2025届高三生物一轮复习知识清单：微生物

第32讲 微生物 考点一 传统发酵技术的应用 一、基础知识 1、 概念 （1）发酵：人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。 （2）传统发酵技术：指直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术。 2、类型： （1）根据是否需要氧气分为：需氧型发酵和厌氧型发酵。 （2）根据产生的产物可分为：酒精发酵、乳酸发酵、醋酸发酵等。 3、补充新陈代谢的类型：新陈代谢可以分为同化作用和异化作用两个方面。一方面，生物有机体把从环境中摄取的物质，经一系列的化学反应转变为自身物质。这一过程称为同化作用，即物质从外界到体内，从小分子到大分子。因此，同化作用是一个吸收能量的过程，如绿色植物利用光合作用，把环境中的水和二氧化碳等物质转化为淀粉、纤维素等物质。与此相反的是异化作用，即从体内到外界环境，物质由大分子转变为小分子的过程，这是一个释放能量的过程，同时把生物体不需要或不能利用的物质排出体外。 依同化作用的方式不同，可把生物分成自养型和异养型两类。人们把摄取现成有机物而生活的生物称为异养型生物； 把能从环境中吸收简单无机物同化为复杂有机物的生物称为自养型生物。 按生物异化作用的方式 （即呼吸类型）的不同可分为需氧生物和厌氧生物两类。 注意：在考虑生物的新陈代谢类型时，既要考虑同化作用类型还要考虑异化作用类型，因此此考点有三种出题方式：（1）新陈代谢类型（有4种答案）；（2）同化作用的类型（有2种答案）；（3）异化作用的类型（有2种答案）； 二、果酒与果醋的制作 1、果酒制作的原理 （1）菌种是酵母菌，属于真核生物，新陈代谢类型异养兼性厌氧型，有氧时进行有氧呼吸，大量繁殖（以出芽生殖为主），反应式为：C6H12O6+6H2O+6O2 → 6CO2+12H2O+能量；无氧时能进行酒精发酵，反应式为：酶 酶 C6H12O6 → 2C2H5OH+2CO2+能量。 （2）酿酒酵母的最适生长温度28℃左右，酒精发酵一般控制在18～30℃。 （3）自然发酵过程中，起作用的主要是附着于葡萄皮上的野生型酵母菌（注意理解制酒时，为什么不能多次冲洗。） 2、果醋制作的原理 （1）菌种是醋酸菌，属于原核生物，新陈代谢类型为异养需氧型。只有在氧气充足时，才能进行旺盛的生命活动。变酸的酒表面观察到的菌膜就是醋酸菌在液面大量繁殖形成的，其繁殖方式为分裂生殖。酶 （2）当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸，反应简式为C6H12O6+2O2 → 2CH3COOH+2H2O+2CO2+能量。当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，反应简式为C2H5OH+O2 → CH3COOH+H2O+能量。（注意：在简答题中经常出现，要求重点记忆）酶 （3）醋酸菌的最适生长温度为30～35℃。 （4）菌种来源：到生产食醋的工厂或菌种保藏中心购买，或从食醋中分离醋酸菌。 3、实验流程图 挑选葡萄 冲洗 榨汁 酒精发酵 果酒（→醋酸发酵→果醋） 4、操作提示 （1）材料的选择与处理 选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄进行冲洗（冲洗的目是洗去灰尘，但不要太干净，以防止洗去附着于葡萄皮上野生型酵母菌），然后再除去枝梗。 （2）防止发酵液被污染 1、榨汁机要清洗干净，并晾干。 2、发酵瓶要清洗干净，用体积分数70% 的酒精消毒。 3、装入葡萄汁后，封闭充气口。 （3）控制好发酵条件 1、葡萄汁装入发酵瓶时，要留出大约1/3的空间（目的是先让酵母菌进行有氧呼吸快速繁殖，耗尽O2后再进行酒精发酵；同时可防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出）。 2、制作葡萄酒过程中，将温度严格控制在18～30℃，时间控制在10～12d左右，可通过出料口对发酵的情况进行及时的监测。 3、制作葡萄醋的过程中，将温度严格控制在30～35℃，时间控制在7～8d左右，并注意适时通过充气口充气。 （4）酿酒过程中不需要严格灭菌的原因：在缺氧、呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数微生物都因无法适应这一环境而受抑制。（简答题的答案，重点记忆） 5、果酒制作与果醋制作的比较 6、具体流程及相关操作目的 7、知识延伸 （1）如何判断果酒的制作是否成功？ ①发酵后取样，通过嗅味或品尝进行初步鉴定； ②显微镜观察酵母菌数量变化进行鉴定； ③用重铬酸钾来检验是否有酒精产生。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。检测时，先在试管中加入发酵液2mL，再滴入物质的量的浓度为3mol/L的H2SO43滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液3滴。 （2）如何判断果醋的制作是否成功？ ①通过嗅味或品尝进行初步鉴定； ②显微镜观察醋酸菌数量变化进行鉴定；3、检测发酵前后的PH作进一步鉴定。 8、常见简答题答案 （1）你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？ 提示：应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。 （2）你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？ 提示：葡萄应先冲洗、再去枝梗；榨汁机、发酵装置要清洗干净；每次排气时只需拧松瓶盖、不要完全揭开瓶盖等。 （3）制葡萄酒时，为什么要将温度控制在18～30℃？制葡萄醋时，为什么要将温度控制在30～35 ℃？ 提示：温度是酵母菌生长和发酵的重要条件，28 ℃左右最适合酵母菌繁殖。因此需要将温度控制在其最适温度范围内。而醋酸菌是嗜温菌，最适生长温度为30～35 ℃，因此要将温度控制在30～35 ℃。 （4）制葡萄醋时，为什么要适时通过充气口充气？ 提示：醋酸菌是好氧菌，在将酒精变为醋酸时需要氧的参与，因此要适时向发酵液中充气。 （5）发酵装置 ①请分析此装置中的充气口、排气口和出料口分别有哪些作用。为什么排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接？结合果酒、果醋的制作原理，你认为应该如何使用这个发酵装置？ 答：充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出CO2的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是防止空气中微生物的污染。 ②该装置的使用方法 A、使用该装置制作果酒时，应该封闭充气口。B、制作果醋时，应将充气口连接充气泵，适时输入无菌空气。 （6）实验结果分析 (1)若酵母菌数量少，产生的酒精少：原因是发酵前期，酵母菌有氧呼吸不足。 (2)若酵母菌数量充足，但是产生的酒精较少或不能产生酒精：原因是发酵后期密封不严。 (3)若醋酸产生少：很可能是供氧不足所致。 (4)葡萄酒呈现红色的原因是葡萄皮上的色素进入发酵液。 三、腐乳的制作 1、多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一种丝状真菌。代谢类型是异养需氧型。生殖方式是孢子生殖，营腐生生活。 2、原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。 3、实验流程：让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制 4、酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。 前期发酵的主要作用：①创造条件让毛霉生长。②使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。 后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过各种辅料与酶的缓解作用，生成腐乳的香气。 5、所用豆腐的含水量为70％左右，水分过多则腐乳不易成形。 6、毛霉的生长： ①条件:将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的温度控制在15～18℃，并保持一定的湿度。 ②来源：A、来自空气中的毛霉孢子；B、 直接接种优良毛霉菌种； 7、 加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，同时逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。加盐腌制的时间约为8天左右。 8、用盐腌制时，注意控制盐的用量：盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高会影响腐乳的口味； 9、食盐的作用：①抑制微生物的生长，避免腐败变质 ；②析出水分，使豆腐变硬，在后期制作过程中不易酥烂；③给腐乳以必要的咸味；④具有浸提毛霉菌丝上的蛋白酶的作用； 10、配制卤汤：卤汤直接关系到腐乳的色、香、味。卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的。卤汤中酒的含量一般控制在12%左右。 11、酒的作用：抑制微生物生长，调节腐乳风味。 12、酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系，酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。 13、香辛料的作用：①调味作用；②杀菌防腐作用；③参与并促进发酵过程； 14、防止杂菌污染：①用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。②装瓶时，操作要迅速小心。整齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。 注意： （1）利用所学的生物学知识，解释豆腐长白毛是怎么一回事？ 豆腐生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。 （2）为什么要撒许多盐，将长毛的豆腐腌起来？ 盐能防止杂菌污染，避免豆腐腐败。 （3）我们平常吃的豆腐，哪种适合用来做腐乳？ 含水量为70%左右的豆腐适于作腐乳。用含水量高的豆腐制作腐乳，不易成形。 （4）吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的“皮”。这层“皮”是怎样形成的呢？它对人体有害吗？它的作用是什么？ “皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝（匍匐菌丝），对人体无害。它能形成腐乳的“体”，使腐乳成形。 四、泡菜制作 1、 制作泡菜所用微生物是乳酸菌 ，其代谢类型是异养厌氧型。在无氧条件下，将糖分解为乳酸 ，分裂方式是二分裂，反应式为：C6H12O6 2C3H6O3+能量； 2、 含抗生素牛奶不能生产酸奶的原因是抗生素杀死乳酸菌。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌；乳酸杆菌常用于生产酸奶。 3、泡菜坛的选择标准：火候好，无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛； 泡菜坛要选择透气性差的容器,坛盖边缘水槽注满水,并注意补充,以创造无氧环境。 4、材料选择： ①蔬菜应新鲜,若时间过长,蔬菜中的 硝酸盐易被还原成亚硝酸盐；不能反 复冲洗，防止发酵菌种的流失。 ②清水和盐的质量分数为5%-20%的 盐水 ,盐水要煮沸冷却待用。一是除 去水中氧气,二是杀灭水中的细菌； 5、泡菜制作流程 6、发酵条件 (1)选择气密性好的泡菜坛，以保证无氧条件。 (2)注意控制腌制时间、温度和食盐的用量。 ①选择的泡菜坛要密封性好； ②加入蔬菜后要注入煮沸冷却的盐水，使盐水没过全部菜料； ③盖上坛盖后要在坛盖边沿的水槽中注满清水。 6、制作泡菜时,泡菜坛内里的白膜是怎么形成的？（发酵液营养和氧气丰富,产膜酵母大量繁殖形成白膜） 7、亚硝酸盐的测定（比色法） (1)亚硝酸盐及其危害 ①亚硝酸盐的特点：白色粉末，易溶于水，在食品加工中用作食品添加剂。 ②亚硝酸盐的危害：含量低时一般不会危害人体健康，含量高时会引起中毒，甚至死亡。在特定条件下，会转变成致癌物——亚硝胺。 ③泡菜腌制过程的亚硝酸盐含量的变化：先增加，后减少。 （2）亚硝酸盐的测定的原理及操作流程 要点 内容 原理 ①亚硝酸盐+对氨基苯磺酸→反应物  反应物+N-1-萘基乙二胺盐酸盐→玫瑰红色 ②通过显色反应样品与标准液比较,可推测亚硝酸盐浓度 操作流程 配制溶液→制备标准显色液→制备样品处理液→比色 8、泡菜腌制中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化 发酵时期 乳酸菌 乳酸 亚硝酸盐 发酵初期 少(有O2，乳酸菌活动受抑制) 少 增加(硝酸盐还原菌的作用) 发酵中期 最多(乳酸抑制其他菌活动) 积累、增多， pH下降 下降(硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解) 发酵后期 减少(乳酸继续积累，pH继续下降，抑制其活动) 继续增多， pH继续下降 下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制) 变化曲线 按下面例题中的曲线③来理解 注意 亚硝酸盐是硝酸盐还原菌促进硝酸盐还原形成的，而不是硝化细菌氧化氨形成的 例题： (1)图中乳酸菌含量的变化规律为②(填序号)。 (2)图中乳酸含量的变化规律为①(填序号)。 (3)图中亚硝酸盐含量的变化规律为③(填序号)。 (4)由图可知，泡菜的最佳取食时间为发酵中期。 考点二　微生物的基本培养技术 一、微生物 1、微生物的定义：肉眼难以看清，需要借助光学显微镜或电子显微镜才能观察到的一切微小生物的总称。 3、微生物菌落： 分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。由单个微生物繁殖形成的纯培养物就是一个单菌落； 注意： ①菌落特征是微生物鉴定的重要依据 ②一个单菌落就是一个种群。 二、培养基 1、概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。 2、成分:各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐,此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。 营养要素 含义 作用 主要来源 碳源 凡能提供所需碳元素的物质 构成生物体细胞的物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质 无机碳源：NaHCO3、CO2等；有机碳源：糖类、脂肪酸、花生饼粉、石油、牛肉膏和蛋白胨等 氮源 凡能提供所需氮元素的物质 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 无机氮源：NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等 生长因子 (特殊营 养物质) 微生物生长必不可少的微量有机物 酶和核酸的组成成分 酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液等 水 在高等生物体内含量很高，在低等生物体内含量更高 不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定 培养基、大气、代谢产物等 无机盐 为微生物提供除碳、氮元素以外的各种重要元素，包括某些大量元素 细胞内的组成成分；生理调节物质；某些化能自养菌的能源；酶的激活剂 培养基、大气等环境 注意： （1）蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、麦芽汁等天然营养物质中既含有碳源又同时含有氮源、生长因子等营养要素; （2）微生物的代谢类型（根据碳源来确定的，不是氮源） ①根据能否将CO2合成有机物可分为：自养型生物与异养型生物。 ②划分依据：自养微生物与异养微生物类型划分的主要依据是能否以无机碳作为生长的主要或唯一碳源，而与氮源无关。自养微生物以CO2或碳酸盐为主要或唯一碳源进行代谢生长；异养微生物必须以有机物作为碳源进行代谢生长。 （3）几种微生物的营养和能量来源 微生物 碳源 氮源 能源 蓝细菌（蓝藻） CO2 N2 光能 硝化细菌 CO2 NH3 NH3的氧化 根瘤菌 糖类等有机物 N2 有机物 大肠杆菌 糖类等有机物 蛋白质等 有机物 （4）题目中给出培养基的配方后，首先就要和上述四大成分对应起来，判断一下是否缺少某一种成分； 无机碳源不能为微生物提供能量； 含碳有机物是异养型微生物的碳源和能源； 无机氮源NH3既是硝化细菌的氮源，也是其能源；N2是固氮菌（如根瘤菌）的氮源。 3、 培养基的类型和用途 分类 依据 种类 特点 应用 物理 性质 液体培养基 不加凝固剂 工业生产 半固体培养基 加凝固剂（琼脂）少 观察微生物的运动 固体培养基 加凝固剂（琼脂）多 微生物的分离、鉴定，活菌计数、保藏 化学 成分 天然培养基 含化学成分不明的天然物质,通常含血清、血浆、和组织提取液等 工业生产 合成培养基 培养基成分明确或用一定化学物质配制 分类、鉴定 用途 选择培养基 添加某物质，抑制杂菌生长，促进所需微生物生长 培养分离出特定微生物 鉴别培养基 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂 鉴别微生物 注意： (1)加入培养基中的凝固剂(如琼脂)，一般不能被微生物利用，只起到凝固剂作用。 (2)选择培养基上一般只能生长具有特定特点的微生物，鉴别培养基可以存在其他微生物，而且能鉴别特定的微生物。 4、培养基的配制原则： ①目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。 ②营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。 ③pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同，如细菌的适宜pH约为6.5～7.5、放线菌的适宜pH约为7.5～8.5、真菌的适宜pH约为5.0～6.0。为维持pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用的缓冲剂是磷酸氢二钾—磷酸二氢钾。 3、 无菌技术 (1)含义:在培养微生物的操作中,所有防止杂菌污染的方法。 (2)目的：获得纯净微生物关键是防止外来杂菌的入侵。 (3)消毒和灭菌的区别 ①消毒：指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部一部分微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒常用煮沸消毒法、巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）、化学药物消毒、紫外线消毒。 ②灭菌：则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）。 灭菌和消毒种类 主要方法 应用范围 灼烧灭菌 酒精灯火焰灼烧 微生物接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中的试管口或瓶口等 干热灭菌 干热灭菌箱160～170 ℃加热1～2 h 玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品 高压蒸汽灭菌 100 kPa、121 ℃维持15～30 min 培养基及多种器材、物品 煮沸消毒法 100 ℃煮沸5～6 min 家庭餐具等生活用品的消毒 巴氏消毒法 70～75 ℃煮30 min或80 ℃煮15 min 牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体 紫外线消毒 30 W紫外灯照射30 min 接种室、接种箱、超净工作台 化学药物消毒 用体积分数为70%～75%的酒精、碘酒涂抹，来苏水喷洒等 用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等的消毒 注意： (1)用酒精消毒时，体积分数为70%的酒精消毒效果最好，原因是浓度过高，菌体表面蛋白质凝固形成一层保护膜，酒精不能渗入其中；浓度过低，杀菌力减弱。 (2)接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30 min以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。 (3)芽孢是某些细菌生长到一定阶段，在细胞内形成的休眠体。孢子是某些微生物的繁殖体。 (4)消毒和灭菌都是通过一定的理化手段，使病原体的蛋白质或核酸变性，失去活性。只是作用的条件不同，抑菌杀菌的程度不同。 (5)常用物体的灭菌方法： ①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法； ②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱； ③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。 ④操作者双手一般用酒精擦拭，即化学消毒；牛奶用巴氏消毒法。 (6)无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？ 答：还能有效避免操作者自身被微生物感染。 (7)为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 四、微生物的纯培养 1、概念： （1）培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。 （2）纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。 （3）纯培养：获得纯培养物的过程就是纯培养。 2、常用方法: 平板划线法和稀释涂布平板法。 3、平板划线法 （1）定义：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体（菌落）。 （2）平板划线法具体的操作： （3）注意事项 ①第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环。 注意：平板划线操作中几次灼烧接种环的目的；(注意灼烧次数与划线的次数的关系：加1) 第一次操作 第二次及之后每次划线之前 划线结束 目的 杀死接种环上原有的微生物 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少 杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者 ②灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。 ③平板划线法在做第二次以及其后的划线操作时,为什么总是从上一次划线的末端开始划线?目的是什么? 提示　划线后,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次从上一次划线的末端开始,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。这样做的目的是将聚集的菌种逐步稀释分散以便获得单个菌落。 ④划线时最后一区域不要与第一区域相连。 ⑤划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。 ⑥平板划线法只适合用于微生物的提纯，不适合进行计数，并且在最后一次划线的末端处的菌种最纯。 4、稀释涂布平板法 （1）定义：稀释涂布法是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 (2)稀释涂布平板法的步骤 ①系列稀释操作 A、将10 g土样加入盛有90 mL 无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。 B、取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 ②涂布平板操作 操作示意图 操作 取不超过 0.1 mL的菌液，滴加到培养基表面 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中 将沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽后，冷却后，再进行涂布 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液涂布均匀 稀释涂布平板法的注意事项： (1)稀释操作时：每支试管及其中的9 mL无菌水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2 cm 处； (2)涂布平板时： ①涂布器用体积分数为70%酒精消毒，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃； ②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精； ③酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不要接触任何物体； ④每个稀释度都要对就涂至少3个平板； (3)两种接种方法作用不完全相同：平板划线法和稀释涂布平板法都能使细菌纯化，但平板划线法不能计数；稀释涂布平板法能计数。 (4)稀释涂布平板法的缺点：稀释涂布平板法统计样品中菌落的数目往往比实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，在平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。 (5)设立重复组：为了保证结果准确，在统计某一稀释度下平板上的菌落数时，一般设置3～5个平板，要至少涂布3个平板作重复组，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值，以增强实验结果的说服力与准确性。 （6）计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。 4、 微生物的纯培养包括：配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。 