定 ⑥电泳 接通电源，设定电压（一般1～5V/cm），待指示剂前沿迁移至接近凝胶边缘时，停止电泳。 ⑦观察、照相 取出凝胶在紫外灯下观察、照相。 注意说明 1.为避免外源 DNA 等因素的污染，PCR 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 $$