第三章 第一节 第1课时 基因工程的基本工具与聚合酶链式反应(PCR)技术-【名师导航】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程教师用书word（苏教版）

本讲义聚焦基因工程基本工具与PCR技术核心知识点，从基因工程发展历程（关键技术突破）切入，系统梳理限制酶（特异性切割）、DNA连接酶（类型与作用）、载体（条件与功能）三大工具的结构与功能，再深入解析PCR技术原理、过程及与体内DNA复制的异同，构建递进式学习支架。 资料以生命观念（工具结构与功能观）和科学思维（比较分析、合作探究）为核心，设判断题辨析易错点，合作探究问题（如限制酶作用、标记基因原理）引导深度思考，例题巩固应用。课中助力教师突破重难点，课后学生可借小结与分层作业查漏补缺，提升学习效果。

第一节　基因工程及其技术 第1课时　基因工程的基本工具与聚合酶链式反应(PCR)技术 1．概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。 2．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 生命观念：掌握基因工程的基本工具的种类及作用，并能说出它们在基因工程中的应用。 科学思维：掌握PCR技术的过程与原理，并能正确比较PCR技术与体内DNA复制的异同。 社会责任：通过了解基因工程的发展历程，认同新技术的发展是一代又一代科学家前赴后继努力的结果，并会给人类发展带来巨大的经济效益和社会效益。 一、基因工程是在多学科基础上发展而来的 　1957年：科恩伯格等首次发现了DNA聚合酶。 ↓ 1967年：罗思和海林斯基发现运转工具质粒，同年，科学家发现了DNA连接酶。 ↓ 1970年：特明和巴尔的摩各自在RNA“肿瘤”病毒中发现了逆转录酶。史密斯等人从流感嗜血杆菌中分离到限制性内切核酸酶。 ↓ 1972年：科学家伯格领导的研究小组完成了世界上首次DNA分子体外重组。 ↓ 1973年：科学家科恩领导的研究小组成功地利用大肠杆菌质粒进行了另一个体外重组DNA分子实验。 ↓ 接着，科恩和博耶证明真核生物的基因可以在原核生物中进行表达。 ↓ 1976年：科学家用质粒为载体，将生长激素释放抑制因子基因转入大肠杆菌，并于1977年首次生产出治疗肢端肥大症、巨人症的生长激素释放抑制因子。 ↓ 1977年：科学家桑格测定了一种噬菌体的基因组序列，这是人类首次对完整基因组的核苷酸排列顺序进行测定。 二、基因工程的基本工具 1．基因工程 (1)概念：又称为DNA重组技术，是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA，然后导入受体细胞，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。 (2)原理：基因重组。 (3)操作水平：基因(分子)水平。 2．“分子剪刀”——限制性内切核酸酶(限制酶) (1)作用：识别DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 (2)特点：特异性(专一性)很强。 (3)切割方式 ①错位切：在DNA分子两条链的不同部位进行切割，切割后形成的两个DNA分子片段的末端均留下一段游离的单链，称为黏性末端。 ②平切：在DNA分子两条链上相同的部位进行切割，切割后形成平末端。 3．“分子黏合剂”——DNA连接酶 (1)作用：连接两个DNA片段之间的磷酸二酯键。 (2)类型 ①E．coli DNA连接酶：分离自大肠杆菌，可以用于连接具有黏性末端的DNA分子。 ②T4 DNA连接酶：分离自T4噬菌体，可以用于连接具有黏性末端或平末端的DNA分子。 4．“分子搬运工”——载体 (1)作用：将外源基因导入受体细胞，并使其在受体细胞中稳定遗传和表达。 (2)类型：质粒、λ噬菌体的衍生物、动物病毒等。 (3)组成：复制原点、适合的标记基因、多种限制酶的切割位点。 (4)改造：基因工程上用作载体的质粒一般都是经过人工改造过的。 三、聚合酶链式反应(PCR)技术 1．PCR概念：目的DNA片段(目的基因)的体外扩增技术。 2．原理：类似于DNA的复制。 3．条件 (1)模板DNA：DNA的两条链。 (2)引物对：使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 (3)原料：4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)。 (4)热稳定的DNA聚合酶：Taq酶。 (5)其他：缓冲液、Mg2+等。 4．过程 (1)变性：在约94_℃高温下，作为模板的双链DNA解旋(变性)为两条单链DNA。 (2)退火：反应体系的温度降至约55 ℃，2条引物分别与对应单链DNA上的特定部位配对。 (3)延伸：反应体系的温度回升到约72 ℃(Taq酶催化作用的最适反应温度)，4种脱氧核苷三磷酸根据碱基互补配对原则，在Taq酶的作用下连接到引物3′端之后，使引物链延伸，并形成互补的DNA双链。 　(正确的打“√”，错误的打“×”) 1．基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。 (　　) [答案]　√ 2．DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具。 (　　) ×　提示：DNA重组技术的工具有限制酶、DNA连接酶和载体，没有DNA聚合酶。 3．不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。 (　　) [答案]　√ 4．DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。 (　　) ×　提示：E．coli DNA连接酶不能连接平末端。 5．载体的种类有质粒、λ噬菌体的衍生物、动物病毒等，其中动物病毒必须是DNA病毒。 (　　) [答案]　√ 6．PCR技术需要热稳定的DNA聚合酶和解旋酶的参与。 (　　) ×　提示：PCR技术中通过加热使双链DNA解旋，不需要解旋酶参与。 7．扩增目的基因时只需要一种引物。 (　　) ×　提示：扩增目的基因时需两种引物分别与两条母链结合。 　基因工程的工具酶 1．限制性内切核酸酶 (1)作用特点：具有专一性，表现在以下两个方面 ①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。 ②能够切割特定序列中的特定位点。 (2)识别序列的特点：遵循碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；为轴，两侧碱基互补对称。 (3)作用产物：黏性末端或平末端。 ①黏性末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的，如图所示： ②平末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的，如图所示： 2．限制性内切核酸酶与DNA连接酶的关系 (1)区别 作用 应用 限制性内 切核酸酶 使特定部位的磷酸二酯键断裂 用于提取目的基因和切割载体 DNA 连接酶 在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键 用于目的基因和载体的连接 (2)两者的关系可表示为 3．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较 比较项目 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同点 作用实质相同，都是催化磷酸二酯键的形成 不 同 点 是否需 要模板 不需要 需要 接DNA链 双链 单链 作用过程 在两个DNA片段间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸加到已存在的DNA单链片段上，形成磷酸二酯键 作用结果 将已存在的DNA片段连接 合成新的DNA分子 用途 基因工程 DNA复制 合作探究：(1)为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？ 提示：原核细胞容易受到外源DNA的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，因为酶具有专一性或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。 (2)限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？ 提示：限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，体现了酶的专一性。E．coli DNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，对末端的碱基序列没有要求；T4 DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA分子的平末端，都对末端的碱基序列没有要求，因此DNA连接酶的作用没有体现酶的专一性。 1．限制酶a和限制酶b的识别序列和切割位点如图所示，下列有关说法正确的是(　　) A．一个DNA分子中，酶a与酶b的识别序列可能有多个 B．酶a与酶b切出的黏性末端不能相互连接 C．酶a与酶b切断的化学键不完全相同 D．用酶a切割有3个识别位点的质粒，得到4种切割产物 A　[一个DNA分子中，可能存在一个至多个酶a与酶b的识别序列，A正确；由图可知，酶a与酶b识别的序列虽然不同，但切出的黏性末端相同，相同的黏性末端能相互连接，B错误；酶a与酶b切断的化学键均为相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，C错误；质粒为小型环状DNA分子，用酶a切割有3个识别位点的质粒，可得到3种切割产物，D错误。] 2．限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是(　　) A．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 B．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸 C．E．coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端 D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA B　[DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A项错误；限制酶只能切割双链DNA片段而不能切割RNA，烟草花叶病毒的核酸为RNA，B项正确；E．coli DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C项错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D项错误。] 3．下列关于几种酶作用的叙述，错误的是(　　) A．DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接 B．RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录 C．一种限制酶能识别多种核苷酸序列，并切割出多种目的基因 D．DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链 C　[限制酶具有专一性，一种限制酶一般只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割DNA分子。DNA连接酶能使不同DNA片段的脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接，重新形成DNA分子；RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录；DNA聚合酶能以DNA的一条链为模板，把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链，复制形成新的DNA分子。] 　基因工程中的载体 1．种类 常用载体：质粒、λ噬菌体的衍生物、动物病毒等。质粒是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外的、具有自我复制能力的、很小的双链环状DNA分子。 2．具备条件 (1)能自我复制：能够在受体细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。 (2)有切割位点：有一个至多个限制酶切割位点，供外源基因插入。 (3)具有标记基因：具有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (4)无毒害作用：对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。 说明：一般来说，天然载体不能同时满足所有条件，要对其进行人工改造才可以使用。 3．作用 (1)用它作为运输工具，将目的基因送入受体细胞中。 (2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 合作探究：(1)细胞质膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？ 提示：①化学本质不同：细胞质膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动物病毒等。 ②功能不同：细胞质膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。 (2)标记基因标记的原理是什么？ 提示：①前提：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。 ②过程：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性，因此培养受体细胞的培养基中加入该种抗生素即可筛选。 ③结果：在培养基上，被抗生素杀死的是没有抗性的受体细胞，没被杀死的具有抗性的受体细胞得以筛选。 原理如图所示： 1．作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是(　　) A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因 B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达 C．具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合 D．对宿主细胞无伤害，以便于重组DNA的鉴定和选择 A　[作为载体必须能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A正确；作为载体必须具有一个或多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入，而不是表达，B错误；作为载体必须具有标记基因，以便于重组DNA的筛选，C错误；作为载体必须是安全的，对受体细胞无害，以便宿主细胞能进行正常的生命活动，D错误。] 2．限制酶Mun Ⅰ和限制酶EcoR Ⅰ的识别序列及切割位点分别是。下图表示四种质粒和目的基因，其中，质粒上箭头所指部位为酶的识别位点，阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是(　　) A 　　　　B　　　　　C　　　 　D A　[用限制酶Mun Ⅰ切割A质粒后，不会破坏标记基因，而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的末端，适于作为目的基因的载体。B项中质粒没有标记基因，不适于作为目的基因的载体。C、D质粒含有标记基因，但用限制酶切割后会被破坏，因此不适于作为目的基因的载体。] 3．某一质粒载体如图所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题： (1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有____________________(答出两点即可)。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。 (2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________； 并且________________和________________的细胞也是不能区分的，其原因是____________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有____________的固体培养基。 (3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自________。 [解析]　(1)质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等。(2)在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。(3)某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自受体细胞。 [答案]　(1)能自我复制、具有标记基因　(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素　(3)受体细胞 　聚合酶链式反应(PCR)技术 1．PCR的过程 2．PCR技术与生物体内DNA复制的比较 比较项目 PCR技术 DNA复制 区 别 解旋方式 DNA在高温作用下变性解旋 解旋酶催化 场所 细胞外(在PCR扩增仪内) 细胞内(主要在细胞核内) 酶 热稳定的DNA聚合酶(Taq酶) DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等 温度条件 需控制温度，在较高温度下进行 细胞内温和条件 合成的对象 DNA片段或基因 DNA分子 联 系 ①模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成 ②原料：均为四种脱氧核苷酸 ③酶：均需要DNA聚合酶进行催化 ④引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 合作探究：(1)PCR过程中为什么需要引物？ 提示：引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。存在于自然界中生物的DNA复制和人工合成中的聚合酶链式反应(PCR)之所以需要引物，是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能从子链的3′端催化连接脱氧核苷酸。 (2)PCR扩增目的基因时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，退火温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在GC含量高时，对退火温度的设定有什么要求？说明理由。 提示：GC含量高时，设定的退火温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。 (3)在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因？ 提示：第3轮 1．下列关于PCR反应体系中所加物质作用的描述，错误的是(　　) A．