2027届高三生物人教版一轮复习课件：第32讲发酵工程

2026年高考生物 复习 第1讲 发酵工程 专题一 生物技术与工程 二轮 考情透视·目标导航 核心考点 考试频次 考题统计 传统发酵技术的应用 3年10次 （2025 浙江卷）果酒果醋的制作 （2024 江苏卷）泡菜的腌制 （2024 浙江卷）果酒果醋的制作 （2024 湖北卷）果酒果醋的制作 微生物的培养技术及应用 3年22次 （2024 海南卷）培养基成分 （2024 江苏卷）微生物计数 （2024 重庆卷）微生物分离与计数 （2024 山东卷）微生物培养 发酵工程及应用 3年17次 （2024 天津卷）微生物培养综合 （2024 福建卷）发酵工程应用 （2024 江西卷）发酵工程应用 （2024 北京卷）发酵工程应用 （2024 湖南卷）微生物培养技术综合 2 发酵工程 微生物培养 平板划线法 碳源、氮源、水、无机盐 培养基成分 无菌技术 接种方法 目的：防止杂菌污染 类型 稀释涂布平板法 发酵工程基本环节 中心环节：发酵罐内发酵 传统发酵技术 毛霉(主) 腐乳 果酒 果醋 泡菜 酵母菌 醋酸菌 乳酸菌 消毒 灭菌 尿素做唯一氮源 可计数 知识导图·思维引航 3 生物技术与人们的生活息息相关，在食品制造、衣物洗涤等方面应用广泛。 回答下列问题： (1)人们用葡萄酿制葡萄酒利用的微生物主要是__________。葡萄酒制作前一般将发酵瓶清洗干净，用酒精进行_________(填“灭菌”或“消毒”)。发酵时要将温度控制在_______℃。 (2)腌制泡菜过程中,用水封坛的作用是____________.制作泡菜宜选用新鲜的蔬菜,原因是________________________.发酵后期,乳酸含量继续增加,当超过1.2%时,发酵速度逐渐变缓甚至停止,主要原因是_________________________。 情境一： 【任务1】 酵母菌 消毒 18-30 提供无氧环境 新鲜蔬菜亚硝酸盐的含量低 pH过低抑制了乳酸菌的生长 总结泡菜、果酒、果醋制作的原理、发酵条件及菌种类型 生产应用 腐乳 酿酒、发面 酿醋 制作酸奶、泡菜 菌种 毛霉、酵母、曲霉 酵母菌 醋酸菌 乳酸菌 分类 真核生物 真核生物 原核生物 原核生物 代谢类型 异养需氧型 异养兼性厌氧型 异养需氧型 异养厌氧型 发酵条件 需氧 前期需氧，后期无氧 需氧 无氧 适宜温度 室温 18～30 ℃ 30～35 ℃ 室温 主要原理 （反应式） ①豆腐中的蛋白质被分解为小分子的肽和氨基酸，味美易消化吸收 ②酒精发酵：氧气充足时，有氧呼吸大量繁殖；不足时，无氧呼吸产生酒精 C6H12O6＋6H2O＋6O2→6CO2＋12H2O＋ 能量; C6H12O6→2C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量 ③醋酸发酵：当O2、糖源充足时; 当O2充足、糖源不足时： C6H12O6＋2O2――→2CH3COOH(乙酸)＋2H2O＋2CO2＋能量 C2H5OH＋O2――→CH3COOH(乙酸)＋H2O＋能量 ④乳酸发酵：C6H12O6 ――→ 2C3H6O3(乳酸)＋能量 酶 酶 酶 酶 酶 5 【典例1】家庭制作馒头时可以利用前一次发酵保存下来的“面团”，制作泡菜时可以向泡菜坛中加入一些“陈泡菜水”，而工业上大规模生产馒头或泡菜时往往需要添加单一菌种。下列叙述错误的是（    ） A．家庭制作馒头时采用老面发酵，属于传统发酵技术 B．添加“面团”和“陈泡菜水”可分别为发酵提供酵母菌和乳酸菌等菌种 C．馒头和泡菜的制作都需要创造无氧环境 D．泡菜腌制时食盐用量过高易造成泡菜咸而不酸 C 泡菜的制作需要创造无氧环境，有利于乳酸菌繁殖和发酵， 馒头的制作中需要先创造有氧环境 注：1.传统发酵的菌种来源？主要菌种、发酵状态？ 直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的发酵物中的微生物； 以混合菌种的固体发酵（泡菜、粮食白酒、腐乳等）及半固体发酵（豆豉、酱、酱油等）为主。 二、尝试制作传统发酵食品 P6 寄居蟹 制作传统发酵食品--泡菜 探究·实践 步骤 称取食盐 清洗蔬菜 配置盐水 清洗、修整、切条、晾干 泡菜盐水 香辛料 发酵 成品 盐的作用 盐浓度过低 盐浓度过高 煮沸目的 冷却的目的 调味，抑制微生物生长 杂菌大量繁殖,使蔬菜变质腐败 口味不佳 防止影响乳酸菌的生命活动 Tips3 向坛盖边沿的水槽中注满水，发酵过程中经常补充！ Tips2 装坛后可以加一些原来已经腌制好的陈泡菜汁更好： 相当于接种发酵微生物，可缩短腌制时间。 Tips1 5%-20% 杀灭微生物；去除水中的溶解氧 7 三、尝试制作传统发酵食品 P6 寄居蟹 制作传统发酵食品--泡菜 探究·实践 步骤 称取食盐 清洗蔬菜 配置盐水 清洗、修整、切条、晾干 泡菜盐水 香辛料 发酵 成品 ①在泡菜发酵初期，酵母菌等较为活跃，发酵产物中有较多的CO2，防止发酵液溢出坛外；②防止因装太满使盐水未完全淹没菜料而导致菜料变质腐烂；③同时留有一定空间，也更方便拿取泡菜。 讨论1：为什么泡菜坛只能装八分满？ 讨论2：泡菜盐而不酸的原因？ 盐加多了，抑制了乳酸发酵，乳酸产生量减少 8 三、尝试制作传统发酵食品 P6 制作传统发酵食品--泡菜 探究·实践 步骤 称取食盐 清洗蔬菜 配置盐水 清洗、修整、切条、晾干 泡菜盐水 香辛料 发酵 成品 白膜 讨论4：为什么泡菜坛内有时会长一层白膜，这层白膜是怎么形成的？ 