5、实例——酵母菌的纯培养 （1）酵母菌纯培养的操作步骤： (1)制备培养基：配制培养基—灭菌—倒平板； (2)接种和分离酵母菌：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到 单菌落 。 (3)培养酵母菌：完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板(一般做三组，重复实验)和一个未接种的平板倒置，放入 28 ℃左右(培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异)的恒温培养箱中培养24-48h 。 （2）倒平板的操作步骤 【倒平板的注意事项】 （1）培养基要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。 （2）要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 （3）倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。 （4）平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 （5）在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微生物。因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。 （6）整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。 注意： （1）配制固体平板培养基的基本步骤是：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板（灭菌前要调节PH）； （2）在倒平板时为何要在酒精灯的火焰旁进行？ 提示：酒精灯的火焰旁是无菌区域，在酒精灯的火焰旁操作，可以避免周围环境中微生物的污染。 （3）接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个接种的培养基放在一起培养，未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键。如果有菌落生长，说明了什么？ 提示：培养未接种培养基的作用是对照，未接种的培养基在恒温箱中保温1d～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的。若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染了，需要重新制备。 （4）微生物的接种方法只有平板划线法和稀释涂布平板法吗？微生物接种的核心是什么？ 不是，微生物的接种技术还包括斜面接种、穿刺接种等方法，其核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。 （5）在未接种的培养基表面是否有菌落生长?如果有,说明了什么? 提示 在未接种的培养基表面应该没有菌落生长,如果有,说明培养基被杂菌污染。 (6)在接种酵母菌的培养基上,你是否观察到了单菌落?这些菌落的颜色、形状和大小是否一致?如果你观察到了不同形态的菌落,你能分析出可能是由哪些原因引起的吗? 提示　在符合接种实验要求的前提下,同种菌落培养基菌落的形状、大小和颜色一致,如果观察到了不同形态的菌落,可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。 五、微生物的选择培养和计数 1、选择培养基 （1）概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。(注意判断方法，2个要点) （2）在设计选择培养基时，需要设立两种对照组 ①判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的培养基同时进行培养——如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。 ②判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论——只有当选择培养基中菌落种类数远少于普通培养基时，方可表明其具“筛选”作用。 （3） 选择培养基上生长的微生物≠目的菌 原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步鉴定。 （4）选择培养基四种常见制备方法或实例 ①加入某些特定的物质（前提是培养基具备全部营养成分） ②改变培养基的营养成分 ③利用培养基“特定化学成分”分离 ④通过某些“特殊环境”分离 2、鉴别培养基：鉴别培养基是一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼鉴别颜色就能方便地从近似菌落中找到目的菌菌落的培养基。 ①用途 : 鉴别不同种类的微生物； ②实例：伊红—美蓝培养基（使大肠杆菌的菌落呈黑色，并带有金属光泽，可以鉴别大肠杆菌；） 选择培养基上一般只能生长具有特定特点的微生物，鉴别培养基可以存在其他微生物，而且能鉴别特定的微生物。（注意两者的区别） 3、菌种的保存 ⑴对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。