热稳定的DNA聚合酶用于催化DNA子链的合成 B．引物使Taq酶能从引物的5′端延伸DNA链 C．目标DNA母链用作合成DNA复制的模板 D．四种dNTP为PCR提供能量和原料 B　[通过PCR技术扩增目的基因时，需要用热稳定的DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸聚合形成DNA子链，A正确；在复制时，引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，因此DNA合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，B错误；PCR技术的原理是DNA双链复制，DNA复制时两条链均作为复制的模板，C正确；DNA合成的原料是四种脱氧核苷三磷酸，同时两个核苷酸连接时可释放能量，D正确。] 2．如图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是(　　) A．片段a、b、c的长度均相同 B．片段a、b只是第一次循环的产物 C．片段c最早出现在第二次循环的产物中 D．经过30次循环后，片段c的数量为230 C　[图中片段a、b只有一种引物，是由原始DNA链为模板复制而来，其长度比片段c长，A项错误。由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b，B项错误。由于第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则c最早出现在第二次循环的产物中，C项正确。经过30次循环后，得到的DNA片段总数为230，这包括图中的片段a、b，D项错误。] 3．PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题： (1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是________(用数字序号表示)。 (2)操作③中使用的酶是________________，PCR反应中的每次循环可分为变性、退火、________三步，其中退火的结果是____________________________。 (3)为了作出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与________特异性结合。 (4)PCR(聚合酶链式反应)技术是指______________________________________ _____________________________________________________________________。 该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。 [解析]　(1)为了检测病人是否感染了某种病原菌，首先应采集病人组织样本，然后从病人组织样本中提取DNA，利用PCR扩增DNA片段后，再分析PCR扩增结果，所以正确的操作顺序是④②③①。(2)PCR技术中用到的酶是热稳定的DNA聚合酶，PCR反应中的每次循环可分为变性、退火和延伸三步。退火是温度下降到55 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)PCR反应所用引物要根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计，要检测是否感染病原菌，应根据该病原菌的DNA碱基序列合成引物，这样PCR反应所用的引物会与某种病原菌的DNA特异性结合。(4)PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。 [答案]　(1)④②③①　(2)热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)　延伸　引物通过碱基互补配对与单链DNA结合　(3)病原菌DNA　(4)在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术 [课堂小结] 　 1．基因工程又称为DNA重组技术，是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA，然后导入受体细胞，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。 2．限制酶的特异性(专一性)很强，能识别DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 3．从大肠杆菌分离得到的E．coli DNA 连接酶，可以用于连接具有黏性末端的DNA分子；由T4噬菌体基因编码的T4 DNA连接酶，可以用于连接具有黏性末端或平末端的DNA分子。 4．质粒载体应该具有的DNA序列包括：复制原点、适合的标记基因、多种限制酶的切割位点。 5．聚合酶链式反应是目的DNA片段的体外扩增技术。包括变性、退火、延伸三个反应步骤。 1．下列对基因工程的说法，错误的是(　　) A．基因工程是在分子水平上进行设计和施工 B．基因工程产生的变异属于染色体变异 C．基因工程可以导入不同种生物的基因 D．基因工程可定向改变生物性状 B　[基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，A正确；基因工程属于基因重组，B错误；基因工程可以导入不同种生物的基因，C正确；基因工程可按照人们的意愿，定向改变生物性状，D正确。] 2．如图是DNA分子结构的示意图，其中，基因工程中使用的限制酶的作用位点是 (　　) A．①　　　 B．②　　　 C．③　　　 D．④ B　[限制酶的作用位点是两个核苷酸之间的磷酸二酯键，即图中②，B正确。] 3．“分子黏合剂”——DNA连接酶“黏合”的部位是(　　) A．碱基对之间的氢键 B．碱基与脱氧核糖 C．双链DNA片段间的磷酸二酯键 D．脱氧核糖与脱氧核糖 C　[相邻的两个脱氧核苷酸之间由磷酸和脱氧核糖形成的磷酸二酯键连接，DNA连接酶连接的是此化学键。] 4．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法错误的是(　　) A．质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有 B．质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切割位点 C．质粒为小型环状DNA分子，存在于拟核(区)外的细胞质基质中 D．