形成白膜是由于产膜酵母的繁殖。酵母菌是兼性厌氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌的繁殖。 水封闭坛口起着使坛内与坛外空气隔绝的作用，这是最简易的造成无氧环境的方法。说明乳酸菌进行乳酸发酵需无氧环境。 讨论3：用水封闭泡菜坛的目的是什么？这说明泡菜制作需什么条件？ 9 2．泡菜腌制过程中，乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化 发酵时期 乳酸菌 乳酸 亚硝酸盐 发酵初期 发酵中期 发酵后期 变化曲线 少(有O2，乳酸菌 活动受抑制) 最多(乳酸抑制 其它菌活动) 减少(乳酸继续积累,pH继续下降,抑制自身活动) 少 增多、 pH下降 继续增多， pH继续下降, 直至稳定 达到最多后开始下降(硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解) 下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制) 增加(硝酸盐还原菌的作用) 应该在11天后食用比较合适； 因为这时亚硝酸盐含量已经降到较低的水平； ★腌制时间过短，温度太高，食盐用量过少，在泡菜制作中，可能导致亚硝酸盐含量增加。 三、尝试制作传统发酵食品 P7 寄居蟹 制作传统发酵食品--果酒和果醋 探究·实践 步骤 果酒 果醋 清洗后去梗 葡萄榨汁 装瓶 果酒发酵 果醋发酵 开盖+纱布 18~30℃发酵10~12d 葡萄汁装入发酵瓶(留1/3空间) 30~35℃发酵7~8d 每12h瓶盖拧松一次再拧紧，从瓶口取样检测发酵情况 讨论1.用清水冲洗的主要目的是什么？冲洗次数不宜太多，为什么？ 清水缓冲，次数不宜太多 避免冲洗掉附着在葡萄皮上的野生酵母菌 目的是洗去杂质 葡萄 讨论2.为什么先冲洗葡萄再除去枝梗？ 避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会 11 三、尝试制作传统发酵食品 P7 寄居蟹 制作传统发酵食品--果酒和果醋 探究·实践 步骤 果酒 果醋 清洗后去梗 葡萄榨汁 装瓶 果酒发酵 果醋发酵 开盖+纱布 18~30℃发酵10~12d 葡萄汁装入发酵瓶(留1/3空间) 30~35℃发酵7~8d 每12h瓶盖拧松一次再拧紧，从瓶口取样检测发酵情况 讨论3.葡萄汁装入发酵瓶时，为何要留有1/3的空间？ 清水缓冲，次数不宜太多 a.先让酵母菌进行有氧呼吸，快速繁殖，耗尽O2后，再进行酒精发酵； b.防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出。 葡萄 12 三、尝试制作传统发酵食品 P7 寄居蟹 制作传统发酵食品--果酒和果醋 探究·实践 讨论4.在制作果酒和果醋的过程中，发酵液分别有哪些变化？原因是什么？ 发酵 酒精发酵 醋酸发酵 气味和味道 气泡和泡沫 发酵液颜色 讨论5.在制作果酒的过程中，除了酵母菌，是否还有其他微生物生长？它们会对果酒发酵产生影响吗？如果有，如何避免这种影响？ 还有乳酸菌、醋酸菌等 乳酸菌可能分解果酒中的有机物，使其变质。可通过调节发酵的温度、果酒的pH等来控制乳酸菌的含量。而且醋酸菌在有氧的条件下会将乙醇转化为醋酸，从而影响果酒发酵，在果酒制作的过程中尽量减少O2含量，从而抑制醋酸菌的繁殖。也可以通过调节发酵的温度、果酒的pH等同样可以控制醋酸菌的含量。 酒味 有气泡和泡沫 混浊 酸味（嗅味和品尝） 无气泡和泡沫 混浊，液面形成白色菌膜 13 三、尝试制作传统发酵食品 P7 寄居蟹 制作传统发酵食品--果酒和果醋 探究·实践 讨论6.在果酒发酵阶段为什么每隔12h拧松瓶盖一次？拧松瓶盖后再将瓶盖拧紧，原因是什么？ 在果酒发酵过程中产生CO2 ， 防止瓶内气压过高引起爆裂。 防止进入O2，影响酒精发酵 讨论7.在制作果醋过程中，酵母菌是否会继续发酵？醋酸菌从何而来？采用什么措施可以加快果醋的制作？ 随着醋酸发酵的进行，发酵液的pH、发酵温度等均不利于酵母菌的生长繁殖，因此酵母菌活性很低。当打开瓶盖后，空气中的醋酸菌会进入发酵液中大量繁殖，其他的菌因不适应环境条件而不能繁殖。 在工业上，后期醋的发酵需要人工接种醋酸菌。我们制作果酷时,可以先买一瓶醋，将其打开暴露于空气中，一段时间后在醋的表面会有一层薄膜(实际上是醋酸菌)，用这层薄膜进行接种可以明显缩短制作果醋的时间。 14 三、尝试制作传统发酵食品 寄居蟹 小积累 果酒和果醋改进装置及其分析 充气口 出料口 在乙酸发酵时连接充气泵进行充气 用来取样 排出酒精发酵时产生的CO2；与排气管相连的长而弯曲的胶管，可有效地阻止空气中的微生物的进入，避免感染 排气口 装置使用： ①酒精发酵时，充气口关闭；排气口排除二氧化碳。 ②乙酸发酵时，充气口连接气泵，输入氧气。 15 √ 1．制醋、制饴、制酒是我国传统发酵技术。醋酸菌属于好氧型原核生物，常用于食用醋的发酵。下列叙述错误的是(　　) A．食用醋的酸味主要来源于乙酸 B．醋酸菌不适宜在无氧条件下生存 C．醋酸菌含有催化乙醇氧化成乙酸的酶 D．葡萄糖在醋酸菌中的氧化分解发生在线粒体内 真题研析 【最新考情】 醋酸菌是原核生物，其细胞内无线粒体 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 √ 2．中国传统白酒多以泥窖为发酵基础，素有“千年老窖万年糟”“以窖养糟，以糟养泥”之说。