第3章第2节 基因工程的基本操作程序-【举一反三】2024-2025学年高二生物下学期同步教学讲义（人教版2019选择性必修3）

第2节　基因工程的基本操作程序 【题型1 目的基因的筛选与获取】 【题型2 基因表达载体的构建(核心)】 【题型3 将目的基因导入受体细胞】 【题型4 目的基因的检测与鉴定】 【题型1 目的基因的筛选与获取】 【紧扣教材】 目的基因的筛选与获取 1.目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 2.筛选合适的目的基因的方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 3.利用PCR获取和扩增目的基因: (1)PCR全称:聚合酶链式反应。 (2)原理:DNA半保留复制。 (3)条件: 场所 在缓冲液中进行,一般要添加Mg2+ 模板 DNA双链 原料 4种脱氧核苷酸 酶 耐高温的DNA聚合酶 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (4)过程: 第一步——变性:当温度超过90 ℃时,双链DNA解聚为单链。 第二步——复性:当温度下降到50 ℃左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 第三步——延伸:当温度上升到72 ℃左右时,溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 (5)结果:每次循环后目的基因的量增加一倍,即成指数形式扩增(约为2n,其中n为扩增循环的次数)。 【题型突破】 【例1】 由mRNA逆转录产生的单链DNA称为第一链cDNA，以第一链cDNA为模板合成的单链DNA称为第二链cDNA。下列叙述正确的是（    ） A．第一链cDNA可以单独作为PCR反应体系的模板 B．第一链cDNA与其模板mRNA序列互补、方向相同 C．第二链cDNA不能与转录该mRNA的DNA进行杂交 D．第二链cDNA与其模板mRNA的碱基序列和组成均相同 【变式1-1】 叶绿体基因组为闭合环状双链DNA 分子，matK 基因是叶绿体基因组中的重要基因之一。某研究小组对楠木及其近缘属植物进行了基因组 DNA 的提取、叶绿体 matK 基因序列扩增并测定碱基含量。结果表明，楠木中 matK 基因G+C含量约为36.6%，不同于其近缘属植物。下列叙述错误的是（　　） A．检测 matK 基因一条链的序列即可获得碱基含量信息 B．叶绿体基因组中每个磷酸分子都连接着一个脱氧核糖 C．DNA分子的提取、matK 基因序列的扩增离不开有机溶剂 D．matK 基因的碱基含量可用于楠木及其近缘属植物的属间鉴定 【变式1-2】 PCR反应需要分别与两条模板链结合的两种引物。引物的设计是影响PCR扩增反应效率和特异性的关键因素，下列相关叙述错误的是（    ） A．引物是能与DNA母链的一段碱基序列互补的短单链核酸 B．PCR反应中的延伸阶段两种引物分别与模板链3′端结合 C．引物设计的前提是需要一段已知的目的基因的碱基序列 D．根据需要可以在引物的5′端添加限制酶识别的碱基序列 【变式1-3】 数字PCR技术被称为第三代PCR,在核酸定量检测中具有突出优势。该技术通过将一个样本稀释分成几十至几万份，并分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，计算初始样品中靶标分子的拷贝数。据此分析，下列说法正确的是（　　） A．数字PCR技术仅适用于样本中目标分子含量较高的材料 B．数字PCR技术遵循的基本原理是DNA的边解旋边复制 C．每个单元中加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料 D．每个单元中目标分子的两条子链合成都是从5'端向3'端延伸 【变式1-4】 现将XplA和XplB两种能降解弹药使用后残留的危险污染物的基因转入实弹射击场的柳枝稷草中。若要通过PCR检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的XplA和XplB基因，应选择的引物组合是（    ） A．引物1+引物3 B．引物1+引物2 C．引物2+引物3 D．引物3+引物4 【题型2 基因表达载体的构建(核心)】 【紧扣教材】 基因表达载体的构建(核心) 【题型突破】 【例2】 某动物phb2基因表达的PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的机理，研究者将phb2基因（该基因内部序列不含图中限制酶的识别序列）导入大肠杆菌中表达出该蛋白。图为所用载体示意图，表格为有关限制酶的种类及识别序列和切割位点。下列有关基因工程操作的叙述错误的是（　　） 名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 HindIII A↓AGCTT TTCGA↑A EcoRI G↓AATTC CTTAA↑G PvitII CAG↓CTG GTC↑GAC PstI CTGC↓AG GA↑CGTC KpnI G↓GTACC CCATG↑G BamHI G↓GATCC CCTAG↑G A．提取分裂细胞的总RNA，经逆转录等系列过程后进而获取目的基因 B．PCR 扩增目的基因需要由 Mg2+激活的 TaqDNA 聚合酶参与 C．基因表达载体构建过程需要用限制酶PvitⅡ、EcoRⅠ切割phb2基因和载体 D．基因表达载体构建过程需要用E. coli DNA 连接酶将 phb2基因和载体进行连接 【变式2-1】 为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0.9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表，phb2基因序列不含图1中限制酶的识别序列。转化后的大肠杆菌提取质粒，再用选中的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2．下列叙述错误的是（    ） 相关限制酶的识别序列及切割位点（注：箭头表示切割位点） 名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 HindⅢ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoRI G↓AATTC CTTAA↑G PvitⅡ CAG↓CTG GTC↑GAC PstI GA↑CGTC GA↑CGTC KpnⅠ G↓GATCC CCATG↑G BamHI G↓GATCC CCTAG↑G A．需设计特异性的引物通过PCR技术扩增phb2基因 B．为使phb2基因与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入KpnⅠ和EcoRⅠ两种不同限制酶的识别序列 C．经过两种限制酶酶切的phb2基因与载体进行连接时，可选用T4DNA连接酶 D．图2中3号的质粒很可能是含目的基因的重组质粒 【变式2-2】 为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0．9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表，phb2基因序列不含图1中限制酶的识别序列。转化后的大肠杆菌提取质粒，再用选中的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2．下列叙述错误的是（    ） 相关限制酶的识别序列及切割位点（注：箭头表示切割位点） 名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 HindⅢ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoRI G↓AATTC CTTAA↑G PvitⅡ CAG↓CTG GTC↑GAC PstI CTGC↓AG GA↑CGTC KpnI G↓GTACC CCATG↑G BamHI G↓GATCC CCTAG↑G A．需设计特异性的引物通过PCR技术扩增phb2基因 B．为使phb2基因与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入KpnⅠ和EcoRⅠ两种不同限制酶的识别序列 C．需用CaCl2处理大肠杆菌制备感受态细胞，以提高转化率 D．图2中3号的质粒很可能是含目的基因的重组质粒 【变式2-3】 PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），利用大肠杆菌表达该蛋白。下图为所用载体示意图，phb2基因基因序列不含图中限制酶的识别序列。下列叙述错误的是（　　） A．将phb2基因与载体正确连接构建基因表达载体是培育转基因大肠杆菌的核心工作 B．为使phb2基因与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端可分别引入PvuⅡ和EcoRI限制酶的识别序列 C．在使phb2基因与载体连接时，在扩增的phb2基因两端都引入PvuⅡ限制酶的识别序列可能导致目的基因环化 D．构建基因表达载体时，需选择BamHI限制酶破坏氨苄青霉素抗性基因，以便对目的基因是否正常转人进行检测与鉴定 【变式2-4】 为初步探究某动物phb2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因(简称phb2基因)编码序列，大小约为0.9 kb，并利用大肠杆菌表达该蛋白。图1为所用质粒示意图，已知phb2基因序列不含图1中限制酶的识别序列。从转化后的大肠杆菌中提取质粒，再用选中的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2，下列叙述错误的是（　　） A．为使phb2基因与载体正确连接，应在扩增的phb2基因两端分别引入KpnⅠ和EcoRⅠ两种不同限制酶的识别序列 B．需设计特异性的引物通过PCR技术扩增phb2基因 C．需用CaCl2处理大肠杆菌，以提高转化率 D．图2中的3号质粒有可能是含目的基因的重组质粒 【题型3 将目的基因导入受体细胞】 【紧扣教材】 将目的基因导入受体细胞 1.植物细胞: 2.动物细胞:显微注射法,将目的基因注入动物的受精卵中。 3.原核生物:先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中。 【题型突破】 【例3】 干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，广泛用于治疗病毒感染性疾病。