质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制 A　[质粒为小型环状DNA分子，不仅存在于细菌中，也存在于某些真核生物中，但病毒中没有质粒；质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切割位点；质粒为小型环状DNA分子，存在于细胞核或拟核外的细胞质基质中；质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制。] 5．PCR利用了DNA热变性的原理，PCR仪实际上也是一种能自动调控温度的仪器，对PCR过程中“温度的控制”的说法错误的是(　　) A．酶促反应需要高的温度，是为了确保模板是单链 B．延伸的温度必须大于退火温度，而小于变性温度 C．DNA聚合酶具有耐高温的能力 D．DNA解旋酶具有耐高温的能力 D　[PCR是体外DNA扩增，DNA双链的解开不需要解旋酶，靠高温使其变性，双链螺旋结构解体，双链分开，在退火后，在耐高温的DNA聚合酶的作用下根据碱基互补配对原则合成新的DNA，因此延伸的温度要大于退火温度而小于变性温度。] 6．下图表示形成cDNA并进行PCR扩增的过程。据图分析，下列叙述正确的是 (　　) A．①过程所需的原料是核糖核苷酸 B．②过程所需的酶必须耐高温 C．③过程需要解旋酶破坏氢键 D．④过程的引物对之间不能互补配对 D　[①过程为逆转录，所需的原料是脱氧核苷酸，A错误；②过程由DNA单链合成DNA双链过程所需要的DNA聚合酶不需要耐高温，B错误；③过程为变性，温度上升到94 ℃左右时，双链DNA解聚为单链，不需要DNA解旋酶破坏氢键，C错误；④过程为退火，温度降到55 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，但引物对之间不能互补配对，D正确。] 课时分层作业(12)　基因工程的基本工具与聚合酶链式反应(PCR)技术 题组一　基因工程及其诞生和发展 1．科学家经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程。实施该工程的最终目的是(　　) A．定向提取生物体的DNA分子 B．定向地对DNA分子进行人工“剪切” C．在生物体外对DNA分子进行改造 D．定向地改造生物的遗传性状 D　[该题的关键词是“最终目的”，A、B、C三项都是基因工程的技术手段，这些手段的目的是定向改造生物的遗传性状，故选D项。] 2．下列关于基因工程的发展历程的说法错误的是(　　) A．质粒是一种具有自我复制能力的环状DNA分子 B．科学家伯格领导的研究小组完成世界上首次DNA分子体外重组 C．科恩和博耶证明真核生物的基因可以在原核生物中表达 D．基因工程的建立和发展是生物学进步的结果，与其他学科无关 D　[基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等众多学科长足进步的基础上发展而来的。] 题组二　基因工程的基本工具 3．下列有关限制性内切核酸酶的叙述，正确的是(　　) A．用限制性内切核酸酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个 B．限制性内切核酸酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大 C．—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制性内切核酸酶切出的黏性末端可用DNA连接酶连接 D．只有用相同的限制性内切核酸酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒 B　[用限制性内切核酸酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，需要切割目的基因的两侧，因此要断裂4个磷酸二酯键，即被水解的磷酸二酯键有4个，A错误；限制性内切核酸酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大，B正确；—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制性内切核酸酶切出的黏性末端不同，分别为CATG和GATC，不能用DNA连接酶连接，C错误；用不同的限制性内切核酸酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，若产生的黏性末端相同，也能形成重组质粒，D错误。] 4．下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是(　　) A．将单个核苷酸加到某个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 B．将断开的2个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键 C．连接2条DNA链上碱基之间的氢键 D．只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来，而不能将两者之间的平末端进行连接 B　[DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化2个脱氧核苷酸分子之间形成磷酸二酯键。但DNA连接酶是在2个DNA片段之间形成磷酸二酯键，将2个DNA片段连接成重组DNA分子；DNA聚合酶是将单个的核苷酸分子加到已存在的核酸片段上形成磷酸二酯键，合成新的DNA分子。] 5．下列关于载体的叙述中，错误的是(　　) A．载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子 B．在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的 C．目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动物病毒等 D．载体具有某些标记基因，便于对其进行切割 D　[用DNA连接酶将目的基因和载体DNA连接在一起，形成的DNA分子为重组DNA分子，A正确；常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物、动物病毒等，其中在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行人工改造的，B、C正确；标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，D错误。] 6．