多年反复利用的老窖池内壁窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物。下列叙述错误的是(　　) A．传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的 B．窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，使酿造过程不易污染杂菌 C．从窖泥中分离的酿酒酵母扩大培养时，需在CO2或N2环境中进行 D．从谷物原料发酵形成的酒糟中，可分离出产淀粉酶的微生物 真题研析 【最新考情】 酵母菌是兼性厌氧菌，与无氧呼吸相比，细胞有氧呼吸产生的能量更多，更能满足酵母菌大量繁殖时的需求，因此，对分离的酿酒酵母扩大培养时需要在有氧的环境条件下进行 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (3)将土壤悬浮液接种在培养基[氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)]上，筛选土壤中能高效降解X的细菌(仅含有C、H两种元素)。培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会________，其原因是_______________________________________________________________。 (4)培养过程中抽样检测活菌数量时，应采用_______________(填“稀释涂布平板法”或“显微镜直接计数法”)，其原因:是___________________________________________________________________ __________________________________________。 下降 不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖 稀释涂布平板法 用稀释涂布平板法在培养基上看到的每一个菌落都来自一个活细胞，而显微镜直接计数法不能直接区分死菌和活菌 情境二： (3)将土壤悬浮液接种在培养基[氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)]上，筛选土壤中能高效降解X的细菌(仅含有C、H两种元素)。培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会________，其原因是_______________________________________________________________。 (4)培养过程中抽样检测活菌数量时，应采用_______________(填“稀释涂布平板法”或“显微镜直接计数法”)，其原因:是___________________________________________________________________ __________________________________________。 下降 不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖 稀释涂布平板法 用稀释涂布平板法在培养基上看到的每一个菌落都来自一个活细胞，而显微镜直接计数法不能直接区分死菌和活菌 情境二： 【任务1】 总结微生物培养中的无菌操作技术的方法及作用对象 【任务2】 比较平板划线法、稀释涂布平板法的主要步骤、原理及优缺点 实验室培养微生物关注内容: (1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件 (2）确保其它微生物无法混入 微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。 (3)并将需要的微生物分离出来 培养基 无菌技术 纯化培养 相关性信息 1.1发酵工程 一.传统发酵技术的应用 二.微生物的基本培养 1.培养基的配制 1.定义： 2.作用： 3.类型： 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。 用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。 按物理性质分：固体培养基、半固体、液体培养基。 有无 凝固剂琼脂 微生物的分离、鉴定、活菌计数 扩大培养、工业生产 注：1.琼脂不能作碳源，也不提供能量。2.固体培养基中才能长出菌落。 按功能性质分：选择培养基、鉴别培养基。 如含抗生素的培养基 如不加氮源的培养基 伊红-亚甲蓝（大肠杆菌） 酚红（分解尿素菌）脲酶 刚果红（分解纤维素菌） 加高浓度NaCl的培养基 1.1发酵工程 一.传统发酵技术的应用 二.微生物的基本培养 1.培养基的配制 4.