第2节 第1课时 目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建-【金版新学案】2024-2025学年高中生物选择性必修3同步课堂高效讲义配套课件（人教版2019 单选）

第1课时　目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建 　 第3章　第2节　基因工程的基本操作程序 学习目标 1．运用结构与功能和技术思维理解PCR技术的过程、原理、条件等内容。　 2．结合基因工程的基本操作程序，针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。 知识点一　目的基因的筛选与获取 1 知识点二　基因表达载体的构建 2 课时测评 5 学习小结 3 内容索引 随堂达标演练 4 目的基因的筛选与获取 知识点一 返回 新知导学 1．基因工程的四个步骤 (1)目的基因的____________。 (2) ______________的构建。 (3)将目的基因导入__________。 (4)目的基因的___________。 筛选与获取 基因表达载体 受体细胞 检测与鉴定 2．筛选合适的目的基因 预期表达产物 蛋白质 毒物降解 已知结构 功能清晰 3．获取目的基因的方法 (1)人工合成目的基因。 (2)常用______特异性地快速扩增目的基因。 (3)通过构建基因文库来获取目的基因。 4．利用PCR获取和扩增目的基因 (1)原理：_________________ PCR DNA半保留复制 (2)PCR反应的条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 DNA母链 提供DNA复制的_____ 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 (耐高温的)DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物(长度通常为20～30个核苷酸) 分为2种，分别与两条模板链结合，使DNA聚合酶能够从__________开始连接脱氧核苷酸 温度 控制温度使DNA复制在体外反复进行 缓冲液(含Mg2+) 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要_____激活 模板 引物的3′端 Mg2+ (3)PCR扩增的过程 ①变性：当温度超过____ ℃时，双链DNA _____为单链。 ②复性：当温度下降到____ ℃左右时， _________通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 ③延伸：当温度上升到____ ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在____________________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 (4)上一轮循环的产物可以作为下一个循环的_____，因而每一次循环后目的基因的量可以__________，即成_____形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。 (5)鉴定：常采用________________来鉴定PCR的产物。 90 解聚 50 两种引物 72 耐高温的DNA聚合酶 模板 增加一倍 指数 琼脂糖凝胶电泳 精通教材 1．PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？并说明理由。 提示：不是；PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。 2．PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应吗？ 提示：不是，DNA聚合酶催化子链的延伸，PCR反应中温度的周期性改变是为了变性、复性、延伸。 合作探究 任务　分析PCR技术的原理和过程 聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，回答下列问题： (1)结合下图分析PCR过程中为什么需要引物？DNA链复制的方向是怎样的？ 提示：DNA聚合酶不能从头合成子链，只能把游离的脱氧核苷酸连接到已经存在的片段上。加入引物，能够使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。DNA链复制的方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 (2)PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在G—C含量高时，对复性温度的设定有什么要求？说明理由。 提示：在引物的G—C含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。 (3)在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因(可用相关图解解释)? 提示：第3轮，如图所示： (4)图2是某同学设计的两组引物(只 标注了部分碱基序列)都不合理，请 分别说明理由。 提示：第1组，引物Ⅰ和引物Ⅱ会 因局部发生碱基互补配对而失效。第2组，引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效。 (5)要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？ 提示：要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。 (6)如果循环n次，则共需消耗多少对引物？ 提示：共需消耗2n－1对引物。 1．生物体内DNA复制与PCR反应的比较 核心归纳 项目 体内DNA复制 PCR反应 解旋 在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分DNA双链解开 90 ℃以上高温下解旋，DNA双链全部解开，不需要解旋酶 酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶 耐高温的DNA聚合酶 引物 一小段RNA 可以是RNA或单链DNA分子片段 项目 体内DNA复制 PCR反应 合成子链 在引物基础上，一条链连续合成；另一条链不连续合成，再由DNA连接酶连接 分别从两条链的引物的3′端开始延伸，都是连续合成 过程 循环次数 受生物体自身控制 30次左右 产物 完整DNA 两个引物之间的DNA片段 相同点 都需要DNA模板、4种脱氧核苷酸、分别与两条模板链相结合的两种引物；都是半保留复制，严格遵循碱基互补配对原则 2．