下面是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，ampr为氨苄青霉素抗性基因，tetr为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性内切核酸酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是(　　) A 　　　　B　 　　　C 　　　　D C　[A项破坏了复制必需的序列。B项氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都完好，在四环素培养基上和氨苄青霉素培养基上都能生长。C项氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因完好，能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长。D项氨苄青霉素抗性基因完好，四环素抗性基因被破坏，能在氨苄青霉素培养基上生长，而不能在四环素培养基上生长。] 7．(12分)根据图表的内容回答下列问题： 几种限制酶识别序列切割位点 (1)假设所用的限制酶均能将所识别的位点完全切开，采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切含有目的基因的DNA，能得到____________种DNA片段。如果将质粒载体和含目的基因的DNA片段只用EcoRⅠ酶切，酶切产物再加入DNA连接酶，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有________________、________________、________________。 (2)为了防止目的基因和质粒表达载体酶切后的末端任意连接，酶切时应该选用的酶是________、________。 [解析]　(1)含目的基因的DNA分子上含有2个EcoR Ⅰ和1个Pst Ⅰ的酶切位点，3个切点全部切开，则形成4种DNA片段。质粒与含目的基因的DNA片段都用EcoRⅠ酶切，目的基因两端和质粒切口处的黏性末端相同，只考虑两个DNA片段相连，则会形成3种连接产物，即质粒与质粒相连、质粒与目的基因相连、目的基因与目的基因相连。(2)为了防止任意连接，可选用EcoRⅠ和SmaⅠ两种酶同时切割。 [答案]　(每空2分，共12分)(1)4　质粒载体与质粒载体连接物　目的基因与目的基因连接物　质粒载体与目的基因连接物　(2)EcoRⅠ　SmaⅠ 题组三　PCR技术 8．PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，与人体细胞内DNA分子复制相比，下列有关叙述错误的是(　　) A．都遵循碱基互补配对原则 B．DNA聚合酶作用的最适温度不同 C．都是边解旋边复制的过程 D．复制方式都是半保留复制 C　[DNA分子的体外复制和体内复制都遵循碱基互补配对原则，A正确；PCR技术是在较高温度条件下进行的，因此PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高，B正确；PCR技术是在较高温度条件下打开双链后进行扩增的，不是边解旋边复制的，C错误；DNA复制方式都是半保留复制，D正确。] 9．利用PCR技术从某种生物的基因组DNA中获取目的基因的前提是(　　) A．有目的基因的DNA片段，作为模板进行复制 B．有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物 C．有足够的脱氧核苷酸作为原料 D．加入足够数量的DNA连接酶进行指数式扩增 B　[利用PCR技术从某种生物的基因组DNA中获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成引物。] 10．(12分)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题： (1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过____________获得________用于PCR扩增。 (2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的________________位点。设计引物时需要避免引物之间形成____________________，而造成引物自连。 (3)图中步骤1代表________，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。 (4)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有________(填序号：①升高退火温度　②降低退火温度　③重新设计引物)。 [解析]　(1)目的基因的获取：从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA用于PCR扩增。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便基因与载体相连构建重组质粒，在引物中需要增加适当的限制性内切核酸酶的切割位点。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。(3)根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为退火，步骤3为延伸，这三个步骤组成一轮循环。(4)如果PCR反应得不到任何扩增产物，可能的原因是退火温度过高，或者设计的引物不合适，不能与模板碱基配对。因此可采取的改进措施有降低退火温度、重新设计引物等。 [答案]　(每空2分，共12分)(1)逆转录　cDNA　(2)限制性内切核酸酶的切割　碱基互补配对　(3)变性　(4)②③ 11．对下图所示黏性末端的相关说法错误的是(　　) A．甲、乙、丙黏性末端是由各自不同的限制性内切核酸酶催化产生的 B．甲、乙具相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲、丙之间不能 C．DNA连接酶作用位点在b处，催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成化学键 D．切割甲的限制性内切核酸酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子 C　[甲图表示在G和A之间进行切割，乙图表示在C和A之间进行切割，丙图表示在C和T之间进行切割，因此三者需要不同的限制性内切核酸酶进行切割；甲和乙的黏性末端相同，能够通过碱基互补配对形成重组DNA分子，但甲和丙不行；DNA连接酶作用的位点是磷酸二酯键，乙图中的a和b分别表示磷酸二酯键和氢键；甲和乙形成的重组DNA分子相应位置的DNA碱基序列为，而甲图表示在G和A之间切割，所以该重组序列不能被切割甲的限制性内切核酸酶识别。] 