培养基的营养成分： 一般都含有营养成分： 特殊条件： pH、O2和特殊营养物质 碳源 氮源 无机盐 水 参与细胞物质的合成 调节PH 维持渗透压 参与细胞的构成 良好的溶剂；运输作用 参与一些化学反应 无机碳源 CO2（自养型）、CO32-、HCO3- 有机碳源 糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油等 无机氮源 NH4＋、NO3-、N2（固氮型） 有机氮源 牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等 碳源、氮源、水、无机盐 培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素； 培养霉菌时，需要将培养基调制酸性； 培养细菌时，需要将培养基调制中性或弱碱性； 培养厌氧微生物时，需要提供无氧条件 类型 适用范围 操作方法 消 毒 灭 菌 较为温和理化方法，杀死物体表面或内部，部分微生物(不包括芽孢、孢子) 强烈的理化方法,杀死物体表面或内部，所有微生物(包括芽孢、孢子) 煮沸消毒法 日常生活用品 100 ℃煮沸5～6 min 巴氏消毒法 不耐高温的液体 62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min 化学药剂 生物活体、水源等 擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源 紫外线 紫外线照射30 min 灼烧灭菌 接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧 干热灭菌 耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等 物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h 湿热灭菌 培养基、培养皿等,生产和实验室常用 高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15～30 min 接种室、接种箱，超净工作台 获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。 思考：用于生物消毒的微生物具有什么特点？ 用于生物消毒的微生物能产生杀死其他微生物的代谢产物或是寄生性的微生物。 巴氏消毒既可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，又可以不破坏牛奶的营养成分。 思考：想想牛奶做无菌处理时，为什么更多的用巴氏消毒法，而不用煮沸消毒法？（与煮沸消毒相比较巴氏消毒的优点是什么？） 思考：化学消毒法有哪些具体应用？ 用70%酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。 接种室、接种箱或超净工作台在使用前可用紫外线照射30min。 在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。 常用的灭菌方法 湿热灭菌 干热灭菌 灼烧灭菌 100Kpa，121℃，15-30 min 工具：高压蒸汽灭菌锅 主要用于对培养基（含有水分）灭菌 主要用于对耐高温和需要干燥的物品，如玻璃皿、吸管、金属用具等 160-170℃，维持2-3h 工具：干热灭菌箱 接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等 1.1发酵工程 一.传统发酵技术的应用 二.微生物的基本培养 1.培养基的配制 2.无菌技术 【典例1】获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础。下列关于微生物培养技术叙述正确的是（　　） A．在接种前对培养基进行湿热灭菌或干热灭菌，可以有效杀死其中的杂菌 B．使用平板划线法或稀释涂布平板法接种，可以将微生物分散并形成单个菌落 C．血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定 D．分离细菌和真菌时，选择性地添加抗生素到培养基中，可确保获得特定种类的细菌 B 培养基不可以采用干热灭菌法 血细胞计数板适用于相对较大的酵母菌的计数，较小的细菌的数量测定常用细菌计数板 抗生素的选择性作用通常针对细菌而非真菌 1.1发酵工程 一.传统发酵技术的应用 二.微生物的基本培养 1.培养基的配制 2.无菌技术 3.微生物的纯培养 培养物 纯培养物 纯培养 在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体。 由单一个体繁殖所获得的微生物群体。 微生物群 分散 单个细胞 单个菌落 繁殖 获得纯培养物的过程就是纯培养。 接种和分离 纯培养的步骤： 配制培养基 倒平板 培养 灭菌 制备培养基 制备方法 (1)制备马铃薯琼脂培养基 操作步骤 倒平板的方法 制备培养基→灭菌→倒平板 一般50℃左右 操作流程 过程解读 丁倒置的原因： 酵母菌的纯培养 灼烧灭菌 丁在培养基冷却凝固后才能进行 防止冷凝水滴落在培养基上造成污染；防止培养基中的水分蒸发 ★先调PH——（再分装）——后灭菌 ①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红 ⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞 ⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。 ②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞 ③试管口通过火焰 （灼烧灭菌） ④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液 ⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。 