重组人干扰素α-1b是我国研究人员研制出的基因工程药物，其流程如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．过程a、b、c都在细胞外特定的反应液中完成 B．过程b需要逆转录酶、限制酶、DNA连接酶等参与 C．过程c需要用Ca2+等处理大肠杆菌，以促进大肠杆菌吸收外源DNA分子 D．转基因大肠杆菌的发酵液中必须含有氮源、碳源、水和无机盐等营养物质 【变式3-1】 由于某目的基因酶切后的末端为平末端，载体E只有产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。据图分析，下列叙述错误的是（　　） A．基因工程的核心步骤是构建基因表达载体 B．为了便于该目的基因接入载体E，可用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P C．载体P只能作为中间载体，因为其没有表达该目的基因的启动子与终止子 D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，则表明重组载体可能导入受体细胞 【变式3-2】 水稻易被某种真菌感染导致生长不良，有研究发现花生细胞的S基因在抗真菌类病害中发挥着重要作用，这为水稻的改良提供了新的思路。以下叙述正确的是（    ） A．该种真菌只能发生基因突变和基因重组两种变异 B．利用基因工程改良水稻可产生抗真菌的水稻新物种 C．该种真菌对花生的持续感染导致其产生了S基因 D．将S基因导入水稻使其获得抗病能力属于基因重组 【变式3-3】 我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因（idgS）及其激活基因（sfp）构建基因表达载体（如图），通过农杆菌转化法导入白玫瑰细胞中，获得蓝玫瑰。下列叙述错误的是（　　） A．表达载体中sfp和idgS具有各自的启动子，表达相互独立 B．可利用DNA分子杂交技术从链霉菌的基因文库中获取sfp和idgS C．将sfp插入Ti质粒时不能同时使用限制酶PmeⅠ和BamHⅠ D．若受体白玫瑰不变蓝，则可说明sfp和idgS未成功导入 【变式3-4】 根癌农杆菌侵染植物细胞时，其Ti质粒上的T-DNA片段能转入植物的基因组中，因此可利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因操作。下列相关叙述正确的是（　　） A．目的基因应插入T-DNA片段外，以防止破坏T-DNA B．用Ca2+处理农杆菌，以利于其感染植物细胞 C．Ti质粒是一种环状DNA分子，属于细菌的拟核DNA D．T-DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物染色体DNA中 【题型4 目的基因的检测与鉴定】 【紧扣教材】 目的基因的检测与鉴定 1.分子水平的检测: 检测对象 方法 染色体DNA上是否插入目的基因 PCR等技术 受体细胞是否转录出mRNA PCR等技术 目的基因是否翻译出蛋白质 抗原-抗体杂交 2.个体水平鉴定: (1)方法:培育导入了特定目的基因的生物体,并观察其是否表达出所需的性状。 (2)实例:通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。 【题型突破】 【例4】 医生可利用分子生物学技术检测受检人是否携带HIV。下列叙述错误的是（    ） A．可根据HIV的RNA序列合成小段DNA作为引物 B．血液样品中HIV的RNA经逆转录后进行PCR检测 C．与检测抗原、核酸相比，检测抗体能更早诊断HIV感染 D．可通过抗原—抗体杂交技术检测血液样品中HIV抗原 【变式4-1】 SRY基因是哺乳动物Y染色体上具有决定雄性性别作用的基因片段，常用作对移植前的胚胎进行性别鉴定，其过程如下：先从被测胚胎细胞中提取DNA片段，然后设计特异性引物并用胚胎细胞中的DNA为模板进行PCR扩增，最后用特异性探针(是一段带有检测标记，能与目的基因互补的核苷酸序列)对扩增产物进行检测，该鉴定方法被称为SRY-PCR法。下列对该方法的分析，错误的是(　　) A．设计特异性引物和探针时需要用到SRY基因的核苷酸序列 B．扩增SRY基因时，当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链 C．当温度下降到72℃左右时，两种特异性引物会与互补的DNA链结合 D．用特异性探针对扩增产物进行检测时，若结果呈阳性，则检测个体为雄性 【变式4-2】 斑点印迹杂交是一种核酸分子杂交技术，其技术流程如图所示。在食品卫生检测和环境监测等领域，利用斑点印迹杂交技术可快速检测出样品中存在的致病微生物或污染微生物。下列相关分析不合理的是（    ）    A．斑点印迹杂交技术可用于受体菌细胞中转基因转录量的检测 B．斑点印迹杂交技术可用于已知遗传病致病基因的点突变的检测 C．p和q片段能够杂交的主要原因是两条链的碱基可以互补配对 D．标记的探针中碱基序列的长度越短，则检测的精确度会越高 【变式4-3】 Hv-Lv肽链是抗体与抗原识别并结合的关键结构。为筛选特异性高、结合能力强的Hv-Lv肽链，将编码Hv-Lv肽链的DNA片段与丝状噬菌体固有外壳蛋白pⅧ的基因连接并一起表达，最后用固定化抗原筛选（过程如图）。 下列说法错误的是（    ） A．Hv-LvDNA片段上游需要设计并连接启动子 B．Hv-LvDNA片段上无需连接标记基因 C．目标是获得能耐受多次冲洗的噬菌体 D．实验过程须严格遵循生物防护措施 【变式4-4】 下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达（　　） A．在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因 B．通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因 C．提取受体细胞合成的相应蛋白质，利用抗原—抗体杂交技术进行检测 D．抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性 一、单选题 1．据研究，W基因在植物发育和逆境应答过程中发挥重要作用。研究人员将W基因的启动子（PW）与GUS基因相连，构建拟南芥PW-GUS融合植株（GUS为报告基因，其表达产物可催化无色底物变蓝），用无色底物处理拟南芥幼苗的根，探究W基因在拟南芥缺铁胁迫中的表达水平，下列叙述错误的是（　　） A．扩增W基因启动子需2种引物，并在引物3'端加入酶切位点 B．PW和GUS基因进行双酶切后，可通过T4 DNA连接酶连接 C．培养拟南芥无菌苗的MS固体培养基需要用高压蒸汽灭菌法灭菌 D．通过观察根蓝色深浅确认W基因在拟南芥缺铁胁迫中的表达水平 2．科研人员在研究水稻矮秆的控制基因的过程中，发现矮秆突变型的基因r比野生型基因R多了一个酶切位点，如图所示。利用矮秆突变型水稻与野生型高秆水稻杂交得到的全为中间类型，自交得到的中野生型：突变型：中间类型=1:1:2，下列分析正确的是（    ） A．根据杂交结果判断水稻茎秆高低的遗传不符合基因的分离定律 B．用PCR技术克隆R、r基因需要设计两组不同的特异性引物 C．所有个体自由交配，其子代野生型：突变型=3:1 D．的中间类型通过PCR、酶切、琼脂糖凝胶电泳等技术可得到3条条带 3．PCR反应一般需要加入2种引物，引物设计是目的基因特异性扩增的关键。下列不属于引物设计要求的是 A．能够与两条模板链结合 B．2种引物之间能碱基互补配对 C．一段单链核酸 D．引物长度要合适 4．下列有关基因工程及其应用叙述，错误的有（　　） ①限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶 ②DNA聚合酶和DNA连接酶都能催化磷酸二酯键的形成 ③利用PCR扩增目的基因时，要用2种不同但能够互补配对的引物 ④在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小有关 ⑤标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞 A．一项 B．二项 C．三项 D．四项 5．在存在的条件下，DNA聚合酶可被激活。下列相关说法正确的是（    ） A．细菌细胞的DNA聚合酶发挥作用不需要 B．PCR技术中的DNA聚合酶在90℃条件下不会失活 C．DNA聚合酶需先与启动子结合，继而从引物的5'端延伸子链 D．真核细胞内的DNA聚合酶均属于在细胞核内发挥作用的亲核蛋白 6．将群体感应基因与裂解基因导入益生菌中，益生菌裂解时释放的抗肿瘤药物可使肿瘤消融。群体感应基因用于感知细菌群体的数量，细菌数量较少时进行繁殖，当细菌数量达到感应阈值时会启动裂解基因表达。下列叙述错误的是（　　） A．获得具有肿瘤治疗作用益生菌的关键步骤是构建基因表达载体 B．益生菌释放的抗肿瘤药物能够识别肿瘤，达到治病的作用 C．患者体内的益生菌数量呈现规律性变化是因为群体感应基因和裂解基因的存在 D．利用益生菌消除肿瘤的过程中，肿瘤细胞的死亡属于细胞凋亡 7．Cre-Loxp系统是基因工程中常用的特异性重组酶系统，该系统中的Cre酶能根据两个Loxp的方向删除或倒置位于两个Loxp序列间的基因，如图1所示。现使用Cre-Loxp系统构建TK基因缺失的病毒毒株，为研发该病毒的疫苗提供候选毒株，构建过程如图2所示，下列分析错误的是（    ） A．图1中Gene两端需含有两个相同的碱基序列 B．位于RFP基因两端的Loxp序列方向相反 C．Cre酶处理之前，应初步筛选出有红色荧光基因的病毒 D．Cre酶在图2过程中的具有限制酶和DNA连接酶的功能 8．不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列有关叙述错误的是（    ） A．限制性引物和非限制性引物均可与模板DNA单链结合 B．不对称PCR循环6次需要消耗（26-1）a个限制性引物 C．最后获得的ssDNA中不含非限制性引物 D．子链的延伸都是从两种引物的3'端开始的 9．利用pBR322质粒将人胰岛素基因导入大肠杆菌（如图1）可进行工业化生产。为检验基因表达载体是否成功导入，将处理后的大肠杆菌接种在培养基上，长出的四个菌落用无菌纸分别盖印至四种不同的培养基上（如图2，菌落相对位置不变），菌落生长状况如图所示，则成功导入基因表达载体的菌落是（    ） A．菌落1、2、3 B．菌落2、3 C．菌落1 D．菌落4 10．穿梭质粒携带棉花的偏好启动子p35s转入农杆菌，可提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。