第2节 第1课时 目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建-【金版新学案】2024-2025学年高中生物选择性必修3同步课堂高效讲义教师用书（人教版2019 不定项）

第2节　基因工程的基本操作程序 第1课时　目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建 [学习目标]　1.运用结构与功能和技术思维理解PCR技术的过程、原理、条件等内容。　2.结合基因工程的基本操作程序，针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。 知识点一　目的基因的筛选与获取 1．基因工程的四个步骤 (1)目的基因的筛选与获取。 (2)基因表达载体的构建。 (3)将目的基因导入受体细胞。 (4)目的基因的检测与鉴定。 2．筛选合适的目的基因 3．获取目的基因的方法 (1)人工合成目的基因。 (2)常用PCR特异性地快速扩增目的基因。 (3)通过构建基因文库来获取目的基因。 4．利用PCR获取和扩增目的基因 (1)原理：DNA半保留复制 (2)PCR反应的条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 (耐高温的) DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物(长度通常为20～30个核苷酸) 分为2种，分别与两条模板链结合，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 温度 控制温度使DNA复制在体外反复进行 缓冲液(含Mg2+) 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活 (3)PCR扩增的过程 ①变性：当温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链。 ②复性：当温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 ③延伸：当温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 (4)上一轮循环的产物可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。 (5)鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 [精通教材] 1．PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？并说明理由。 提示：不是；PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。 学生用书第93页 2.PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应吗？ 提示：不是，DNA聚合酶催化子链的延伸，PCR反应中温度的周期性改变是为了变性、复性、延伸。 任务　分析PCR技术的原理和过程 聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，回答下列问题： (1)结合下图分析PCR过程中为什么需要引物？DNA链复制的方向是怎样的？ 提示：DNA聚合酶不能从头合成子链，只能把游离的脱氧核苷酸连接到已经存在的片段上。加入引物，能够使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。DNA链复制的方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 (2)PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在G—C含量高时，对复性温度的设定有什么要求？说明理由。 提示：在引物的G—C含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。 (3)在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因(可用相关图解解释)？ 提示：第3轮，如图所示： (4)图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。 提示：第1组，引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效。第2组，引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效。 (5)要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？ 提示：要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。 (6)如果循环n次，则共需消耗多少对引物？ 提示：共需消耗2n－1对引物。 [核心归纳] 1．生物体内DNA复制与PCR反应的比较 项目 体内DNA复制 PCR反应 解旋 在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分DNA双链解开 90 ℃以上高温下解旋，DNA双链全部解开，不需要解旋酶 酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶 耐高温的DNA聚合酶 引物 一小段RNA 可以是RNA或单链DNA分子片段 学生用书第94页 合成子链 在引物基础上，一条链连续合成；另一条链不连续合成，再由DNA连接酶连接 分别从两条链的引物的3′端开始延伸，都是连续合成 过程 循环次数 受生物体自身控制 30次左右 产物 完整DNA 两个引物之间的DNA片段 相同点 都需要DNA模板、4种脱氧核苷酸、分别与两条模板链相结合的两种引物；都是半保留复制，严格遵循碱基互补配对原则 2.PCR中的数量关系 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物的DNA分子数　　 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n 应用1.如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是(　　) A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端 B．在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 C．引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因 D．从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4 答案：D 解析：由于复制过程中子链的合成方向是从5′端向3′端，所以耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端，A正确；图中的引物A和引物B均不在该片段的端点，因此复制出的子链的长短从引物开始一直延伸至模板链的末端，在第二轮复制中才会出现两个引物之间的单链，因此以此单链为模板在第三轮循环产物中可出现两条核苷酸链等长的DNA片段，即引物之间的核苷酸序列，B正确；如果引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则会降低与模板链结合的效率，因此不能有效扩增目的基因，C正确；第三轮扩增共形成8个DNA分子，共16条链，除去原来的模板链，应该有新形成的14条链，且这14条链中均含有引物，两种引物使用的频率是相同的，即有7条单链含有引物A，每一条单链参与组成1个DNA分子，因此第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占7/8，D错误。 PCR过程的四点提醒 1．在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 2．引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 3．复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。 4．真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+。　　 应用2.(2024·河北沧州高二期末)引物在极大程度上决定了PCR的成败，下列关于引物的说法不正确的有(　　) 学生用书第95页 A.PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，PCR引物一般是单链DNA B．若引物的C—G碱基含量相对较高，PCR退火步骤的温度需要适当升高 C．在PCR的退火步骤，两种引物分别结合在模板链的3′端和5′端 D．