平板划线法原理是什么？接种时注意事项有哪些？ 单个细胞 微生物群 单个菌落 连续划线 稀释分散 生长繁殖 1.1发酵工程 一.传统发酵技术的应用 二.微生物的基本培养 1.培养基的配制 2.无菌技术 3.微生物的纯培养 (2)接种和分离 酵母菌的纯培养 平板划线法 第1区划线 接种环灭菌 第2区划线 接种环灭菌 第3区划线 接种环灭菌 取 菌液 接种环灭菌 1 2 3 4 5 ①接种环只蘸一次菌液,在培养基不同位置连续划线多次 ②划线首尾不能相接 ③每次划线前接种环进行灼烧灭菌，待冷却后再开始划线 ④划线后,培养皿倒置培养 A B C D E 思考： 1.每次划线前接种环进行灼烧灭菌，为什么要待冷却后再开始划线？说出2图中划线先后 2.若培养基上每个划线区域没有出现菌落分析可能的原因？若培养基上第一划线区域有菌落，其他区域没有，分析可能的原因？ 【注意事项】 以免接种环温度太高，杀死菌种。 (2)接种和分离 D→C→B→A→E 接种环没冷却就接种； 接种环灭菌后没冷却就划线；划线时没能与上次区域首尾相接 （3）培养酵母菌： 完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28 ℃左右的恒温培养箱中培养24～48 h。 未接种的平板 思考:未接种的培养基的作用是什么？表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？ 作对照，该培养皿无菌落说明培养基灭菌合格，且没有污染. 有菌，则培养基灭菌不合格，得重做实验 注：1.接种后需在培养基底部盖上标明时间等相关信息 2.实验全部结束还应该对培养基等作灭菌处理才能丢弃 1.1发酵工程 一.传统发酵技术的应用 二.微生物的基本培养 1.培养基的配制 2.无菌技术 3.微生物的纯培养 1.1发酵工程 一.传统发酵技术的应用 二.微生物的基本培养 1.培养基的配制 2.无菌技术 3.微生物的纯培养 三.微生物选择培养.计数 选择培养基 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。 思考：如何设置对照，说明培养基具有选择作用？ 应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落种类数和数量多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 (1)土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 土壤取样 样品的稀释与涂布 微生物的培养 微生物的计数 微生物的鉴定 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素为唯一氮源的选择培养基，可从土壤中分离出分解尿素的细菌 灭菌 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 接种工具 单菌落的获得 用途 接种效 果图 相同点 通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落 接种环 涂布器 从后边划线的区域挑取 稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落 分离纯化菌种，获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数 ①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的 样品的稀释 将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 思考：1.取菌液时，如何使菌体均匀液时分布？ 2.稀释倍数不够时，会出现什么现象？ 3.菌液稀释倍数选则由什么决定？ 10g 移液管吹吸3次，或摇匀 菌落堆叠 土壤中菌体数量，越多稀释倍数越高 1.1发酵工程 一.传统发酵技术的应用 二.微生物的基本培养 1.培养基的配制 2.无菌技术 3.微生物的纯培养 三.微生物选择培养.计数 涂布： 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 微量移液器 思考：1. 滴加菌液过多时，可能会产生什么现象？ 2.若涂布不均匀又会产生什么现象呢？ 1.1发酵工程 一.传统发酵技术的应用 二.微生物的基本培养 1.培养基的配制 2.无菌技术 3.微生物的纯培养 三.微生物选择培养.计数 菌落堆叠 菌落分布不均 微生物的培养 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置（同时放一个未接种的培养基），放入30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d， 每隔24小时统计一次菌落数目。 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 思考：1.如何区别不同种的菌体？ 2.菌落特征有哪些？ 3.选择菌落数为多少的进行计数？ 4.为什么要每隔24小时统计一次菌落 数目？ 5.计数方法及其原理，误差分析，计算公式？ 1.1发酵工程 一.传统发酵技术的应用 二.微生物的基本培养 1.