12．下图所示为限制酶BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ的识别序列及切割位点，实验中用BamH Ⅰ切割DNA获得目的基因，用Bgl Ⅱ切割质粒，并将它们拼接得到重组质粒。下列相关叙述正确的是(　　) A．在酶切过程中，只需要控制好酶的浓度，不需要控制温度等因素 B．经两种酶处理得到的重组质粒不能再被这两种酶所识别 C．质粒经Bgl Ⅱ切割后形成的黏性末端是 D．分别用图中两种限制酶切割，可保证目的基因定向地插入质粒 B　[影响酶促反应的因素有温度、pH、酶浓度、底物浓度、反应时间等，因此酶切过程中，需控制好酶浓度、温度和反应时间等因素，A错误；经两种酶处理得到的重组质粒不能再被这两种酶识别，B正确；质粒经Bgl Ⅱ切割后形成的黏性末端是，C错误；分别用题图中两种限制酶切割目的基因和质粒，由于形成的黏性末端相同，因此并不能保证目的基因定向地插入质粒，D错误。] 13．(多选)RT­PCR是将RNA的逆转录(RT)和cDNA聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术。下列说法错误的是(　　) A． 该技术中遗传信息的流动途径是RNA→DNA→DNA B．该技术中需要逆转录酶、解旋酶和耐高温的DNA聚合酶 C．该技术的前提是要以RNA全部碱基序列为模板设计并合成引物 D．该技术可用来检测组织细胞中基因的表达水平或RNA病毒的含量 BC　[由分析可知：该技术包括从mRNA到cDNA的逆转录过程和从cDNA到DNA的扩增过程，故遗传信息的流动途径是RNA→DNA→DNA，A正确；该过程需要用到逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶，无需用到解旋酶，B错误；该技术中PCR扩增的DNA为cDNA，利用PCR技术扩增目的基因片段的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，C错误；RT­PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列，D正确。] 14．(11分)目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示。 (1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于____________________________。 (2)pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoR Ⅰ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoR Ⅰ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoR Ⅰ切割后所形成的黏性末端。 (3)pBR322分子中另有单个的BamH Ⅰ限制酶作用位点，现将经BamH Ⅰ处理后的质粒与用另一种限制酶Bgl Ⅱ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶的作用恢复____________键，成功地获得了重组质粒，这说明_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无Ampr和Tetr的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表型是____________________________，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是________。 [解析]　(1)构建人工质粒时要有抗性基因作为标记基因，用于重组DNA的鉴定和筛选或便于鉴别目的基因是否导入受体细胞。(2)EcoR Ⅰ只能识别核酸序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。根据限制酶的识别序列和切割位点进行解答。(3)DNA连接酶的作用是恢复磷酸二酯键；由题干可知，两种限制酶(BamH Ⅰ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同，这样才能进行相应的碱基互补配对。(4)与图三空圈相对应的图二中的菌落表型是能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素；图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是能抗氨苄青霉素和四环素的人工质粒即pBR322质粒。 [答案]　(除注明外，每空2分，共11分)(1)重组DNA的鉴定和筛选(鉴别目的基因是否导入受体细胞)　(2) (3)磷酸二酯　两种限制酶(BamH Ⅰ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同　(4)能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素　pBR322质粒(1分) 易错点　对限制酶的作用结果分辨不清 15．如表列举了几种限制酶识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)。如图是酶切后产生的几种末端。下列说法正确的是(　　) A．BamH Ⅰ切割的是磷酸二酯键，Alu Ⅰ切割的是氢键 B．能被Sau3A Ⅰ识别的序列，一定也能被BamH Ⅰ识别 C．DNA连接酶能连接②⑤，也能连接②④ D．E．coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接①③ C　[BamHⅠ与AluⅠ切割的均是磷酸二酯键，A错误；BamHⅠ识别并切割，Sau3AⅠ识别并切割，故BamHⅠ能识别的碱基序列，Sau3AⅠ一定能识别，但是Sau3AⅠ能识别的序列，BamHⅠ不一定能识别，B错误；②⑤的黏性末端相同，②④的黏性末端也相同，因此DNA连接酶能连接②⑤，也能连接②④，C正确；E．coli DNA连接酶是从大肠杆菌中获得的，可以连接黏性末端，T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端也可以连接平末端，图中①③均属于平末端，用T4 DNA连接酶连接，D错误。] 1 / 25 学科网（北京）股份有限公司 $