PCR中的数量关系 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物的DNA分子数　　 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n 应用1．如图表示利用PCR技术扩增目的 基因的部分过程，其原理与细胞内DNA 复制类似。下列叙述错误的是 A．耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱 氧核苷酸连接到3′端 B．在第三轮循环产物中开始出现两条 脱氧核苷酸链等长的DNA片段 C．引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因 D．从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4 √ 由于复制过程中子链的合成方向是从5′端向3′端， 所以耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸 连接到3′端，A正确；图中的引物A和引物B均不 在该片段的端点，因此复制出的子链的长短从引 物开始一直延伸至模板链的末端，在第二轮复制 中才会出现两个引物之间的单链，因此以此单链 为模板在第三轮循环产物中可出现两条核苷酸链 等长的DNA片段，即引物之间的核苷酸序列，B正确；如果引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则会降低与模板链结合的效率，因此不能有效扩增目的基因，C正确；第三轮扩增共形成8个DNA分子，共16条链，除去原来的模板链，应该有新形成的14条链，且这14条链中均含有引物，两种引物使用的频率是相同的，即有7条单链含有引物A，每一条单链参与组成1个DNA分子，因此第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占7/8，D错误。 特别提醒 PCR过程的四点提醒 1．在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 2．引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 3．复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。 4．真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+。　　 应用2．(2024·河北沧州高二期末)引物在极大程度上决定了PCR的成败，下列关于引物的说法不正确的有 A．PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，PCR引物一般是单链DNA B．若引物的C—G碱基含量相对较高，PCR退火步骤的温度需要适当升高 C．在PCR的退火步骤，两种引物分别结合在模板链的3′端和5′端 D．若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，至少需要20 460个引物分子 √ PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，体内的DNA复制引物通常是RNA，PCR引物一般是单链DNA，A正确；G与C之间有3个氢键，稳定性高，若引物的C—G碱基含量相对较高，PCR退火步骤的温度需要适当升高，B正确；在PCR的退火步骤，两种引物都结合在模板链的3′端，C错误；若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，得到10×210个＝10 240个DNA分子，共10 240×2＝20 480条链，由于初始的20条链不需要引物，故至少需要20 480－20＝20 460个引物分子，D正确。 知识拓展 1．引物 (1)引物的本质：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，既可以是DNA单链，也可以是RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般是RNA片段。 (2)引物的长度：用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。 (3)一个PCR反应所需引物的种类：2种。DNA的两条链是反向平行的，2种引物要分别与两条模板链结合。 (4)在PCR设计引物：设计的两种引物之间的碱基序列不能互补配对。 知识拓展 2．如何用PCR扩增mRNA mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA—DNA杂交分子。②用一定的方法降解RNA—DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA，即cDNA。 返回 基因表达载体的构建 知识点二 返回 新知导学 1．构建基因表达载体的目的 (1)使目的基因在受体细胞中_________，并且可以_____给下一代。 (2)使目的基因能够_____和发挥作用。 2．基因表达载体的组成 稳定存在 遗传 表达 上游 RNA聚合酶 转录 目的基因 下游 标记基因 3．基因表达载体的构建过程 (1)先用一定的_______切割载体，使它出现一个切口； (2)然后用_____________或________________的限制酶切割含有目的基因的DNA片段； (3)再利用____________将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成重组DNA分子。 限制酶 同种限制酶 能产生相同末端 DNA连接酶 精通教材 1．(教材P80图3-6)观察基因表达载体构建模式图，写出结构①和②的名称：①_______，② _______；物质A和B的名称：A． _______，B．___________。 2．构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？ 提示：启动子下游和终止子上游；因为只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达。 启动子 终止子 限制酶 DNA连接酶 合作探究 任务　分析基因表达载体的构建 分析基因表达载体模式图，回答下面问题。 (1)如何区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子？ 提示：启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。 (2)为什么切割含有目的基因的DNA片段和载体要选用 同一种限制酶？是否只能用同一种限制酶？ 提示：选用同一种限制酶切割会产生相同的黏性末端， 可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体 连接起来。也可以使用能产生相同末端的限制酶切割。 (3)为什么一般不能将目的基因插入载体的标记基因中？ 提示：标记基因用于鉴定受体细胞是否成功导入目的基因，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进行进一步筛选。 基因表达载体构建时有关限制酶的选择 1．根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 (1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 (2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 (3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。 核心归纳 2．根据质粒的特点确定限制酶的种类 应用1．如图是利用基因工程技术培 育转基因植物，生产可食用疫苗的部 分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、 EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核 酸酶。下列说法错误的是 A．图示过程是基因工程的核心步骤 B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 √ 图示过程为基因表达载体的构建过程， 是基因工程中的核心步骤，A正确； 构建过程中需要将目的基因完整切 割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、 EcoRⅠ，用SmaⅠ会破坏目的基因， B错误；抗卡那霉素基因是标记基 因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞，C正确；基因表达载体包括复制原点、启动子、目的基因、终止子和标记基因等，D正确。 特别提醒 启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别   位置 作用 启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别结合位点，启动转录过程 起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始 终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束 终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束 应用2．(2024·浙江金华高三期末)东南 景天中的HMA3基因能编码Cd(镉)转运 蛋白，Cd转运蛋白能将土壤中的Cd吸 收进体内，现欲将东南景天中的HMA3 基因转入栾树，以增强栾树对Cd的富 集能力，从而有效治理Cd污染，科研人员利用下图结构构建重组DNA，图1为HMA3基因所在DNA示意图，图2为质粒结构示意图，下列叙述正确的是 A．欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少2轮获得 B．用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可得3条条带 C．构建含HMA3和GFP基因的重组质粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列 D．用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒的受体细胞 √ 欲获取HMA3基因，可用引物1、引物 2进行PCR循环至少3轮获得，A错误； 用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引 物2扩增的产物可能会得到引物带、引 物二聚体带、目的扩增产物带和非目的 扩增产物带等多条不同的条带，B错误；构建含HMA3和GFP基因的重组质粒时，需要有启动子和终止子序列，又不破坏GFP基因，因此需要在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列，C正确；用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒或含Ti质粒的受体细胞，这两种都有可能，D错误。 规律方法 如何筛选出含有目的基因的受体细胞 1．原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如下图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 2．被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。 规律方法 3．筛选方法：将混合处理后的细菌先放在 含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是 含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌， 如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒 布影印到含有四环素的培养基上，如图能生 长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基 上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 返回 学　习　小　结 返回 思维导图 要语必背 1.PCR是聚合酶链式反应的缩写，该技术的原理是DNA半保留复制。PCR每一次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。 2.PCR反应进行的条件有缓冲溶液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、温度条件等。 