培养基的配制 2.无菌技术 3.微生物的纯培养 三.微生物选择培养.计数 不同菌落表现出稳定的菌落特征 形状、大小、颜色等 30-300 菌落数目稳定，可以防止因培养时间不足遗漏菌落数目 稀释涂布平板法计数 当稀释倍数足够大时，固体培养基表面的一个菌落来自先前的一个活菌，故通过计菌落数，可以估测出之前的菌体个数。当两个或多个细胞连在一起时，只形成一个菌落。小于。 每克样品的细菌数= （C÷V）×M C:平均菌落数， V:稀释液体积， M:稀释倍数 根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的菌落数目就能大约推测出样品中的活菌数。一同学在稀释倍数为1×104的培养基中测得平板上菌落数的平均值为51.2，则每升样品中的活菌数是________(所用稀释液的体积为0.1 mL) 情况1： 计数时，相关平板上的菌落数为：A 接种：212；B接种：240； C接种：220；D未接种：5，则每升样品中的活菌数是_____ 情况2： 计数时，相关平板上的菌落数为：A 接种：29；B接种：240； C接种：220；D未接种：0， ，则每升样品中的活菌数是_____ 【典例2】酵母菌的品质影响葡萄酒的产量和质量，研究人员为分离出产酒精能力强的酵母菌菌株，进行了如图I所示实验，甲、乙、丙、丁锥形瓶内分别加入100mL完全培养基，下列说法错误的是（    ） A．发酵过程中的缺氧环境、酵母菌产生的酒精等可抑制杂菌的繁殖 B．用稀释涂布平板法计算出葡萄酒过滤液的活菌数可能低于实际的活菌数 C．对培养基进行灭菌的方法是高压蒸汽灭菌法，菌种接种过程中的试管口、瓶口等需灼烧灭菌 D．由图Ⅱ可知，乙、丙、丁培养基浑浊的原因是培养基灭菌不彻底，丁组酵母菌产酒精能力比乙强 D 甲接种无菌水，瓶中无菌，说明培养基灭菌彻底，无菌操作正常，丁组的活菌数比乙组少，但是产生的酒精和乙组一样多，所以丁组产生酒精能力比乙强 38 练习1 热泉中含有能够分解淀粉的耐热古细菌，在固体培养基中，该类细菌分解淀粉会形成透明圈。如图表示筛选能高效产生淀粉酶的耐热古细菌的过程，下列分析正确的是（    ） A．②过程是利用稀释涂布平板法分离并筛选耐热古细菌 B．配制Ⅰ号培养基时需要加入琼脂，先灭菌再调节pH C．为防止污染需要对Ⅰ、Ⅱ号培养基及培养皿进行干热灭菌 D．从Ⅰ号培养基中选择透明圈最小的菌落接种到Ⅱ号培养基 A 对Ⅰ、Ⅱ培养基进行高压蒸汽灭菌，对培养皿进行干热灭菌 透明圈越大说明分解淀粉的能力越强。 练习2 生物培养过程中，由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。平板划线法和稀释涂布平板法是常用的获取纯培养物的方法。下列相关叙述错误的是（    ） A．两种纯化方法的核心都是要防止杂菌污染，保证培养物的纯度 B．用稀释涂布平板法进行微生物计数时，所得数据往往比实际值偏小 C．获取纯培养物的过程中，应根据微生物的种类调整培养基的pH D．对10mL土样样液稀释106倍后，取0.1mL稀释液涂布，测得的菌落数分别为218、266、260，则该10mL土样样液中目的菌数为2.48×1010个 D 纯培养的培养基没有选择性,该10mL土样样液中目的菌数应小于（218+266+260）÷3÷0.1×106×10=2.48×1010个 1.原理 在固体培养基中掺入可被特定菌利用的营养成分M，造成 浑浊、不透明的培养基背景。同时加入能与M形成有色复合物 的染色剂，待筛选菌的菌落周围会形成透明圈。 2.实验 纤维素能与刚果红形成红色复合物，但其水解产物纤维二糖和葡萄糖不能与刚果红形成红色复合物。在以纤维素为唯一碳源的培养基中加入刚果红，接种土壤微生物培养，菌落周围出现透明圈，说明这些细菌能分解纤维素。 3.关键指标分析 拓展应用·情境推理 情境1：透明圈 情境：透明圈、变色圈、抑菌圈、生长圈 聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是一种聚酯塑料，会造成环境污染。磷脂酶可催化PET降解。为获得高产磷脂酶的微生物，研究人员试验了2种方法。回答下列问题： (1)方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇胺(一种磷脂类物质)为唯一碳源制备________培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有________、________、________等营养物质。 (2)方法2采用_______________________________技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，该技术还需要________、________、________等“分子工具”。 (3)除了上述2种方法之外，还可以通过________技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物。 (4)将以上获得的微生物接种到鉴别培养基(在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂)平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是 ____________________________________________________________________。 