（于4℃的冰箱中保藏。缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。） ⑵对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。（菌液与甘油充分混匀后放在-20℃的冷冻箱中保存。） 4、微生物的数量测定 （1）间接计数法(活菌计数法)：常用方法：稀释涂布平板法。 ①理论依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。（ 恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键，细菌一般选用104、105和106倍的稀释液。） ②用稀释涂布平板法对微生物进行计数时的注意事项。 a设立重复组：为了保证结果准确，在统计某一稀释度下平板上的菌落数时，一般设置3～5个平板，要至少涂布3个平板作重复组，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值，以增强实验结果的说服力与准确性。 b统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。 c计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。 (2) 显微镜直接计数法 ①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。 ②方法：用细菌计数板和血细胞计数板计算。 ③缺点：不能区分死菌与活菌（比实际值偏大）。 （3）计数：每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 5、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (1)实验原理 在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基的碱性增强，PH升高。因此，我们可以通过检测培养基pH变化来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。 (2)实验流程 注意： ①取土样用的小铁铲和盛土样的信封都要进行灭菌；称取土样要在火焰旁进行，稀释样品要在火焰旁操作。 ②寻找目的菌株的筛选原则：根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。（注意写法：通常描述为：以**为唯一的碳源或氮源，现象：通常描述为：形成以***（相应微生物）为中心的透明圈） 6、纤维素分解菌的分离 （1）纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。 （2）纤维素与纤维素酶 ①棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。 ②纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。 3、纤维素分解菌的筛选 （1）筛选方法：刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。 （2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理 刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 （3）为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？ 在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。 考点三 发酵工程 1、 发酵工程 1、概念：发酵工程就是给微生物一个最适合生长的条件，利用微生物的代谢功能，通过现代化技术手段生产出人类所需要的产品。也有人称之为微生物工程。说简单一点，就是人类有目的的发酵生产过程。 2、特点：①生产条件温和；②原料来源丰富且价格低廉；③产物专一；④废弃物对环境的污染小和容易处理。 二、发酵工程基本环节分析 1、选育菌种 (1)目的：获得性状优良的菌种 (2)菌种来源：从自然界中筛选、诱变育种或基因工程育种。 (3)实例：筛选产酸量高的黑曲霉用来生产柠檬酸；使用基因工程改造的啤酒酵母，加速发酵、缩短生产周期；优良的菌种不仅具有健壮，不易退化，其发酵产品的产量高、质量稳定等优点，它往往还会赋予发酵产品独特的风味，因此菌种选育环节在很大程度上决定了生物发酵产物的成败。 2、扩大培养 (1)目的：获得更多的菌种。 (2)原因：工业发酵罐的体积一般为几十到几百立方米，接入的菌种总体积需要几立方米到几十立方米。所以，在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养。 3、配制培养基 ①在菌种确定之后，要选择原料制备培养基。 ②在生产实践中，培养基的配方要经过反复试验才能确定。 4、灭菌 (1)灭菌原因：发酵工程种所用的菌种大多是单一菌种，一旦有杂菌污染，可能导致产量大大降低。 (2)培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌； 5、接种 将扩大培养后的菌种投放到_发酵罐_中。 