下列叙述错误的是（    ） 注：F1—F3，R1—R3表示引物；T—DNA—LB表示左边界；T—DNA—RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 A．获取目的基因的方法有PCR技术扩增和人工合成 B．RNA聚合酶与穿梭质粒中的启动子p35s识别并结合，驱动目的基因转录 C．含卡那霉素的培养基可初步筛选转化的棉花愈伤组织 D．以棉花DNA作模板，选用引物F3和R2进行PCR检测棉花植株是否导入目的基因 二、多选题 11．斑点印迹杂交是一种核酸分子杂交技术，其技术流程如图所示。在食品卫生检测和环境监测等领域，利用斑点印迹杂交技术可快速检测出样品中存在的致病微生物或污染微生物。下列相关分析合理的是（    ） A．斑点印迹杂交技术可用于受体菌细胞中转基因转录量的检测 B．斑点印迹杂交技术可用于已知遗传病致病基因的突变的检测 C．p和q片段能够杂交的主要原因是两条链的碱基可以互补配对 D．标记的探针中碱基序列的长度越短，则检测的精确度会越高 12．遗传性耳聋有很强的遗传异质性，即不同位点的耳聋致病基因可导致相同表型的听觉功能障碍，而同一个基因的不同突变可以引起不同临床表现的耳聋。科研人员确定了一种与耳聋相关的基因，并对其进行测序，结果如图所示。有关分析错误的是（    ）    A．造成相同表型听觉功能障碍的致病基因不一定相同 B．图中的基因序列作为模板链，指导合成相应的mRNA C．通常借助于“PCR+琼脂糖凝胶电泳”的方法对基因进行测序 D．同一个基因可突变出不同基因，体现了基因突变具有随机性 13．荧光定量PCR技术：在PCR反应体系中加入特异性的荧光探针，开始时探针完整地结合在DNA任意一条单链上，扩增时每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，对扩增反应中的荧光强度进行实时检测后，可通过标准曲线定量计算出初始模板量。某荧光定量PCR的标准曲线如图所示。下列说法正确的是（　　） A．该实验需要DNA聚合酶的参与 B．实验后期荧光强度不再变化的原因可能是荧光探针或原料等耗尽 C．样品甲的初始模板量小于样品乙的 D．每个反应管内加入的荧光探针和原料的量均应该相同 14．如图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程。①~④表示相关的操作，EcoRⅠ、BamHⅠ为限制酶，它们的识别序列及切割位点如表所示。下列说法正确的是（　　） A．过程①依据的原理是DNA的半保留复制 B．在过程③中T-DNA可整合到受体细胞的染色体DNA上 C．为方便后续的剪切和连接，可在两种引物的一端分别加上GAATTC和GGATCC序列 D．过程④中，科研人员最终未能检测到干扰素基因，其原因可能是干扰素基因未能成功导入人参愈伤组织细胞中 15．某科研小组利用PCR定点突变技术培育抗冻番茄新品种。设计含有非特异性碱基配对的引物，将突变位点引入编码抗冻蛋白的基因中，获得抗冻能力更强的突变基因。下列叙述正确的是（　　）    A．过程②还需要四种脱氧核苷酸和耐高温的DNA连接酶 B．过程③至少需要进行2次循环才能得到两条链等长的DNA分子 C．过程④获得的2种杂交DNA中只有一种经过程⑤能获得目的基因 D．常采用显微注射法将获得的目的基因导入番茄细胞培育抗冻新品种 三、非选择题 16．科研人员利用图1所示材料构建重组质粒并导入大肠杆菌，以期获得能监测生物组织或环境中四环素水平的“报警器”。限制酶识别序列及切割位点如下表。TetR基因是一种转录调节基因，GFp基因为绿色荧光蛋白基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，ori为复制原点。请回答下列问题： 限制酶 EcoRⅠ XbaⅠ SpeⅠ BamHⅠ 识别序列及切割位点 (1)使用工具酶拼接DNA片段1和2，拼接后的片段连接处部分序列为5＇ 3＇（写出6个碱基），TetR基因和GFP基因转录的模板链 （“是”或“不是”）该拼接DNM的同一条链。 (2)构建重组质粒时，选择 对质粒和拼接的DNA片段进行酶切，在DNA连接酶的作用下恢复 键。再根据 的结果判断重组质粒的大小是否符合预期。 (3)将重组质粒导入经 理的大肠杆菌后，在含 的固体培养基中筛选出工程菌。 (4)工程菌监测四环素的原理如图2，当环境中含四环素时，该大肠杆菌工程菌 （能/不能）发出荧光，其原因是 。 2 学科网（北京）股份有限公司 $$ 第2节　基因工程的基本操作程序 【题型1 目的基因的筛选与获取】 【题型2 基因表达载体的构建(核心)】 【题型3 将目的基因导入受体细胞】 【题型4 目的基因的检测与鉴定】 【题型1 目的基因的筛选与获取】 【紧扣教材】 目的基因的筛选与获取 1.目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 2.筛选合适的目的基因的方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 3.利用PCR获取和扩增目的基因: (1)PCR全称:聚合酶链式反应。 (2)原理:DNA半保留复制。 (3)条件: 场所 在缓冲液中进行,一般要添加Mg2+ 模板 DNA双链 原料 4种脱氧核苷酸 酶 耐高温的DNA聚合酶 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (4)过程: 第一步——变性:当温度超过90 ℃时,双链DNA解聚为单链。 第二步——复性:当温度下降到50 ℃左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 第三步——延伸:当温度上升到72 ℃左右时,溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 (5)结果:每次循环后目的基因的量增加一倍,即成指数形式扩增(约为2n,其中n为扩增循环的次数)。 【题型突破】 【例1】 由mRNA逆转录产生的单链DNA称为第一链cDNA，以第一链cDNA为模板合成的单链DNA称为第二链cDNA。下列叙述正确的是（    ） A．第一链cDNA可以单独作为PCR反应体系的模板 B．第一链cDNA与其模板mRNA序列互补、方向相同 C．第二链cDNA不能与转录该mRNA的DNA进行杂交 D．第二链cDNA与其模板mRNA的碱基序列和组成均相同 【答案】A 【分析】第一链cDNA是以mRNA为模板合成的单链DNA，所以，逆转录出的单链DNA与mRNA碱基互补配对，第一链cDNA中相邻碱基相连于一条链上，通过脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖相连接，它的合成不需要解旋酶参与。 【详解】A、第一链cDNA可以单独作为PCR反应体系的模板，进行PCR扩增，A正确； B、第一链cDNA与其模板mRNA序列互补、方向相反，B错误； C、第二链cDNA能与转录该mRNA的DNA进行杂交，碱基互补配对，C错误； D、第二链cDNA与其模板mRNA的碱基序列互补，组成相同，D错误。 故选A。 【变式1-1】 叶绿体基因组为闭合环状双链DNA 分子，matK 基因是叶绿体基因组中的重要基因之一。某研究小组对楠木及其近缘属植物进行了基因组 DNA 的提取、叶绿体 matK 基因序列扩增并测定碱基含量。结果表明，楠木中 matK 基因G+C含量约为36.6%，不同于其近缘属植物。下列叙述错误的是（　　） A．检测 matK 基因一条链的序列即可获得碱基含量信息 B．叶绿体基因组中每个磷酸分子都连接着一个脱氧核糖 C．DNA分子的提取、matK 基因序列的扩增离不开有机溶剂 D．matK 基因的碱基含量可用于楠木及其近缘属植物的属间鉴定 【答案】B 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。 【详解】A、基因两条链上的碱基呈互补关系，故检测 matK 基因一条链的序列即可获得碱基含量信息，A正确； B、叶绿体基因组为闭合环状双链DNA 分子，故叶绿体基因组中每个磷酸分子都连接着两个脱氧核糖，B错误； C、DNA分子的提取需要酒精、甲酰胺是一种有机溶剂，在PCR反应中通过降低DNA双螺旋的稳定性来发挥作用，故DNA分子的提取、matK 基因序列的扩增离不开有机溶剂，C正确； D、通过题干信息“对楠木及其近缘属植物进行了基因组 DNA 的提取、叶绿体 matK 基因序列扩增并测定碱基含量。结果表明，楠木中 matK 基因G+C含量约为36.6%，不同于其近缘属植物”可知，matK 基因的碱基含量可用于楠木及其近缘属植物的属间鉴定，D正确。 故选B。 【变式1-2】 PCR反应需要分别与两条模板链结合的两种引物。引物的设计是影响PCR扩增反应效率和特异性的关键因素，下列相关叙述错误的是（    ） A．引物是能与DNA母链的一段碱基序列互补的短单链核酸 B．PCR反应中的延伸阶段两种引物分别与模板链3′端结合 C．引物设计的前提是需要一段已知的目的基因的碱基序列 D．根据需要可以在引物的5′端添加限制酶识别的碱基序列 【答案】B 【分析】PCR技术：1、概念：PCR.全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 2、原理：DNA复制。 3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。 4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。 5、过程：①高温变性：DNA解旋过程(PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开) ；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸:合成子链。 【详解】A、引物是能与DNA母链的一段碱基序列互补的短单链核酸，A正确； B、PCR反应中的复性阶段，两种引物通过碱基互补配对与两条模板DNA链结合，B错误； C、设计引物的前提是需要一段已知目的基因的碱基序列，C正确； D、根据需要可以在引物的5′端添加限制酶识别序列，方便切割操作，D正确。 故选B。 【变式1-3】 数字PCR技术被称为第三代PCR,在核酸定量检测中具有突出优势。该技术通过将一个样本稀释分成几十至几万份，并分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，计算初始样品中靶标分子的拷贝数。据此分析，下列说法正确的是（　　） A．数字PCR技术仅适用于样本中目标分子含量较高的材料 B．