拓展应用·情境推理 典例赏析 选择 氮源　 水 　无机盐　 转基因(或重组DNA或基因工程)　 限制酶　DNA连接酶　 载体 诱变育种 培养基的卵黄磷脂的含量、pH和灭菌是否彻底等都会影响水解圈的大小 情境2：变色圈 拓展应用·情境推理 1.原理 将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培 养时，目的菌株代谢物使指示剂变色，在菌落周围形成变色圈。 2.实例 (1)分离尿素分解菌 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。接种土壤微生物(产生脲酶)培养，菌落周围出现红色，说明该细菌能够分解尿素。 (2)分离谷氨酸产生菌 在分离谷氨酸产生菌时，可在培养基中加入溴百里酚蓝，它是一种酸碱指示剂，当pH在6.2以下时为黄色，pH7.6以上为蓝色。若平板上出现产酸菌，其菌落周围会变成黄色，可以从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌。 情境：透明圈、变色圈、抑菌圈、生长圈 拓展应用·情境推理 典例赏析 解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成脂肪酸和甘油并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色。下列说法错误的是(　　) A.甲菌属于解脂菌 B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源 C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比 D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力 B 乙周围不变色，说明乙不能分泌脂肪酶分解脂肪，没有脂肪酸的产生，不能利用脂肪，但由于乙能在该培养基上生存，说明该培养基中除了脂肪作为碳源外，还可能存在别的碳源 情境3：抑菌圈 拓展应用·情境推理 1.原理 待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质， 或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对工具菌有毒的物质， 从而在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。该法常用于 抗生素产生菌的筛选，工具菌常是抗生素敏感菌。 2.关键指标分析 情境：透明圈、变色圈、抑菌圈、生长圈 番茄灰霉病菌严重影响番茄生产，枯草芽孢杆菌可以产生对多种病原菌具有抑制作用的蛋白质。为探究枯草芽孢杆菌能否用于番茄灰霉病的生物防治，研究者设计了相关实验。回答下列问题： (1)检测枯草芽孢杆菌对番茄灰霉病菌的抑制作用时，取适量______________菌液涂布于固体培养基上，将无菌滤纸片(直径5 mm)在______________菌液中浸泡后覆盖于固体培养基中心，数秒后取出滤纸片，培养皿倒置培养后测量________________大小以判定抑菌效果。 (2)枯草芽孢杆菌为好氧微生物，液体培养时应采用____________(填“静置”或“摇床震荡”)培养。培养过程中抽样检测活菌数量时，应采用____________________(填“稀释涂布平板法”或“显微镜直接计数法”)，其原因是______________________。 拓展应用·情境推理 典例赏析 番茄灰霉病菌 枯草芽孢杆菌　 抑菌圈 摇床震荡　 稀释涂布平板法　 用稀释涂布平板法在培养基上看到的每一个菌落都来自一个活细胞，而显微镜直接计数法会将死亡的枯草芽孢杆菌也计算在内 情境4：生长圈 拓展应用·情境推理 1.原理 利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，若待分离 的菌在缺乏上述营养物的条件下，能合成该营养物，或能 分泌酶将该营养物的前体转化成营养物，那么，在这些菌 的周围就会有工具菌生长，形成环绕菌落生长的生长圈。 该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌，工具 菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。 2.关键指标分析 当某单一营养缺陷型菌株所需的营养大类确定后，就要确定其生长所需的特殊营养物质。首先对特殊营养物质进行编组，如表是对15种特殊营养物质进行的编组，编组完成后，将沾有组合特殊营养物质的滤纸片放在涂有试验菌甲、乙、丙的培养基上，培养并观察其生长情况，三种试验菌的生长谱如图所示。据图分析，下列叙述错误的是(　　) A.实验中所用的培养基应为不含特殊营养物质的基本培养基 B.试验菌甲、乙自身分别不能合成特殊营养物质13、2 C.若单缺的特殊营养物质为10、11中的一种，则在培养基上均会出现两个生长圈 D.试验菌丙的生长谱结果可能是由于所加营养物质浓度过高，产生了抑菌圈 组别 组合特殊营养物质 A 1 2 3 4 5 B 2 6 7 8 9 C 3 7 10 11 12 D 4 8 11 13 14 E 5 9 12 14 15 拓展应用·情境推理 典例赏析 C 与其他组相比，组A含有特殊营养物质1，据此推测试验菌丙不能合成特殊营养物质1，这三种菌都能合成10和11，因此无论培养基中是否缺乏该营养，试验菌都能生存，因此若单缺的特殊营养物质为10、11中的一种，则在培养基上均会出现5个生长圈 1.