若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，至少需要20 460个引物分子 答案：C 解析：PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，体内的DNA复制引物通常是RNA，PCR引物一般是单链DNA，A正确；G与C之间有3个氢键，稳定性高，若引物的C—G碱基含量相对较高，PCR退火步骤的温度需要适当升高，B正确；在PCR的退火步骤，两种引物都结合在模板链的3′端，C错误；若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，得到10×210个＝10 240个DNA分子，共10 240×2＝20 480条链，由于初始的20条链不需要引物，故至少需要20 480－20＝20 460个引物分子，D正确。 1．引物 (1)引物的本质：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，既可以是DNA单链，也可以是RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般是RNA片段。 (2)引物的长度：用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。 (3)一个PCR反应所需引物的种类：2种。DNA的两条链是反向平行的，2种引物要分别与两条模板链结合。 (4)在PCR设计引物：设计的两种引物之间的碱基序列不能互补配对。 2．如何用PCR扩增mRNA mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA—DNA杂交分子。②用一定的方法降解RNA—DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA，即cDNA。 　　 知识点二　基因表达载体的构建 1．构建基因表达载体的目的 (1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。 (2)使目的基因能够表达和发挥作用。 2．基因表达载体的组成 3．基因表达载体的构建过程 (1)先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口； (2)然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段； (3)再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成重组DNA分子。 [精通教材] 1．(教材P80图3­6)观察基因表达载体构建模式图，写出结构①和②的名称：①启动子，②终止子；物质A和B的名称：A.限制酶，B.DNA连接酶。 2．构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？ 提示：启动子下游和终止子上游；因为只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达。 学生用书第96页 任务　分析基因表达载体的构建 分析基因表达载体模式图，回答下面问题。 (1)如何区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子？ 提示：启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。 (2)为什么切割含有目的基因的DNA片段和载体要选用同一种限制酶？是否只能用同一种限制酶？ 提示：选用同一种限制酶切割会产生相同的黏性末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。也可以使用能产生相同末端的限制酶切割。 (3)为什么一般不能将目的基因插入载体的标记基因中？ 提示：标记基因用于鉴定受体细胞是否成功导入目的基因，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进行进一步筛选。 [核心归纳] 基因表达载体构建时有关限制酶的选择 1．根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 (1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 (2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 (3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。 2．根据质粒的特点确定限制酶的种类 应用1.如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(　　) A．图示过程是基因工程的核心步骤 B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 答案：B 解析：图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤，A正确；构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，用SmaⅠ会破坏目的基因，B错误；抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞，C正确；基因表达载体包括复制原点、启动子、目的基因、终止子和标记基因等，D正确。 启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别 位置 作用 启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别结合位点，启动转录过程 起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始 终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束 终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束 学生用书第97页 应用2.(2024·浙江金华高三期末)东南景天中的HMA3基因能编码Cd(镉)转运蛋白，Cd转运蛋白能将土壤中的Cd吸收进体内，现欲将东南景天中的HMA3基因转入栾树，以增强栾树对Cd的富集能力，从而有效治理Cd污染，科研人员利用下图结构构建重组DNA，图1为HMA3基因所在DNA示意图，图2为质粒结构示意图，下列叙述正确的是(　　) A．欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少2轮获得 B．用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可得3条条带 C．构建含HMA3和GFP基因的重组质粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列 D．用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒的受体细胞 答案：C 解析：欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少3轮获得，A错误；用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可能会得到引物带、引物二聚体带、目的扩增产物带和非目的扩增产物带等多条不同的条带，B错误；构建含HMA3和GFP基因的重组质粒时，需要有启动子和终止子序列，又不破坏GFP基因，因此需要在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列，C正确；用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒或含Ti质粒的受体细胞，这两种都有可能，D错误。 如何筛选出含有目的基因的受体细胞 1．原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如下图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 2．被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。 3．筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。　　 思维导图 要语必背 1.PCR是聚合酶链式反应的缩写，该技术的原理是DNA半保留复制。PCR每一次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。 2.PCR反应进行的条件有缓冲溶液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、温度条件等。 