数字PCR技术遵循的基本原理是DNA的边解旋边复制 C．每个单元中加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料 D．每个单元中目标分子的两条子链合成都是从5'端向3'端延伸 【答案】D 【分析】多聚酶链式反应扩增DNA片段： （1）PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的，实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 （2）PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】A、数字PCR技术把检测样本稀释后分配到不同的反应单元，在每个单元进行一个或多个目标分子扩增，再对每个单元的扩增结果综合分析，计算初始样品中靶标分子的拷贝数。该技术对高、中、低水平的目标分子含量的材料均可实现正确、精密的测定，A错误； B、数字PCR技术遵循的基本原理是DNA半保留复制，B错误； CD、每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，需要加入4种脱氧核苷酸的等量混合液、与目标分子特异性结合的两种引物和TaqDNA聚合酶等，两条子链合成是从两种引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，C错误、D正确。 故选D。 【变式1-4】 现将XplA和XplB两种能降解弹药使用后残留的危险污染物的基因转入实弹射击场的柳枝稷草中。若要通过PCR检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的XplA和XplB基因，应选择的引物组合是（    ） A．引物1+引物3 B．引物1+引物2 C．引物2+引物3 D．引物3+引物4 【答案】A 【分析】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸，检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的XplA 和 XplB 基因，应该是扩增包括XplA 和 XplB 基因和两侧T-DNA基因片段。 【详解】根据启动子的位置，若正确插入，模板链应为题甲图中下链，则引物1应与下链的3'端结合，引物3可以结合题甲图上链的3'端，若XplA和XplB基因正确插入，则使用引物1+引物3可通过PCR扩增出XplA和XplB基因融合片段，若Xp1A和XplB基因其中一个基因反接或者两个都基因反接，通过PCR均无法扩增出Xp1A和XplB基因融合片段，因此，使用引物1+引物3通过PCR可检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的Xp1A和XplB基因，A正确；BCD错误。 故选A。 【题型2 基因表达载体的构建(核心)】 【紧扣教材】 基因表达载体的构建(核心) 【题型突破】 【例2】 某动物phb2基因表达的PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的机理，研究者将phb2基因（该基因内部序列不含图中限制酶的识别序列）导入大肠杆菌中表达出该蛋白。图为所用载体示意图，表格为有关限制酶的种类及识别序列和切割位点。下列有关基因工程操作的叙述错误的是（　　） 名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 HindIII A↓AGCTT TTCGA↑A EcoRI G↓AATTC CTTAA↑G PvitII CAG↓CTG GTC↑GAC PstI CTGC↓AG GA↑CGTC KpnI G↓GTACC CCATG↑G BamHI G↓GATCC CCTAG↑G A．提取分裂细胞的总RNA，经逆转录等系列过程后进而获取目的基因 B．PCR 扩增目的基因需要由 Mg2+激活的 TaqDNA 聚合酶参与 C．基因表达载体构建过程需要用限制酶PvitⅡ、EcoRⅠ切割phb2基因和载体 D．基因表达载体构建过程需要用E. coli DNA 连接酶将 phb2基因和载体进行连接 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的筛选和获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、利用RNA获得与RNA链互补的单链DNA的过程称为逆转录，A正确； B、PCR过程中需要耐高温的DNA聚合酶，且此酶需要Mg2+激活，B正确； C、根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间。图中看出，两者之间存在于三种限制酶切点，但是由于Kpn I在质粒上不止一个酶切位点。所以应该选择EcoR Ⅰ和Pvit Ⅱ两种不同限制酶的识别序列，C正确； D、根据Pvit Ⅱ的酶切序列，切出了平末端，用EcoR I酶切出现粘性末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4DNA连接酶（两种末端都能连接）连接载体和目的基因，D错误。 故选D。 【变式2-1】 为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0.9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表，phb2基因序列不含图1中限制酶的识别序列。转化后的大肠杆菌提取质粒，再用选中的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2．下列叙述错误的是（    ） 相关限制酶的识别序列及切割位点（注：箭头表示切割位点） 名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 HindⅢ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoRI G↓AATTC CTTAA↑G PvitⅡ CAG↓CTG GTC↑GAC PstI GA↑CGTC GA↑CGTC KpnⅠ G↓GATCC CCATG↑G BamHI G↓GATCC CCTAG↑G A．需设计特异性的引物通过PCR技术扩增phb2基因 B．为使phb2基因与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入KpnⅠ和EcoRⅠ两种不同限制酶的识别序列 C．经过两种限制酶酶切的phb2基因与载体进行连接时，可选用T4DNA连接酶 D．图2中3号的质粒很可能是含目的基因的重组质粒 【答案】B 【分析】图1为所用载体图谱示意图，目的基因要插在启动子和终止子之间，可用EcoRⅠ和PvitⅡ两种不同限制酶切割，KpnⅠ在启动子和终止子之外还有切割位点，所以不用KpnⅠ切割；由图3可知，EcoRⅠ切割得到黏性末端，PvitⅡ切割可得到平末端，由于目的基因不含图1中限制酶的识别序列，所以要在目的基因两端分别加上EcoRⅠ和PvitⅡ切割后的序列末端，再用T4DNA连接酶将目的基因连接到载体上，完成基因表达载体的构建。 【详解】A、通过PCR技术扩增phb2基因时需设计根据phb2基因特异性的引物，A正确； B、目的基因应导入启动子和终止子之间，两者之间存在三种限制酶切点，但是由于KpnⅠ在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcoRⅠ和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列，B错误； C、T4DNA连接酶既可以“缝合”双链 DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对比较低，可以用T4DNA连接酶连接，C正确； D、题干显示，目的基因大小约0.9kb，图2中3号的质粒酶切后得到约6kb片段和约1kb片段，约1kb片段很可能是目的基因，D正确。 故选B。 【变式2-2】 为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0．9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表，phb2基因序列不含图1中限制酶的识别序列。转化后的大肠杆菌提取质粒，再用选中的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2．下列叙述错误的是（    ） 相关限制酶的识别序列及切割位点（注：箭头表示切割位点） 名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 HindⅢ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoRI G↓AATTC CTTAA↑G PvitⅡ CAG↓CTG GTC↑GAC PstI CTGC↓AG GA↑CGTC KpnI G↓GTACC CCATG↑G BamHI G↓GATCC CCTAG↑G A．需设计特异性的引物通过PCR技术扩增phb2基因 B．为使phb2基因与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入KpnⅠ和EcoRⅠ两种不同限制酶的识别序列 C．需用CaCl2处理大肠杆菌制备感受态细胞，以提高转化率 D．图2中3号的质粒很可能是含目的基因的重组质粒 【答案】B 【分析】限制酶的选择不能破坏目的基因，不能破坏载体上的关键结构，比如启动子、终止子、复制原点等。 【详解】A、需设计特异性的引物通过PCR技术扩增phb2基因，A正确； B、目的基因应导入启动子和终止子之间。图中看出，两者之间存在于三种限制酶切点，但是由于KpnⅠ在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcoRⅠ和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列，B错误； C、需用CaCl2处理大肠杆菌制备感受态细胞，以提高转化率，C正确； D、用EcoRⅠ和PvitⅡ两种不同限制酶切割质粒，会获得一大一小两个片段，图2中3号的质粒酶切后得到一大一小两个片段，很可能是含目的基因的重组质粒，D正确。 故选B。 【变式2-3】 PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），利用大肠杆菌表达该蛋白。