3.一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。 4.在构建基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，然后再用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶连接形成重组DNA分子。 返回 随 堂 达 标 演 练 返回 1．下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是 A．二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端 B．二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋 C．体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量 D．二者遵循的碱基互补配对原则相同 √ DNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA时，子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端，A正确；PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，在高温条件下氢键断裂，B错误；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量，但两者所需能量来源不同，C正确；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互补配对原则相同，D正确。 2．下图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是 A．片段a、b、c的长度均相同 B．片段a、b只是第一次循环的产物 C．片段c最早出现在第二次循环的产物中 D．经过30次循环后，片段c的数量为230 √ 图中片段a、b只有一种引物，是由原始DNA链为模板复制而来，其长度比片段c长，A错误；由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b，B错误；由于第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则最早出现在第二次循环，C正确；经过30次循环后，得到的DNA片段总数为230，这包括图中的片段a、b、c，D错误。 3．(2024·广东茂名高三期末)在细菌和病毒类疾病检测、遗传疾病诊断、肿瘤筛查和诊断中，都可采用PCR技术。PCR反应由变性→复性→延伸三个基本反应步骤构成，PCR完成以后常需要鉴定PCR的产物。下列叙述正确的是 A．变性：耐高温的DNA聚合酶将双链DNA解链为单链 B．复性：两种引物与两条单链DNA结合不必控制温度 C．延伸：4种脱氧核苷酸加到引物的5′端 D．鉴定：DNA聚合酶质量不好可能导致鉴定结果不仅有一条带 √ 变性过程中DNA双链解开是温度作用的结果，不是耐高温的DNA聚合酶的作用，A错误；两种引物与两条单链DNA结合需要适宜的温度，B错误；DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸的，4种脱氧核苷酸加到引物的3′端，C错误；DNA聚合酶质量不好可能导致实验失败，出现不仅一条带，D正确。 4．下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是 A．启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，组成它的基本单位是脱氧核苷酸 B．基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因等组件 C．人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达 D．由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别 √ 启动子在基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，组成它的基本单位是脱氧核苷酸，A正确；基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等，终止密码子位于mRNA上，B错误；人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达，C正确；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，D正确。 5．(2024·江苏苏州高二期末)某科 研小组利用质粒(图甲)和目的基因 (图乙)构建重组DNA。下列分析不 正确的是 A．用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割 质粒，可得到2条DNA片段 B．不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因 C．构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA D．导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长 √ 限制酶HindⅢ和PstⅠ在质粒上各 有一个识别切割位点，用HindⅢ 和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA 片段，A正确；AluⅠ的切割位点 位于目的基因中，用AluⅠ酶切割 外源DNA会破坏目的基因，B正 确；不宜选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，因为质粒中的两个标记基因均会被破坏，且DNA会反向连接至载体上，C错误；构建重组DNA时，选择限制酶HindⅢ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA，会破坏质粒中的氯霉素抗性基因，保留四环素抗性基因，所以导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长，D正确。 6．(创新情境)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题： (1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是__________(用数字序号表示)。 ④②③① PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。 (2)操作③中使用的酶是___________________________________，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中变性的结果是__________________________。 Taq DNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶)　　 延伸　 双链DNA解聚成两条单链 在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，操作③中使用的酶是Taq DNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶)，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中变性的结果是双链DNA解聚成两条单链。 (3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与______________特异性结合。 两条单链DNA DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与两条单链DNA特异性结合。 (4)PCR(聚合酶链式反应)技术是指__________________________________ _________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。 一项在生物体外复制特定DNA片段 的核酸合成技术 据分析可知，PCR(聚合酶链式反应)技术是指一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 返回 课　时　测　评 返回 知识点一　目的基因的筛选与获取 1．下列关于PCR反应体系中所加物质作用的叙述，错误的是 A．耐高温的DNA聚合酶用于催化DNA子链的合成 B．引物使耐高温的DNA聚合酶能从引物的5′端延伸DNA链 C．目标DNA的双链用作DNA复制的模板 D．四种脱氧核苷酸为PCR提供原料 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 通过PCR技术扩增目的基因时，需要用耐高温的DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸聚合形成DNA子链，A正确；在复制时，引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，耐高温的DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，因此DNA合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，B错误；PCR技术的原理是DNA半保留复制，DNA复制时两条链均作为复制的模板，C正确；DNA合成的原料是四种脱氧核苷酸，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2．(2024·山西忻州高三期末)将 水稻耐盐碱基因OsMYB56导入 不耐盐碱水稻品种吉粳88中， 培育耐盐碱海水稻新品种。右 图PCR扩增OsMYB56时需要添加引物，应选用的引物组合为 A．5′-CTTGGATGAT-3′和5′-TCTGTTGAAT-3′ B．5′-CTTGGATGAT-3′和5′-TAAGTTGTCT-3′ C．5′-ATTCAACAGA-3′和5′-ATCATCCAAG-3′ D．5′-ATTCAACAGA-3′和5′-GAACCTACTA-3′ √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 —P端为DNA链的5′端，—OH端为DNA链的3′端。进行PCR时，引物与模板链的3′端结合，因此在扩增OsMYB56时需要添加的引物是5′-CTTGGATGAT-3′和5′-TCTGTTGAAT-3′，A项符合题意。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 3．(2024·新疆乌鲁木齐高三期末)在基因工程中，常用PCR特异性地快速扩增目的基因。下列叙述正确的是 A．PCR的变性是通过解旋酶将DNA的两条模板链分开的过程 B．PCR的复性是目的基因的两条模板链相互结合的过程 C．在PCR的延伸过程中，DNA聚合酶将脱氧核苷酸加到引物的5′端 D．PCR过程中每循环一次会使目的基因的数目增加一倍 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 PCR的变性是通过高温将DNA的两条模板链分开的过程，A错误；PCR的复性是降低温度使目的基因的DNA模板链与引物结合，为后续子链延伸做准备，B错误；PCR过程中，在DNA聚合酶的作用下将4种脱氧核苷酸加到引物的3′端，实现子链的延伸过程，C错误；PCR是一项体外扩增DNA的技术，PCR过程中每循环一次会使目的基因的数目增加一倍，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 4．冠状病毒的检测可以采用实时 荧光RT－PCR(逆转录聚合酶链式 反应)的方法，RT－PCR的具体过 程如图。下列叙述错误的是 A．过程①以mRNA为模板合成单 链DNA B．过程②③拟对单链cDNA进行第n次循环的扩增，理论上需要n个引物B C．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度 D．游离的脱氧核苷酸只能从引物的3′端开始连接 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 过程①是由mRNA形成单链DNA 的过程，表示逆转录，A正确；过 程②③拟对单链cDNA进行n次循 环的扩增，根据DNA分子半保留 复制特点可知，第n次循环理论上 至少需要2n-1个引物B，B错误；利用实时荧光RT－PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测时可提高检测的灵敏度，是因为增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度)，便于检测，C正确；游离的脱氧核苷酸只能从引物的3′端开始连接，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 知识点二　基因表达载体的构建 5．