3.一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。 4.在构建基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，然后再用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶连接形成重组DNA分子。 学生用书第98页 1．下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是(　　) A．二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端 B．二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋 C．体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量 D．二者遵循的碱基互补配对原则相同 答案：B 解析：DNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA时，子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端，A正确；PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，在高温条件下氢键断裂，B错误；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量，但两者所需能量来源不同，C正确；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互补配对原则相同，D正确。 2．下图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是(　　) A．片段a、b、c的长度均相同 B．片段a、b只是第一次循环的产物 C．片段c最早出现在第二次循环的产物中 D．经过30次循环后，片段c的数量为230 答案：C 解析：图中片段a、b只有一种引物，是由原始DNA链为模板复制而来，其长度比片段c长，A错误；由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b，B错误；由于第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则最早出现在第二次循环，C正确；经过30次循环后，得到的DNA片段总数为230，这包括图中的片段a、b、c，D错误。 3．(2024·广东茂名高三期末)在细菌和病毒类疾病检测、遗传疾病诊断、肿瘤筛查和诊断中，都可采用PCR技术。PCR反应由变性→复性→延伸三个基本反应步骤构成，PCR完成以后常需要鉴定PCR的产物。下列叙述正确的是(　　) A．变性：耐高温的DNA聚合酶将双链DNA解链为单链 B．复性：两种引物与两条单链DNA结合不必控制温度 C．延伸：4种脱氧核苷酸加到引物的5′端 D．鉴定：DNA聚合酶质量不好可能导致鉴定结果不仅有一条带 答案：D 解析：变性过程中DNA双链解开是温度作用的结果，不是耐高温的DNA聚合酶的作用，A错误；两种引物与两条单链DNA结合需要适宜的温度，B错误；DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸的，4种脱氧核苷酸加到引物的3′端，C错误；DNA聚合酶质量不好可能导致实验失败，出现不仅一条带，D正确。 4．下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是(　　) A．启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，组成它的基本单位是脱氧核苷酸 B．基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因等组件 C．人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达 D．由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别 答案：B 解析：启动子在基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，组成它的基本单位是脱氧核苷酸，A正确；基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等，终止密码子位于mRNA上，B错误；人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达，C正确；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，D正确。 5．(2024·江苏苏州高二期末)某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析不正确的是(不定项)(　　) A．用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到3条DNA片段 B．不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因 C．构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA D．导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长 答案：AC 解析：限制酶HindⅢ和PstⅠ在质粒上各有一个识别切割位点，用HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段，A错误；AluⅠ的切割位点位于目的基因中，用AluⅠ酶切割外源DNA会破坏目的基因，B正确；不宜选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，因为质粒中的两个标记基因均会被破坏，且DNA会反向连接至载体上，C错误；构建重组DNA时，选择限制酶HindⅢ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA，会破坏质粒中的氯霉素抗性基因，保留四环素抗性基因，所以导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长，D正确。 6．(创新情境)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题： (1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是　　　　　(用数字序号表示)。 (2)操作③中使用的酶是　　　　，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、　　　三步，其中变性的结果是_____________________________________________________。 (3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与　　　　　　　特异性结合。 (4)PCR(聚合酶链式反应)技术是指_____________________________________ __________________________________________________________________。 该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。 答案：(1)④②③①　(2)Taq DNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶)　延伸　双链DNA解聚成两条单链　(3)两条单链DNA　(4)一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术 解析：(1)PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。(2)在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，操作③中使用的酶是Taq DNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶)，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中变性的结果是双链DNA解聚成两条单链。(3)DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与两条单链DNA特异性结合。(4)据分析可知，PCR(聚合酶链式反应)技术是指一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 学科网（北京）股份有限公司 $$