下图为所用载体示意图，phb2基因基因序列不含图中限制酶的识别序列。下列叙述错误的是（　　） A．将phb2基因与载体正确连接构建基因表达载体是培育转基因大肠杆菌的核心工作 B．为使phb2基因与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端可分别引入PvuⅡ和EcoRI限制酶的识别序列 C．在使phb2基因与载体连接时，在扩增的phb2基因两端都引入PvuⅡ限制酶的识别序列可能导致目的基因环化 D．构建基因表达载体时，需选择BamHI限制酶破坏氨苄青霉素抗性基因，以便对目的基因是否正常转人进行检测与鉴定 【答案】D 【分析】限制酶的选择不能破坏目的基因，不能破坏载体上的关键结构，比如启动子、终止子、复制原点等。 【详解】A、将phb2基因与载体正确连接构建基因表达载体是培育转基因大肠杆菌的核心工作，A正确； B、限制酶的选择不能破坏目的基因，不能破坏载体上的关键结构，为使phb2基因与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端可分别引入PvuⅡ和EcoRI限制酶的识别序列，也可以防止自身环化，B正确； C、在使phb2基因与载体连接时，在扩增的phb2基因两端都引入PvuⅡ限制酶的识别序列，会产生可以互补配对的序列，可能导致目的基因环化，C正确； D、氨苄青霉素抗性基因是标记基因，选择BamHI限制酶破坏氨苄青霉素抗性基因,则不利于目的基因是否正常转人进行检测与鉴定，D错误。 故选D。 【变式2-4】 为初步探究某动物phb2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因(简称phb2基因)编码序列，大小约为0.9 kb，并利用大肠杆菌表达该蛋白。图1为所用质粒示意图，已知phb2基因序列不含图1中限制酶的识别序列。从转化后的大肠杆菌中提取质粒，再用选中的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2，下列叙述错误的是（　　） A．为使phb2基因与载体正确连接，应在扩增的phb2基因两端分别引入KpnⅠ和EcoRⅠ两种不同限制酶的识别序列 B．需设计特异性的引物通过PCR技术扩增phb2基因 C．需用CaCl2处理大肠杆菌，以提高转化率 D．图2中的3号质粒有可能是含目的基因的重组质粒 【答案】A 【分析】双酶切的优点是：防止目的基因（载体）自身连接，防止目的基因与运载体反向连接；在重组质粒环节，为了使目的基因能表达，应该将目的基因插入质粒的启动子和终止子之间。 【详解】A、目的基因应该导入启动子和终止子之间，图1中两者启动子和终止子之间有三种限制酶切点，但是由于KpnⅠ在质粒上存在不止一个酶切点（两个），所以应该选择EcoRⅠ和PvitⅡ两种不同的限制酶的识别序列，A错误； B、PCR技术扩增phb2基因，需要一段已知的核苷酸序列作为引物，特异性扩增所需要的目的基因片段，B正确； C、转化时需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于能吸收周围DNA分子的生理状态（感受态），以提高转化效率，C正确； D、用EcoRⅠ和PvitⅡ两种限制酶切割质粒会获得一大、一小两个片段，且由题干信息可知，phb2基因大小约为0.9 kb，能对应3号质粒的一个条带，故图2中的3号质粒符合上述要求，有可能是含有目的基因的重组质粒，D正确。 故选A。 【题型3 将目的基因导入受体细胞】 【紧扣教材】 将目的基因导入受体细胞 1.植物细胞: 2.动物细胞:显微注射法,将目的基因注入动物的受精卵中。 3.原核生物:先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中。 【题型突破】 【例3】 干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，广泛用于治疗病毒感染性疾病。重组人干扰素α-1b是我国研究人员研制出的基因工程药物，其流程如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．过程a、b、c都在细胞外特定的反应液中完成 B．过程b需要逆转录酶、限制酶、DNA连接酶等参与 C．过程c需要用Ca2+等处理大肠杆菌，以促进大肠杆菌吸收外源DNA分子 D．转基因大肠杆菌的发酵液中必须含有氮源、碳源、水和无机盐等营养物质 【答案】A 【分析】图中a表示转录，b是逆转录，c是将外源基因导入大肠杆菌。 【详解】A、a过程可以在细胞内完成，A错误； B、b是逆转录形成重组DNA ，需要逆转录酶、限制酶、DNA连接酶等参与，B正确； C、c是将外源基因导入大肠杆菌，通常用Ca2+处理大肠杆菌，以促进大肠杆菌吸收外源DNA分子，C正确； D、培养液需要给大肠杆菌提供氮源、碳源、水和无机盐等营养物质，D正确。 故选A。 【变式3-1】 由于某目的基因酶切后的末端为平末端，载体E只有产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。据图分析，下列叙述错误的是（　　） A．基因工程的核心步骤是构建基因表达载体 B．为了便于该目的基因接入载体E，可用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P C．载体P只能作为中间载体，因为其没有表达该目的基因的启动子与终止子 D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，则表明重组载体可能导入受体细胞 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。 4、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测；①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，A正确； B、由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，据图可知，中间载体P和载体E均含有XhoI和PstI酶识别序列，故可选用XhoI和PstI酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcoRV识别位点，并且其切割的为平末端，可以用于连接目的基因，SmaI酶虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于XhoI和PstI酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割，B错误； C、由图可知，载体P是中间质粒，不含有有表达目的基因的启动子和终止子，不能表达，C正确； D、受体细胞表现出抗性基因的相应性状，可能是导入了重组质粒，也可能只导入了空质粒（不含目的基因的质粒），D正确。 故选B。 【变式3-2】 水稻易被某种真菌感染导致生长不良，有研究发现花生细胞的S基因在抗真菌类病害中发挥着重要作用，这为水稻的改良提供了新的思路。以下叙述正确的是（    ） A．该种真菌只能发生基因突变和基因重组两种变异 B．利用基因工程改良水稻可产生抗真菌的水稻新物种 C．该种真菌对花生的持续感染导致其产生了S基因 D．将S基因导入水稻使其获得抗病能力属于基因重组 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】A、该种真菌属于真核生物，含有染色体，所以能发生的变异有基因突变、基因重组和染色体变异，A错误； B、可以利用基因工程培育具有新性状的生物类型，但不能培育新物种，B错误； C、变异是不定向的，真菌的持续感染对花生的抗性起到选择作用，不是导致产生了S基因，C错误； D、利用基因工程技术将S基因的重组DNA导入水稻细胞，经组织培养获得抗病植株，属于基因工程、原理是基因重组，D正确。 故选D。 【变式3-3】 我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因（idgS）及其激活基因（sfp）构建基因表达载体（如图），通过农杆菌转化法导入白玫瑰细胞中，获得蓝玫瑰。下列叙述错误的是（　　） A．表达载体中sfp和idgS具有各自的启动子，表达相互独立 B．可利用DNA分子杂交技术从链霉菌的基因文库中获取sfp和idgS C．将sfp插入Ti质粒时不能同时使用限制酶PmeⅠ和BamHⅠ D．若受体白玫瑰不变蓝，则可说明sfp和idgS未成功导入 【答案】D 【分析】分析题图可知，靛蓝合成酶基因（idgS）及其激活基因（sfp）被插入到质粒的不同位置。 【详解】A、分析题图可知，表达载体中sfp的启动子为启动子1，idgS的启动子为启动子2，两者表达相互独立，A正确； B、获取目的基因的方法有利用DNA杂交技术从链霉菌的基因文库中获取sfp和idgS，B正确； C、分析题图可知，同时使用限制酶PmeⅠ和BamHⅠ时会将sfp的终止子切除，因此将sfp插入Ti质粒时只能使用限制酶BamHⅠ，C正确； D、若受体白玫瑰细胞不变蓝，可能sfp和idgS未成功导入或表达不成功，D错误。 故选D。 【变式3-4】 根癌农杆菌侵染植物细胞时，其Ti质粒上的T-DNA片段能转入植物的基因组中，因此可利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因操作。下列相关叙述正确的是（　　） A．目的基因应插入T-DNA片段外，以防止破坏T-DNA B．用Ca2+处理农杆菌，以利于其感染植物细胞 C．Ti质粒是一种环状DNA分子，属于细菌的拟核DNA D．T-DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物染色体DNA中 【答案】D 【分析】农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。 【详解】A、在农杆菌转化法中，需要将目的基因插入T-DNA片段中，A错误； B、在农杆菌转化法中，用Ca2+处理农杆菌，以利于重组Ti质粒导入农杆菌，B错误； C、Ti质粒是一种存在于细菌拟核DNA之外的环状DNA，C错误； D、T-DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物染色体DNA中，D正确。 故选D。 【题型4 目的基因的检测与鉴定】 【紧扣教材】 目的基因的检测与鉴定 1.分子水平的检测: 检测对象 方法 染色体DNA上是否插入目的基因 PCR等技术 受体细胞是否转录出mRNA PCR等技术 目的基因是否翻译出蛋白质 抗原-抗体杂交 2.