如图是基因工程中基因表达载体的模式图，结构X是表达载体所必需的，X最可能是 A．目的基因插入位点 B．启动子 C．标记基因 D．DNA聚合酶识别位点 √ 基因表达载体由启动子、终止子、标记基因、复制原点和目的基因等组成。题图中有终止子、标记基因(抗生素抗性基因)、目的基因、复制原点等，还缺少启动子。启动子位于基因的上游，所以X最可能是启动子，B正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 6．某实验小组利用下图所示的质粒和目的基因来构建基因表达载体，将目的基因导入大肠杆菌细胞并表达。下列叙述正确的是 A．图中的质粒用酶A切割后，会产生8个游离的磷酸基团 B．在构建重组质粒时，可用酶A和酶C切割质粒和目的基因 C．成功导入目的基因的大肠杆菌可在含四环素的培养基中生长 D．若用酶B和酶C切割，可以避免质粒的自身环化 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 限制酶每一次切割后会得到两个黏 性末端，会有2个游离的磷酸基团， 而图中的质粒含有2个酶A的切割位 点，则会产生4个游离的磷酸基团， A错误；在构建重组质粒时，可用 酶B和酶C切割质粒和目的基因，假如用酶A切割质粒会破坏两个标记基因，B错误；用酶B和酶C切割质粒时四环素抗性基因被破坏，成功导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长，C错误；用酶B和酶C两种限制酶切割可以避免目的基因和质粒自身环化和两者之间的反向连接等问题，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 7．(2024·安徽徽州高三开学考试)为实现高效降解厨余垃圾中纤维素的目的，科研人员将纤维素内切葡聚糖前基因导入蕊酵母中，获得能高效表达EGⅢ基因的基因工程菌，下图示中BamHⅠ、EcoRⅠ、SalⅠ为限制酶。下列叙述错误的是 A．构建重组质粒需用到BamHⅠ、SalⅠ和DNA连接酶 B．筛选目的菌时，所用的培养基中应含有氨苄青霉素 C．培育该基因工程菌与培育三倍体无子西瓜所运用的原理相同 D．质粒中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 据图可知，EcoRⅠ会破坏目的基因， 因此构建重组质粒需用到BamHⅠ、 SalⅠ，然后用DNA连接酶进行拼接， A正确；SalⅠ会破坏卡那霉素抗性基 因，筛选目的菌时，所用培养基中应含有氨苄青霉素，B正确；培育该基因工程菌运用的原理是基因重组，培育三倍体无子西瓜所运用的原理是染色体数目变异，C错误；质粒中的启动子是一段特殊序列的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 8．DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体产生免疫应答。可选择的限制酶分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是 A．构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒 B．若用EcoRⅠ切割质粒，产生的DNA片段具有黏性末端 C．用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，会产生多种连接产物 D．图乙质粒用EcoRⅠ切割前后，分别含有2个和4个游离的磷酸基团 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 分析题图，外源DNA分子和质粒上 都含有3种限制酶(BglⅡ、EcoRⅠ 和Sau3AⅠ)的切割位点，为了防止 目的基因和质粒自身环化和两者之 间的反向连接，构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒，A正确；EcoRⅠ切割后获得的是黏性末端，B正确；用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，能产生多种连接产物，如目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因与质粒正向连接、目的基因与质粒反向连接等，C正确；图乙质粒用EcoRⅠ切割前为环状DNA分子，不含游离的磷酸基团，切割后为链状DNA分子，含有2个游离的磷酸基团，D错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 9．(2024·山西太原高三期末)下图表示形成cDNA并进行PCR扩增的过程。据图分析，下列叙述正确的是 A．①过程所需的原料是核糖核苷酸 B．②过程所需的酶必须耐高温 C．③过程需要解旋酶破坏氢键 D．④过程的引物碱基对之间不能互补配对 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 ①为逆转录，所需原料是脱 氧核苷酸，A错误；②过程 由DNA单链合成DNA双链过 程所需要的DNA聚合酶不需 要耐高温，B错误；③过程 为变性，温度上升到超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链，不需要解旋酶破坏氢键，C错误；④过程为复性，温度降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，但引物碱基对之间不能互补配对，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 10．(2024·江苏南通高二期中)下列关于PCR过程及结果的叙述，错误的是 A．相比细胞内DNA复制，PCR过程不需要解旋酶、DNA连接酶等 B．复性的温度设定与引物有关，延伸时间的设定与扩增片段的长度有关 C．若酶和引物都正常，但是未出现扩增带，其原因可能是核酸模板变性不彻底 D．