某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作错误的是(　　) A．在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从健康植株上采集样品 B．将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测 C．将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落 D．判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小 √ 真题研析 【最新考情】 应用无菌水冲洗消毒后的样品 2.如图为用滤膜法测定饮用水中大肠杆菌数目的流程示意图，下列叙述正确的是（   ） A．过滤待测水样用到的滤杯、滤膜和滤瓶均需要进行消毒处理 B．制备EMB培养基时，待培养基冷却至室温后在酒精灯火焰附近倒平板 C．接种时用无菌镊子夹取滤膜边缘，滤膜截流细菌面向上紧贴于EMB培养基上 D．EMB培养基为选择培养基，培养后平板上的菌落均为大肠杆菌菌落 C 不烫手 灭菌 该培养基属于鉴别培养基，没有选择作用，培养后平板上除了大肠杆菌也有别的菌落 3．PhaB法是一种间接检测标本中结核分枝杆菌（MTB）的方法，其基本原理如图所示。噬菌体能感染和裂解活的结核分枝杆菌，将DNA注入MTB菌体内，进入宿主菌体内的噬菌体可免受杀病毒剂的灭活，在MTB菌体内进行增殖，最后裂解MTB释放出的子代噬菌体又可感染一种作为指示细胞的快生长分枝杆菌，在24h内形成清晰的噬菌斑。下列说法错误的是（       ） A．PhaB法检测MTB能仅检测样本中的活菌数 B．噬菌斑的数量越多，样本中的活菌数也就越多 C．结核杆菌能为噬菌体的增殖提供能量和原料 D．若杀病毒剂的量不足，则会导致检测结果偏小 D 选育菌种 扩大培养 接种 灭菌 配制培养基 分离提纯产物 获得产品 1.1发酵工程 一.传统发酵技术的应用 二.微生物的基本培养 1.培养基的配制 2.无菌技术 3.微生物的纯培养 三.微生物选择培养.计数 四.发酵工程及应用 1.基本环节 菌种来源： 自然界中筛选、 诱变育种、 基因工程育种 优良菌种的特点： 菌种不仅具有健壮 发酵产品的产量高、 质量稳定 培养基状态： 一般为液体培养基 目的： 获得更多的菌种 发酵工程种所用的菌种大多是单一菌种；避免因杂菌污染而影响产品的品质和产量 要随时检测培养液中微生物数量、产品浓度等，以了解发酵进程。 还要及时添加必需的营养组分，严格控制温度、PH和溶解氧等发酵条件。环境条件不仅影响微生物生长繁殖，还影响微生物代谢物的形成。 谷氨酸发酵 ①在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸； ②在酸性条件下则容易生成谷氨酰胺和N-乙酰谷胺酰胺； 产品的两种形式，采取手段 ①微生物细胞本身 过滤、沉淀 ②代谢物 提取、分离和纯化 发酵罐内发酵 中心环节 52 1.1发酵工程 一.传统发酵技术的应用 二.微生物的基本培养 1.培养基的配制 2.无菌技术 3.微生物的纯培养 三.微生物选择培养.计数 四.发酵工程及应用 1.基本环节 2.应用 食品工业 医药工业 生产传统发酵食品 农牧业 其他方面 生产食品添加剂 发酵工程应用 生产酶制剂 采用基因工程的方法，将植物或动物的基因转移到微生物中，获得具有某种药物生产能力的微生物 直接对菌种进行改造，再通过发酵技术大量生产所需要的产品 生产微生物肥料 生产微生物农药 生产微生物饲料 解决资源短缺与环境污染问题 将极端微生物应用于生产实践 在农牧业上的应用 (1)生产微生物肥料 ①微生物肥料的种类 根瘤菌肥、固氮菌肥 ②微生物肥料的作用增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植株生长； 有的微生物肥料可以抑制土壤中病原微生物的生长，减少病害的发生. (2)生产微生物农药 利用微生物或其代谢物来防治病虫害 属于生物防治 1.1发酵工程 一.传统发酵技术的应用 二.微生物的基本培养 1.培养基的配制 2.无菌技术 3.微生物的纯培养 三.微生物选择培养.计数 四.发酵工程及应用 1.基本环节 2.应用 啤酒的工业化生产流程 发芽 焙烤 碾磨 糖化 蒸煮 发酵 主发酵 消毒 终止 后发酵 完成酵母菌的繁殖，大部分糖的分解和代谢物的生成。 主发酵结束后，发酵液还不适合饮用，要在低温、密闭的环境下 储存一段时间进行后发酵，这样才能形成澄清、成熟的啤酒。 ①原理： 微生物含有丰富的蛋白质，且繁殖速度快。 ②实例1——单细胞蛋白 许多国家以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵获得了大量的微生物菌体，即单细胞蛋白。 单细胞蛋白应用——食品添加剂、微生物饲料； ③实例2-乳酸菌 在青贮饲料中添加乳酸菌，可以提高饲料的品质，使饲料保鲜，动物食用后还能提高免疫力。 1.1发酵工程 一.传统发酵技术的应用 二.微生物的基本培养 1.培养基的配制 2.无菌技术 3.微生物的纯培养 三.微生物选择培养.计数 四.发酵工程及应用 1.基本环节 2.应用 （3）生产微生物饲料 $