个体水平鉴定: (1)方法:培育导入了特定目的基因的生物体,并观察其是否表达出所需的性状。 (2)实例:通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。 【题型突破】 【例4】 医生可利用分子生物学技术检测受检人是否携带HIV。下列叙述错误的是（    ） A．可根据HIV的RNA序列合成小段DNA作为引物 B．血液样品中HIV的RNA经逆转录后进行PCR检测 C．与检测抗原、核酸相比，检测抗体能更早诊断HIV感染 D．可通过抗原—抗体杂交技术检测血液样品中HIV抗原 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法;将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4)目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、引物要能和HIV逆转录形成的DNA序列进行碱基互补配，因此可以可根据HIV的RNA序列合成小段DNA作为引物，A正确； B、采用DNA分子杂交技术检测是否携带HIV时，应将血液样品中HIV的RNA逆转录后进行PCR检测，即用HIV的RNA序列合成小段DNA作为探针，进行PCR，如果存在HIV，则会出现杂交带；如果没有HIV，则不会出现杂交带，B正确； C、HIV进入人体后，免疫系统要经过一定的生理过程才会产生特异性的抗体，需要耗费一定的时间，因此，检测抗体诊断HIV感染比检测抗原、核酸更晚，C错误； D、HIV进入人体后，免疫系统会产生特异性的抗体，而HIV抗原和抗体可以特异性识别，因此可通过抗原-抗体杂交技术检测血液样品中HIV抗原，D正确。 故选C。 【变式4-1】 SRY基因是哺乳动物Y染色体上具有决定雄性性别作用的基因片段，常用作对移植前的胚胎进行性别鉴定，其过程如下：先从被测胚胎细胞中提取DNA片段，然后设计特异性引物并用胚胎细胞中的DNA为模板进行PCR扩增，最后用特异性探针(是一段带有检测标记，能与目的基因互补的核苷酸序列)对扩增产物进行检测，该鉴定方法被称为SRY-PCR法。下列对该方法的分析，错误的是(　　) A．设计特异性引物和探针时需要用到SRY基因的核苷酸序列 B．扩增SRY基因时，当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链 C．当温度下降到72℃左右时，两种特异性引物会与互补的DNA链结合 D．用特异性探针对扩增产物进行检测时，若结果呈阳性，则检测个体为雄性 【答案】C 【分析】由题干信息分析可知，用SRYA特异性探针对扩增产物进行检测，若形成杂交带，则说明其含有SRY基因（位于Y染色体上的性别决定基因），则胚胎的性别为雄性，若出现阴性反应，没有出现杂交带，则胚胎为雌性。 【详解】A、SRY基因是哺乳动物Y染色体上具有决定雄性性别作用的基因片段，因此设计特异性引物和探针时需要用到SRY基因的核苷酸序列，A正确； B、扩增SRY基因时，当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，B正确； C、当温度下降到50℃左右时，两种特异性引物通过碱基互补配对会与两条单链的DNA链结合，C错误； D、用SRY特异性探针对扩增产物进行检测，若形成杂交带，即呈阳性，则说明其含有SRY基因，则胚胎的性别为雄性，D正确。 故选C。 【变式4-2】 斑点印迹杂交是一种核酸分子杂交技术，其技术流程如图所示。在食品卫生检测和环境监测等领域，利用斑点印迹杂交技术可快速检测出样品中存在的致病微生物或污染微生物。下列相关分析不合理的是（    ）    A．斑点印迹杂交技术可用于受体菌细胞中转基因转录量的检测 B．斑点印迹杂交技术可用于已知遗传病致病基因的点突变的检测 C．p和q片段能够杂交的主要原因是两条链的碱基可以互补配对 D．标记的探针中碱基序列的长度越短，则检测的精确度会越高 【答案】D 【分析】目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测；①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】AB、斑点印迹杂交是一种核酸分子杂交技术，该技术遵循的原理是碱基互补配对，可用于受体菌细胞中转基因转录量（DNA与RNA的碱基配对）的检测，也可用于已知遗传病致病基因的点突变（DNA与DNA碱基互补配对）的检测，AB正确； C、结合图示可知，p和q片段能够杂交的主要原因是两条链的碱基可以互补配对，从而形成杂交带，C正确； D、探针中碱基序列的长度会影响检测的灵敏度。一般来说，探针中碱基序列的长度适中(通常为 100~1000bp)有利于提高杂交效率和检测的灵敏度。探针中碱基序列的长度越短，则检测的精确度会越低，D错误。 故选D。 【变式4-3】 Hv-Lv肽链是抗体与抗原识别并结合的关键结构。为筛选特异性高、结合能力强的Hv-Lv肽链，将编码Hv-Lv肽链的DNA片段与丝状噬菌体固有外壳蛋白pⅧ的基因连接并一起表达，最后用固定化抗原筛选（过程如图）。 下列说法错误的是（    ） A．Hv-LvDNA片段上游需要设计并连接启动子 B．Hv-LvDNA片段上无需连接标记基因 C．目标是获得能耐受多次冲洗的噬菌体 D．实验过程须严格遵循生物防护措施 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别 与结合的位点 ，可用于驱动基因的转录，故Hv-LvDNA片段上游需要设计并连接启动子，A正确； B、Hv-Lv肽链是抗体与抗原识别并结合的关键结构，而Hv-LvDNA可表达出Hv-Lv肽链，该技术中Hv-LvDNA属于目的基因，无需连接标记基因，B正确； C、结合题意可知，该过程目的是筛选特异性高、结合能力强的Hv-Lv肽链，C错误； D、实验过程须严格遵循生物防护措施，尽可能避免可能会带来的安全问题，D正确。 故选C。 【变式4-4】 下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达（　　） A．在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因 B．通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因 C．提取受体细胞合成的相应蛋白质，利用抗原—抗体杂交技术进行检测 D．抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性 【答案】A 【分析】目的基因的检测与鉴定： 1、分子水平上的检测： ①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—PCR技术 ，②检测目的基因是否转录出了mRNA—PCR技术 ，③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。 2、个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。（例：用虫食用棉花，观察其存活情况，来鉴定棉花是否具有抗虫特性）。 【详解】A、在显微镜下无法观察到基因，因此该方法不能用于检测目的基因是否成功导入，A正确； B、通过PCR等技术检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA，B错误； C、利用抗原-抗体杂交技术可以检测目的基因是否翻译成蛋白质，C错误； D、转基因植物是否具有抗虫特性，是通过检测植物细胞中是否产生毒蛋白或从个体水平上检测转基因植物是否能抗虫来确定的，D错误。 故选A。 一、单选题 1．据研究，W基因在植物发育和逆境应答过程中发挥重要作用。研究人员将W基因的启动子（PW）与GUS基因相连，构建拟南芥PW-GUS融合植株（GUS为报告基因，其表达产物可催化无色底物变蓝），用无色底物处理拟南芥幼苗的根，探究W基因在拟南芥缺铁胁迫中的表达水平，下列叙述错误的是（　　） A．扩增W基因启动子需2种引物，并在引物3'端加入酶切位点 B．PW和GUS基因进行双酶切后，可通过T4 DNA连接酶连接 C．培养拟南芥无菌苗的MS固体培养基需要用高压蒸汽灭菌法灭菌 D．通过观察根蓝色深浅确认W基因在拟南芥缺铁胁迫中的表达水平 【答案】A 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、扩增W基因启动子需2种引物，并在引物5'端加入酶切位点，因为子链的延伸是在引物的3＇开始的，A错误； B、PW和GUS基因进行双酶切后，可通过T4 DNA连接酶连接，因为该连接酶可以连接平末端，也可连接黏性末端，B正确； C、为了避免杂菌污染，培养拟南芥无菌苗的MS固体培养基需要用高压蒸汽灭菌法灭菌，C正确； D、题意显示，GUS为报告基因，其表达产物可催化无色底物变蓝，因而可通过观察根蓝色深浅确认W基因在拟南芥缺铁胁迫中的表达水平，D正确。 故选A。 2．科研人员在研究水稻矮秆的控制基因的过程中，发现矮秆突变型的基因r比野生型基因R多了一个酶切位点，如图所示。利用矮秆突变型水稻与野生型高秆水稻杂交得到的全为中间类型，自交得到的中野生型：突变型：中间类型=1:1:2，下列分析正确的是（    ） A．根据杂交结果判断水稻茎秆高低的遗传不符合基因的分离定律 B．用PCR技术克隆R、r基因需要设计两组不同的特异性引物 C．所有个体自由交配，其子代野生型：突变型=3:1 D．的中间类型通过PCR、酶切、琼脂糖凝胶电泳等技术可得到3条条带 【答案】D 【分析】本题通过水稻突变体矮秆基因和野生型高秆基因的碱基序列变化为背景，考查了基因的分离定律的性状分离比特点、PCR技术引物的作用、酶切等必备知识。分离定律：在生物的体细胞中，控制同一性状的遗传因 子成对存在，不相融合；在形成配子时，成对的遗传因子 发生分离，分离后的遗传因子分别进入不同的配子中，随配子遗传给后代。 【详解】A、根据的性状分离比可知，表型的比例与基因型比例相同，符合基因的分离定律，A错误； B、由图可知，r基因与R基因的区别是碱基对的替换，其他地方没有变化的信息，所以用相同的特异性引物能克隆出来，B错误； C、产生的配子R：r=1:1，则所有个体自由交配，产的子代中野生型：突变型=1:1，C错误； D、中的中间类型基因型为Rr，r比R多了一个酶切位点，所以经PCR、酶切、电泳后能跑出3条条带，D正确。 故选D。 3．PCR反应一般需要加入2种引物，引物设计是目的基因特异性扩增的关键。下列不属于引物设计要求的是 A．能够与两条模板链结合 B．2种引物之间能碱基互补配对 C．一段单链核酸 D．