理论上推测，经n轮循环后的产物中只含1种引物的DNA片段占比为1/(2n－1) √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 PCR与细胞内DNA复制破坏氢键的原理不同，其中PCR通过高温破坏氢键，PCR过程不需要解旋酶、DNA连接酶等，A正确；复性的温度设定与引物有关，当其中G－C碱基对多时，温度较高，而延伸时间的设定与扩增片段的长度有关，长度越大，则时间越长，B正确；PCR扩增的过程包括变性—复性—延伸过程，其中变性是在高温条件下将DNA双链解开，作为模板，若是酶和引物都正常工作，但是不出现扩增带，其原因可能是核酸模板变性不彻底，C正确；DNA进行半保留复制，每次复制都需要两种引物结合在DNA的两端，经过n轮循环产物共2n个DNA分子，仅含有其中一种引物的DNA片段为2个，故理论上推测，经过n轮循环产物中只含有一种引物的DNA片段所占比例为2/2n＝1/2n-1，D错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 11．限制酶的发现为DNA的切割和功能 基因的获得创造了条件。限制酶Sau3AⅠ、 EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列及切割位点 分别为↓GATC、G↓AATTC、G↓GATCC。含某目的基因的DNA片段如图所示，若利用质粒A(含限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点各1个)构建基因表达载体，为克服目的基因和质粒A的自身环化以及目的基因与质粒的任意连接等，应该如何选择限制酶？ A．用限制酶EcoRⅠ或BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A B．用限制酶Sau3AⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A C．用限制酶Sau3AⅠ和EcoRⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A D．用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 限制酶Sau3AⅠ切割目的基因会破坏 目的基因，B、C错误；质粒含有限 制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点， 获取目的基因也可以用限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ单独切割，但为了防止目的基因或质粒自身环化，需要使用不同种限制酶进行切割，所以可以使用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ去切割质粒，也可以用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ去切割目的基因，则获得重组质粒会进行正常连接，A错误，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 12．下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述不正确的是 A．应选择的限制酶组合是酶F和酶G B．所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因 C．用含氨苄青霉素的培养基筛选出的一定是含重组质粒的受体菌 D．同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到4个条带 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 为避免切割后DNA片段的自 身环化，又至少保留质粒上 的一个标记基因，切割时应 选择的限制酶组合是酶F和 酶G，A正确；所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因，以便于对含有目的基因的受体菌的选择，B正确；用含氨苄青霉素的培养基筛选出的有导入重组质粒的受体菌和导入原质粒的受体菌，C错误；据图可知同时用三种限制酶处理图中质粒，因酶E有两个作用位点，故将质粒切割成了4个DNA片段，电泳后可得到4个条带，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 13．蜘蛛丝是天然蛋白纤维，其机械性能高于 常用于制作防弹衣的凯夫拉纤维，有广泛的应 用前景。近期，中国科学家利用质粒(如图)成 功构建了蛛丝蛋白基因的重组质粒，并在家蚕 丝腺细胞中获得大量蛛丝蛋白。下列有关说法 不正确的是 A．为防止目的基因自身环化，可以用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因 B．构建表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于基因在家蚕丝腺细胞中表达 C．启动子是RNA聚合酶的识别和结合部位，可以驱动遗传信息的复制和转录 D．基因表达载体中的标记基因可以鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因，可以 使目的基因两端产生不同的黏性末端，防止 目的基因自身环化，A正确；为能从家蚕丝 腺细胞中提取蛛丝蛋白，基因表达载体中目 的基因的上游必须含有使其能在家蚕丝腺细 胞中转录的启动子，即构建表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于基因在家蚕丝腺细胞中表达，B正确；启动子只能驱动基因转录，不能驱动其复制，C错误；基因表达载体中的标记基因的作用是鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 14．(10分)下列与基因工程有关的图示中，图1为限制酶EcoRⅠ的识别序列及酶切位点，图2表示目的基因及相关的限制酶切点，图3表示目的基因上的部分DNA片段，图4表示质粒。回答下列问题。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (1)获得图2中目的基因的方法除PCR技术外，还有______________________________。 从基因文库中获取、人工合成 获得目的基因的方法有PCR技术、从基因文库中获取、人工合成。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (2)采用PCR扩增目的基因的原理是_________________，图2中A、B、C、D 4种单链DNA片段中，有_______两种引物(DNA复制方向由5′→3′)。 DNA半保留复制 B、C 采用PCR扩增目的基因的原理是DNA半保留复制，由图2可知，DNA复制只能从5′端到3′端，因此构建前利用PCR技术扩增基因时，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取B和C作为引物。