6、发酵罐内发酵——(发酵工程的中心环节) (1)要求： ①发酵过程中，要随时检测培养液中微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程； ②要及时添加必需的营养物质，要严格控制温度、pH和溶氧量等发酵条件。 (2)严格控制发酵条件的原因： ①环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且影响微生物代谢物的形成；②严格控制发酵条件，有利于使发酵全过程处于最佳状态。 (3)不同发酵条件的影响实例——谷氨酸发酵 ①在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸；②在酸性条件下则容易生成谷氨酰胺和N-乙酰谷胺酰胺。 (4)现代发酵工程使用的发酵罐的优点： 均有计算机控制系统，能对发酵过程中的温度、pH、溶氧量、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和控制，还可以进行反馈控制，使发酵全过程处于最佳状态； 7、分离、提纯产物 ①发酵产品是微生物细胞本身时，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥； ②发酵产品是代谢物时，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。 8、 获得产品：单细胞蛋白、味精等。 三、发酵工程的应用 领域 主要方面 举例 在食品工业上的应用 生产传统的发酵产品 以大豆为主要原料，利用产生蛋白酶的霉菌(如黑曲霉)，将原料中的蛋白质水解成小分子的肽和氨基酸，然后经淋洗、调制成的酱油产品；以谷物或水果等为原料，利用酿酒酵母发酵生产的各种酒类 生产各种各样的食品添加剂 味精、酸度调剂剂、增味剂、着色剂、增稠剂、防腐剂 生产酶制剂 α—淀粉酶、β—淀粉酶、果胶酶、氨基肽酶、脂肪酶 在医药工业上的应用 基因工程、蛋白质工程 生长激素释放抑制激素、紫杉醇、青蒿素、乙型肝炎疫苗 在农牧业上的应用 生产微生物肥料 根瘤菌肥、固氮菌肥 生产微生物农药 苏云金杆菌、白僵菌、井冈霉素 生产微生物饲料 单细胞蛋白 在其他方面的应用 发酵原料的改变推动着发酵工业迅速发展 利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能源物质 极端微生物已应用于生产实践 嗜热菌、嗜盐菌用来生产洗涤剂、嗜低温菌提高热敏性产品质量 注意： ①传统发酵技术得到的产品一般不进行分离、提纯，而发酵工程得到的产品须根据发酵产品类型进行分离、提纯。 ②发酵生产排出的气体和废弃物不能直接排放到外界环境中，以避免对环境造成污染。 ③扩大培养与发酵生产过程中的培养不同： 扩大培养是为了让菌体在短时期内快速增殖，而发酵过程中的培养是为了获得代谢产物，目的不同采用的培养条件就有可能不同。 例如：在酒精发酵过程中，扩大培养是为了促使酵母菌快速增殖，因此是在有氧条件下进行。而在发酵产生酒精的过程中则必须在无氧条件下进行以获得大量的酒精。 ④影响发酵过程的因素： A、温度：金色链霉菌在30 ℃以下时，合成金霉素能力强，在35 ℃以上时，则只合成四环素。 B、PH：①在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸；②在酸性条件下则容易生成谷氨酰胺和N-乙酰谷胺酰胺。 C、溶氧量：当溶氧不足时，谷氨酸棒状杆菌生成的代谢产物是乳酸或琥珀酸，而不是谷氨酸； D、营养物质的浓度（C/N）：C/N＝3时，谷氨酸棒状杆菌大量合成谷氨酸；但当C/N＝4时，谷氨酸棒状杆菌大量繁殖而产生谷氨酸少； ⑤啤酒的工业化生产流程有8步，分为两个阶段 例题： 1、如图是发酵工程生产产品的流程简图，请据图分析回答下列问题： (1)从自然界中直接获得的菌种，产量一般都比较低，不能满足人们对各种发酵产品的需求。现在，生物学家一般通过①__________、②________和基因工程三种方法获得符合人们要求的生产用菌种。 (2)在啤酒生产过程中，向接种酵母菌的麦芽汁充氧，目的是____________________________________。而产物酒精是酵母菌在________过程中产生的代谢产物。 (3)利用谷氨酸棒状杆菌生产味精的过程中，发酵罐中的培养基通常用豆饼的水解液、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、氧化钾、硫酸镁、生物素等配制而成的培养液，并且发酵过程中要不断地通入无菌空气，说明谷氨酸棒状杆菌的新陈代谢类型是______________。谷氨酸棒状杆菌代谢产物谷氨酸合成过量时，会抑制谷氨酸脱氢酶的活性，就会影响谷氨酸的进一步生产，为了使谷氨酸能迅速地排放到细胞外，常用的方法是______________。 (4)发酵工程用于食品工业，除产生传统的发酵产品外，还为解决粮食短缺开辟了新的途径，如可通过发酵获得________。 (5)在发酵过程中，培养液中pH发生变化的主要原因是_______________________________________，调节和控制培养液中pH的方法是加入________，或在发酵过程加________。 答案　(1)从自然界筛选　诱变育种(或人工诱变)；　(2)使酵母菌进行有氧呼吸，迅速繁殖　无氧呼吸；　(3)异养需氧型　改变细胞膜的通透性；(4)单细胞蛋白；(5)培养基中营养成分的利用和代谢产物的积累　缓冲剂　酸或碱 16 学科网（北京）股份有限公司 $$