引物长度要合适 【答案】B 【分析】PCR扩增目的基因的前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物，引物能与DNA上特定序列结合，以保证扩增特定DNA片段。 【详解】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，但2种引物之间不能碱基互补配对，否则PCR的效率会很低，ACD正确，B错误。 故选B。 4．下列有关基因工程及其应用叙述，错误的有（　　） ①限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶 ②DNA聚合酶和DNA连接酶都能催化磷酸二酯键的形成 ③利用PCR扩增目的基因时，要用2种不同但能够互补配对的引物 ④在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小有关 ⑤标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞 A．一项 B．二项 C．三项 D．四项 【答案】C 【分析】基因工程的工具： （1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 （2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 （3）运载体：常用的运载体有质粒（质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外并具有自我复制能力的双链环状DNA分子）、噬菌体的衍生物、动植物病毒。 【详解】①限制性内切核酸酶、DNA连接酶是基因工程中常用的工具酶，质粒不是酶，①错误； ②DNA聚合酶和DNA连接酶都能催化磷酸二酯键的形成，②正确； ③利用PCR扩增目的基因时，要用2种与目的基因3'端互补配对的引物，两引物不能互补配对，③错误； ④在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，④错误； ⑤标记基因的作用是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，⑤正确； 因此错误的是①③④，即错误的有三项。 故选C。 5．在存在的条件下，DNA聚合酶可被激活。下列相关说法正确的是（    ） A．细菌细胞的DNA聚合酶发挥作用不需要 B．PCR技术中的DNA聚合酶在90℃条件下不会失活 C．DNA聚合酶需先与启动子结合，继而从引物的5'端延伸子链 D．真核细胞内的DNA聚合酶均属于在细胞核内发挥作用的亲核蛋白 【答案】B 【分析】PCR技术的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；PCR的操作过程： ①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）； ②低温复性：引物结合到互补链DNA上； ③中温延伸：合成子链。 【详解】A、细菌细胞的DNA聚合酶发挥作用也需要Mg2+，A错误； B、耐高温的DNA聚合酶在90℃条件下不会失活，B正确； C、启动子是转录开始的信号，DNA聚合酶不与启动子结合，C错误； D、线粒体叶绿体中也存在DNA，因此真核细胞内的DNA聚合酶也可以在细胞质发挥作用，D错误。 故选B。 6．将群体感应基因与裂解基因导入益生菌中，益生菌裂解时释放的抗肿瘤药物可使肿瘤消融。群体感应基因用于感知细菌群体的数量，细菌数量较少时进行繁殖，当细菌数量达到感应阈值时会启动裂解基因表达。下列叙述错误的是（　　） A．获得具有肿瘤治疗作用益生菌的关键步骤是构建基因表达载体 B．益生菌释放的抗肿瘤药物能够识别肿瘤，达到治病的作用 C．患者体内的益生菌数量呈现规律性变化是因为群体感应基因和裂解基因的存在 D．利用益生菌消除肿瘤的过程中，肿瘤细胞的死亡属于细胞凋亡 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、获得具有肿瘤治疗作用益生菌的关键步骤是基因表达载体的构建，该步骤是基因工程的核心，A正确； B、益生菌裂解时会释放抗肿瘤药物，使肿瘤消融，因此能识别肿瘤，达到治病的作用，B正确； C、题意显示，群体感应基因可使患者体内带有肿瘤药物基因的益生菌在数量较少时进行繁殖，当益生菌数量达到一定数量后裂解，会使益生菌数量呈现规律性变化，即患者体内的益生菌数量呈现规律性变化是因为群体感应基因和裂解基因的存在，C正确； D、将群体感应基因与裂解基因导入益生菌中，益生菌裂解时释放的抗肿瘤药物可使肿瘤消融，利用益生菌消除肿瘤的过程中，肿瘤细胞的死亡属于细胞坏死，D错误。 故选D。 7．Cre-Loxp系统是基因工程中常用的特异性重组酶系统，该系统中的Cre酶能根据两个Loxp的方向删除或倒置位于两个Loxp序列间的基因，如图1所示。现使用Cre-Loxp系统构建TK基因缺失的病毒毒株，为研发该病毒的疫苗提供候选毒株，构建过程如图2所示，下列分析错误的是（    ） A．图1中Gene两端需含有两个相同的碱基序列 B．位于RFP基因两端的Loxp序列方向相反 C．Cre酶处理之前，应初步筛选出有红色荧光基因的病毒 D．Cre酶在图2过程中的具有限制酶和DNA连接酶的功能 【答案】B 【分析】Cre-Loxp系统是基因工程中常用的特异性重组酶系统，该系统中的Cre酶能根据两个Loxp的方向删除或倒置位于两个Loxp序列间的基因，结合图1，说明GENE两端需含有两个相同的碱基序列，以便Cre酶进行识别。 【详解】A、由图1判断Cre酶删除或倒置位于两个Loxp序列间的基因时，需识别相应的序列，所以GENE两端需含有两个相同的碱基序列，A正确； B、要通过Cre酶删除RFP基因，根据图1可知，RFP基因两端的Loxp序列方向应该相同，B错误； C、RFP基因可表达出红色荧光蛋白，根据红色荧光蛋白表达情况可筛选出TK基因被替换为红色荧光基因的病毒，C正确； D、限制酶能对DNA特定位点进行切割，DNA连接酶能连接黏性末端和平末端，Cre酶在处理重组基因片段时具有限制酶和DNA连接酶的功能，D正确。 故选B。 8．不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列有关叙述错误的是（    ） A．限制性引物和非限制性引物均可与模板DNA单链结合 B．不对称PCR循环6次需要消耗（26-1）a个限制性引物 C．最后获得的ssDNA中不含非限制性引物 D．子链的延伸都是从两种引物的3'端开始的 【答案】C 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】A、据图可知，限制性引物和非限制性引物均可与模板DNA单链结合，A正确； B、PCR扩增时引物是新子链的一部分，假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后产生26个DNA分子，因此该不对称PCR过程中需要（26-1）·a个限制性引物，B正确； C、据图可知，除模板链外，最终获得的ssDNA都是以乙链为模板合成的，因此，除模板链外，最终获得的ssDNA中都有非限制性引物，C错误； D、PCR技术的原理是DNA的半保留复制，DNA复制过程中，子链的延伸都是从引物的3'端开始的，D正确。 故选C。 9．利用pBR322质粒将人胰岛素基因导入大肠杆菌（如图1）可进行工业化生产。为检验基因表达载体是否成功导入，将处理后的大肠杆菌接种在培养基上，长出的四个菌落用无菌纸分别盖印至四种不同的培养基上（如图2，菌落相对位置不变），菌落生长状况如图所示，则成功导入基因表达载体的菌落是（    ） A．菌落1、2、3 B．菌落2、3 C．菌落1 D．菌落4 【答案】B 【分析】基因表达载体的构建基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选，是基因工程的核心步骤。 【详解】从图1看出，胰岛素基因和pBR322质粒都用了限制酶BamHⅠ进行切割，而质粒上的BamHⅠ切割位点在抗四环素基因的位置，因此基因表达载体不抗四环素，但由于含有抗氨苄青霉素基因，所以该导入成功的细菌可以抗氨苄青霉素，即菌落不能在含有四环素的培养基上生长，但能够在含有青霉素的培养基上生长；从图2看出，菌落2和菌落3在含有氨苄青霉素的培养基上生长，但不能在含有四环素的培养基上生长，因此菌落2、3 是成功导入基因表达载体的菌落，B正确，ACD错误。 故选B。 10．穿梭质粒携带棉花的偏好启动子p35s转入农杆菌，可提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。下列叙述错误的是（    ） 注：F1—F3，R1—R3表示引物；T—DNA—LB表示左边界；T—DNA—RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 A．获取目的基因的方法有PCR技术扩增和人工合成 B．RNA聚合酶与穿梭质粒中的启动子p35s识别并结合，驱动目的基因转录 C．含卡那霉素的培养基可初步筛选转化的棉花愈伤组织 D．以棉花DNA作模板，选用引物F3和R2进行PCR检测棉花植株是否导入目的基因 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、获取目的基因的方法有PCR技术扩增和人工合成（题中获取Bt基因的方法有PCR技术扩增，1—1365序列为人工合成，再与切割下来的1363—1848段序列拼接成重组DNA导入质粒），A正确； B、穿梭质粒中pass为启动子，启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；图中插入两个p35s启动子，其目的是保证目的基因的转录，提高（改造抗虫蛋白的）翻译效率，B正确； C、结合基因表达载体的示意图可知，图中穿梭质粒上有KanR和HygBR两个标记基因的位置，HygBR位于T—DNA上，用HygBR基因对应的抗生素，即潮霉素B初步筛选转化的棉花愈伤组织，C错误； D、为检测棉花植株是否导入目的基因，拼接重组的DNA片段是由人工合成的1—1362基因序列和1363—1848基因序列组成，引物应在目的基因的两端，因此提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2，D正确。 故选C。 二、多选题 11．斑点印迹杂交是一种核酸分子杂交技术，其技术流程如图所示。在食品卫生检测和环境监测等领域，利用斑点印迹杂交技术可快速检测出样品中存在的致病微生物或污染微生物。下列相关分析合理的是（    ） A．斑点印迹杂交技术可用于受体菌细胞中转基因转录量的检测 B．