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (3)图3为目的基因中的某一DNA片段，下列有关叙述错误的是_______(填下列字母，不定项)。 a．该片段的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成 b．该片段含A－T碱基对比较多，故其结构比较稳定 c．若利用PCR扩增该片段，则需解旋酶将①氢键全部解开 d．若图3中该目的基因部分片段复制6次，则需要碱基A的数量是252个 bcd DNA的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成，a正确；其结构中G—C碱基对越多，分子结构越稳定，b错误；PCR技术利用高温解开氢键，不需要解旋酶，c错误；由图3可知，目的基因的该片段上碱基A有2个，复制6次需要碱基A的数量为26×2－2＝126个，d错误。故选b、c、d。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (4)在构建目的基因表达载体时，用PstⅠ、EcoRⅠ两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时产生____________________________ __________________________，从图2切割下目的基因需要消耗_____个水分子。不选用限制酶PstⅠ和HindⅢ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是___________________。 目的基因和质粒的自身连接以 及目的基因与质粒反向连接 4 会破坏全部标记基因 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 在构建目的基因表达载体时，用PstⅠ、EcoRⅠ两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时产生目的基因和质粒的自身连接以及目的基因与质粒反向连接。限制酶破坏的是磷酸二酯键，图中目的基因切割需要破坏4个磷酸二酯键，因此需要消耗4个水分子。由图可知，不选用限制酶PstⅠ和HindⅢ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是会破坏全部标记基因。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 15．(14分)图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性内切核酸酶识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题： 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (1)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，其产物长度为________________________。 537 bp、790 bp、661 bp SmaⅠ的识别序列和酶切位点是CCC↓GGG，可知其切割产生的末端是平末端，产物长度是534＋3＝537 bp、796－3－3＝790 bp、658＋3＝661 bp。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (2)若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从隐性纯合子分离出图1对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有______种不同DNA片段。为了提高实验成功率，需要通过_______技术扩增目的基因，以获得目的基因的大量拷贝，该技术原理为_________________。 2　 PCR DNA半保留复制　 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，则基因D就突变为基因d，且基因d只有一个SmaⅠ的酶切位点，因而基因d会被SmaⅠ切割形成两个片段(长度分别为1 327 bp、661 bp)。为了提高实验成功率，可以通过PCR技术大量扩增目的基因，以获得目的基因的大量拷贝，该技术模拟了体内DNA复制的过程，原理为DNA半保留复制。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (3)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是________。在导入重组质粒后，为了筛选出含质粒的大肠杆菌，一般需要用添加_________的培养基进行培养，想进一步筛选出含重组质粒的受体细胞，还需要接种到含_________的培养基中培养。 BamHⅠ　 抗生素B　 抗生素A 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 由图可知，目的基因D两侧及质粒中都有限 制酶BamHⅠ的识别序列，因此应选用限制 酶BamHⅠ切割图1中含有目的基因D的外源 DNA分子和图2中的质粒。用BamHⅠ切割质 粒后会破坏抗生素A抗性基因，但不会破坏抗 生素B抗性基因，因此一般需要用添加抗生素 B的培养基进行培养；若想进一步筛选出含重 组质粒的受体细胞，还需要接种到含抗生素A的培养基中培养筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 (4)假设用BamHⅠ切割DNA获取目的基因，用MboⅠ切割质粒，然后形成重组质粒，若将插入在抗生素B抗性基因处的目的基因重新切割下来，能否再次用BamHⅠ_________(填“可以”、“不可以”或“不一定”)，原因是________________________________________________________。 不一定 因为目的基因和抗生素B抗性基因拼接处不一定出现GGATCC 假设用BamHⅠ切割DNA获取目的基因，用MboⅠ切割质粒，然后形成重组质粒，若将插入在抗生素B抗性基因处的目的基因重新切割下来，再次用BamHⅠ不一定能将其切割，因为目的基因和抗生素B抗性基因的黏性末端随意连接，拼接处不一定出现GGATCC。 返回 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 谢 谢 观 看 ！ 第 3 章 　 基 因 工 程 $$