备课素材：凝胶电泳影响迁移率因素-2024——2025学年度第一学期高中生物学选择性必修三

凝胶电泳影响迁移率因素 2020版高中生物学选择性必修三说，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关： 但没有详细阐述其原理。那么，如何理解影响迁移率的3个因素？ 核酸电泳技术始于20世纪60年代初，最初使用密度梯度离心法进行分离，但该方法耗时且需要重型设备。随着电泳技术的发展，研究人员开始探索使用凝胶基质作为分离介质，特别是琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶的应用，极大地提高了分离效率和简便性。核酸凝胶电泳广泛应用于分子生物学研究中，主要用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段。该方法具有操作简便、分辨率高和通用性强等优点，适用于从几分钟到数小时内的快速分离和分析。 1.核酸凝胶电泳的基本步骤 ‌制备凝胶‌：选择合适的凝胶介质（如琼脂糖或聚丙烯酰胺），根据需要制备不同浓度的凝胶。 ‌电泳‌：将样品加入凝胶后，在恒定的电场中进行电泳，核酸分子根据其大小和电荷特性迁移到不同的位置。 ‌染色和检测‌：使用荧光染料（如溴化乙锭）对核酸进行染色，然后在紫外灯下检测核酸片段的位置和大小。 2.核酸凝胶电泳的原理‌ 核酸凝胶电泳的原理‌是基于核酸分子在电场中的迁移特性，利用其电荷、大小和构象的差异进行分离。核酸分子在碱性溶液中带负电荷，因此在电场作用下，核酸从负极（阴极）向正极（阳极）迁移。核酸的迁移率主要取决于其大小，较短的片段比长片段移动得更快，从而实现基于尺寸的分离。由于DNA分子本身没有颜色，需要将电泳结果用核酸染料处理后放在紫外线投射仪等特定仪器下才能观察到。溴化乙锭（EB）能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间形成EB-DNA复合物，并在紫外光照下发出荧光，所以，常在琼脂糖凝胶冷却凝固前，加入适量溴化乙锭，电泳完毕后将凝胶放置在300nm波长的紫外线下，可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中的DNA条带。 3.影响迁移率的3因素 为什么核酸的迁移率主要取决于其大小？ 当凝胶浓度相同时，较大的DNA分子因体积大，所占据的空间大，在穿过凝胶孔隙时会遇到较大的阻力，穿过孔隙相对困难，迁移速率低。相同大小的DNA分子则会聚集在凝胶同一特定的位置上。根据这一特性，可以把不同大小的DNA分子分离开来。DNA分子的大小在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 为什么核酸的迁移率与核酸分子的构象有关？ DNA分子在电场中的迁移速度不仅和分子量有关，还和它本身的构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中的移动速度不一样，移动速度次序为：超螺旋分子DNA>线性DNA>开环DNA。当琼脂糖浓度太大时，环状的DNA一般不能进入胶内（停留在孔中）。 为什么核酸的迁移率与琼脂糖的浓度有关？什么时候用聚丙烯酰胺凝胶？ 同样的线状DNA分子在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移速度不同，DNA电泳迁移率的对数和琼脂糖凝胶浓度呈线性关系，凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力就随之减弱。 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50kb，而要分辨较小相对分子质量的DNA片段，则要用聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1-1000bp。 最后需要说明的是，用普通琼脂糖凝胶电泳很难分离大于50kb的DNA分子，为了进行超大片段DNA研究，科学家发明了脉冲电场凝胶电泳（PFGE）技术，用于分离超大相对分子质量DNA。 例、关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物的实验，下列叙述正确的是(      ) A.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示 DNA分子的具体位置 B. 在同一电场作用下，DNA 片段越长，向负极迁移速率越快 C. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离 DNA 片段的大小 D. 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 解析：凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子, 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，A错误；在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时,DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，B错误；琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，C正确；琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。故答案为C。 学科网（北京）股份有限公司 $$