斑点印迹杂交技术可用于已知遗传病致病基因的突变的检测 C．p和q片段能够杂交的主要原因是两条链的碱基可以互补配对 D．标记的探针中碱基序列的长度越短，则检测的精确度会越高 【答案】ABC 【分析】DNA分子杂交技术的原理是碱基互补配对，可以用来检测是否含有目的基因。 【详解】A、根据题意信息可知，斑点印迹杂交是一种核酸分子杂交技术，可用于受体菌细胞中转基因转录量的检测，A正确； B、斑点印迹杂交技术是将目的基因片段用放射性同位素进行标记，与受体细胞的基因组DNA进行杂交，如果目的基因整合到受体细胞上，那么标记基因就会与其结合，通过放射性自显影就可以显示出原培养皿中含目的基因的菌落位置，可用于已知遗传病致病基因的突变的检测，B正确； C、根据图示信息可知，p和q片段能够杂交的主要原因是两单链的碱基互补配对，C正确； D、根据图示信息可知，斑点印迹杂交是利用两单链的碱基互补配对，因此标记的探针中碱基序列的长度越长，则检测的精确度会越高，D错误。 故选ABC。 12．遗传性耳聋有很强的遗传异质性，即不同位点的耳聋致病基因可导致相同表型的听觉功能障碍，而同一个基因的不同突变可以引起不同临床表现的耳聋。科研人员确定了一种与耳聋相关的基因，并对其进行测序，结果如图所示。有关分析错误的是（    ）    A．造成相同表型听觉功能障碍的致病基因不一定相同 B．图中的基因序列作为模板链，指导合成相应的mRNA C．通常借助于“PCR+琼脂糖凝胶电泳”的方法对基因进行测序 D．同一个基因可突变出不同基因，体现了基因突变具有随机性 【答案】BCD 【分析】图示分析：突变的基因C是由正常基因C发生碱基对的替换（G—C碱基对替换为A—T碱基对）所致。由基因序列、氨基酸序列及氨基酸对应密码子可知，正常基因C转录形成的mRNA序列为…AUGGUCUCACUGCAACCG……，突变的基因C转录形成的mRNA序列为……AUGGUCUCACUGUAACCG……，因此，图示基因序列应为编码链（模板链的互补链），突变的基因C编码的mRNA中终止密码子提前出现。 【详解】A、由题意可知，遗传性耳聋具有很强的遗传异质性，即不同位点的耳聋致病基因可导致相同表现型的听觉功能障碍，而同一个基因的不同突变可以引起不同临床表现的耳聋，因此造成相同表现型听觉功能障碍的致病基因一般不同，A正确； B、根据Met氨基酸对应的密码子是AUG，可知图中的基因序列作为编码链，与其互补的另一条链是模板链，B错误； C、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳的方法只能测定长度，测序需要其他的仪器才能检测，C错误； D、同一个基因可突变出不同基因，体现了基因突变具有不定向性，D错误。 故选BCD。 13．荧光定量PCR技术：在PCR反应体系中加入特异性的荧光探针，开始时探针完整地结合在DNA任意一条单链上，扩增时每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，对扩增反应中的荧光强度进行实时检测后，可通过标准曲线定量计算出初始模板量。某荧光定量PCR的标准曲线如图所示。下列说法正确的是（　　） A．该实验需要DNA聚合酶的参与 B．实验后期荧光强度不再变化的原因可能是荧光探针或原料等耗尽 C．样品甲的初始模板量小于样品乙的 D．每个反应管内加入的荧光探针和原料的量均应该相同 【答案】ABD 【分析】PCR的原理是DNA双链复制，步骤包括高温变性、复性、延伸，该过程需要耐高温的DNA聚合酶催化，需要四种游离的脱氧核苷酸做原料。 【详解】A、荧光定量PCR是一种利用DNA半保留复制原理的技术，故该实验需要DNA聚合酶的参与，A正确； B、实验后期荧光强度不再变化的原因可能是荧光探针或原料等耗尽，若是荧光探针耗尽，PCR反应仍进行，若是原料耗尽，则PCR反应停止，两者都会造成实验后期荧光强度不再变化，B正确； C、一定范围内，循环数相同的情况下，样品甲产生的荧光强度大于样品乙的，故样品甲的初始模板量大于样品乙的，C错误； D、最终各反应管的荧光强度一样，说明每个反应管内加入的荧光探针和原料的量均应该相同，D正确。 故选ABD。 14．如图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程。①~④表示相关的操作，EcoRⅠ、BamHⅠ为限制酶，它们的识别序列及切割位点如表所示。下列说法正确的是（　　） A．过程①依据的原理是DNA的半保留复制 B．在过程③中T-DNA可整合到受体细胞的染色体DNA上 C．为方便后续的剪切和连接，可在两种引物的一端分别加上GAATTC和GGATCC序列 D．过程④中，科研人员最终未能检测到干扰素基因，其原因可能是干扰素基因未能成功导入人参愈伤组织细胞中 【答案】ACD 【分析】分析图解：图中过程①表示利用PCR技术扩增目的基因，过程②表示基因表达载体的构建，过程③表示将重组质粒导入根瘤农杆菌，过程④表示目的基因的检测和鉴定。 【详解】A、过程①中，PCR技术依据的原理是DNA的半保留复制，A正确； B、过程③表示将重组质粒导入根瘤农杆菌，而根瘤农杆菌在侵染人参愈伤组织细胞时，T-DNA才整合到受体细胞染色体DNA上，B错误； C、利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是干扰素基因两端的部分核苷酸序列，由于获得目的基因时需要用到EcoRⅠ、BamHⅠ两种限制酶，因此可在两种引物的一端分别加上GAATTC和GGATCC序列，以便于后续的剪切和连接，C正确； D、科研人员最终未能检测到干扰素基因，其原因可能是干扰素基因未能成功导入人参愈伤组织细胞中，D正确。 故选ACD。 15．某科研小组利用PCR定点突变技术培育抗冻番茄新品种。设计含有非特异性碱基配对的引物，将突变位点引入编码抗冻蛋白的基因中，获得抗冻能力更强的突变基因。下列叙述正确的是（　　）    A．过程②还需要四种脱氧核苷酸和耐高温的DNA连接酶 B．过程③至少需要进行2次循环才能得到两条链等长的DNA分子 C．过程④获得的2种杂交DNA中只有一种经过程⑤能获得目的基因 D．常采用显微注射法将获得的目的基因导入番茄细胞培育抗冻新品种 【答案】BC 【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。原理：DNA复制。 前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。 过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双 链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【详解】A、PCR过程需要的是四种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶，A错误； B、过程③扩增一次得到的是长链和短链，第二次扩增才能得到两条等长的短链，B正确； C、根据引物的延伸方向是5＇→3＇方向，且过程④是利用已有的模板作引物，因此过程④获得的2种杂交DNA中只有一种经过程⑤能获得目的基因，C正确； D、将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，而将目的基因导入植物细胞采用农杆菌转化法或花粉管通道法，D错误。 故选BC。 三、非选择题 16．科研人员利用图1所示材料构建重组质粒并导入大肠杆菌，以期获得能监测生物组织或环境中四环素水平的“报警器”。限制酶识别序列及切割位点如下表。TetR基因是一种转录调节基因，GFp基因为绿色荧光蛋白基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，ori为复制原点。请回答下列问题： 限制酶 EcoRⅠ XbaⅠ SpeⅠ BamHⅠ 识别序列及切割位点 (1)使用工具酶拼接DNA片段1和2，拼接后的片段连接处部分序列为5＇ 3＇（写出6个碱基），TetR基因和GFP基因转录的模板链 （“是”或“不是”）该拼接DNM的同一条链。 (2)构建重组质粒时，选择 对质粒和拼接的DNA片段进行酶切，在DNA连接酶的作用下恢复 键。再根据 的结果判断重组质粒的大小是否符合预期。 (3)将重组质粒导入经 理的大肠杆菌后，在含 的固体培养基中筛选出工程菌。 (4)工程菌监测四环素的原理如图2，当环境中含四环素时，该大肠杆菌工程菌 （能/不能）发出荧光，其原因是 。 【答案】(1) TCTAGT或ACTAGA 不是 (2) BamHⅠ，EcoRⅠ 磷酸二酯键 琼脂糖凝胶电泳 (3) CaCl2 氨苄青霉素 (4) 能 当环境中含四环素时，抑制TctR蛋白作用增强，解除TctR蛋白对启动子2的抑制作用，使GFP基因能表达出绿色荧光蛋白（GFP蛋白）而发光 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）据图1分析可知，DNA片段1两端的限制酶识别序列分别是Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ，而DNA片段2两端的限制酶识别序列是Spe Ⅰ和BamH Ⅰ，若要让两个DNA片段连接在一起，需要经酶切后获得相同的黏性末端。据表格分析，XbaⅠ和SpeⅠ酶切能获得相同的黏性末端，因此DNA片段1用XbaⅠ酶切，DNA片段2用SpeⅠ酶切，然后在用DNA连接酶将两个DNA片段连接在一起，由于无法得知DNA片段两条链具体的方向，所以在特定工具酶作用下能成功拼接的位点处碱基序列为5’-TCTAGT-3’或5’-ACTAGA-3’；DNA片段1和DNA片段2连接后，两个片段启动子方向相反，故TetR基因和GFP基因转录的模板链不是该拼接DNA的同一条链。 （2）据图可知，重组质粒含有3种酶的酶切位点，且使用工具酶拼接DNA片段1和2后两端的酶是BamHⅠ，EcoRI，故构建重组质粒时，选择BamHⅠ，EcoRⅠ对质粒和拼接的DNA片段进行酶切；在DNA连接酶的作用下恢复磷酸二酯键；琼脂糖凝胶电泳可以将不同大小的DNA片段分离开，故根据琼脂糖凝胶电泳的结果判断重组质粒的大小是否符合预期。 （3）钙离子能促进细菌摄 取外源的 DNA，科学家常使用 CaCl2溶液制备感受态细胞，使其处于感受态；图示重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因，故将重组质粒导入经CaCl2处理的大肠杆菌后，在含氨苄青霉素的固体培养基中筛选出工程菌。 （4）分析题图可知，当环境中含四环素时，抑制TetR蛋白作用增强，解除TetR蛋白对启动子2的抑制作用，使GFP基因能表达出绿色荧光蛋白（GFP蛋白）而发光，因此当环境中含四环素时，该大肠杆菌工程菌能发出绿色荧光。 2 学科网（北京）股份有限公司 $$