第3章 基因工程【速记清单】-2024-2025学年高二生物单元速记·巧练（人教版2019选择性必修3）

第3章 基因工程 内容导航 01 思维导图 知识串联重难点1基因工程的基本工具、DNA 的粗提取与鉴定 重难点2 PCR扩增的原理及过程、基因工程的操作程序 重难点3基因工程的应用 重难点4蛋白质工程的基本思路 02 考点速记 核心必记 03 重难专攻 素养提升 04 教考衔接 科学练题 （详图见附件PDF）01 思维导图 02 考点速记 第1节 DNA重组技术的基本工具 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 1.来源：切割DNA的工具是 ，又称限制酶。这类酶主要是从 中分离纯化出来的。 2.作用：限制酶能够识别 DNA分子的 ，并且使每一条链中 的两个核苷酸之间的 断开。 3.结果：DNA分子经限制酶切割产生 ，它们的末端通常有两种形式— 。 二、DNA连接酶——“分子缝合针” 1.作用：将限制酶切割下来的DNA片段 ，恢复被限制酶切开的 。 2.类型：在基因工程操作中，常用的DNA连接酶主要有两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为 连接酶；另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为 连接酶。前者只能将具有 的DNA片段连接起来，不能连接具有 的DNA片段。后者既可以“缝合”双链DNA片段 ，又可以“缝合”双链DNA片段的 ，但连接 的效率相对较低。 三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 1.作用： 。 2.类型：在基因工程中通常是利用 作为载体,还有 等。它们的来源不同，在 以及可以插入外源DNA片段的 上也有很大差别。 四、DNA的粗提取与鉴定 1.实验原理 （1）提取DNA的原理： 等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的 方法对它们进行提取。例如，利用 这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质；DNA在 ，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。 （2）鉴定DNA的原理：在一定温度下，DNA遇 试剂会呈现 色，因此 试剂可以作为鉴定DNA的试剂。 2.方法步骤 （1）称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液， 。 （2）去除滤液中的杂质。方案一：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在 ℃冰箱中放置几分钟后，再取 ；方案二：直接将研磨液倒入 中，在1500r/min的转速下离心5min，再取 。 （3）DNA的析出：方案一：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是 ；用玻璃棒 ，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的 ；方案二：将溶液倒入 中，在10000r/min的转速下离心5min，弃 ，将 晾干。 （4）DNA的鉴定：取两支20mL的试管，各加入 的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶解于其中一支试管的NaCl溶液中，再向两支试管中加入4mL的 试剂。混合均匀后，将试管置于 中加热5min，待试管 后，比较两支试管中 。 3.结果分析与评价：观察提取的DNA的 ，如果不是白色状物，说明 。二苯胺试剂鉴定呈现 ，说明实验基本成功；如果不呈现 ，可能原因有所提取的DNA ，或者在实验操作过程中 等。 第2节 基因工程的基本操作程序 一、目的筛选与获取 1.目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于 的基因就是目的基因。根据不同的需要，目的基因是 的，它主要是指 的基因,如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 2.筛选合适的目的基因：从 的基因中进行筛选是筛选合适的目的基因较为有效的方法之一。 技术的发展，以及 等的应用，为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 3．获取目的基因的方法：① 目的基因。例如，我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家 了目的基因。②常用 特异性地快速扩增目的基因。③通过构建 来获取目的基因。 4.利用PCR获取和扩增目的基因 (1)含义：PCR是 的缩写。它是一项在体外提供参与DNA复制的 ，对目的基因的 进行大量复制的技术。该技术由 等人于1988年发明。 （2）原理： 。 （3）基本条件：①场所：在一定的 中进行，其中一般要添加 。②DNA复制的模板： 。③合成子链的原料： 。④酶： 的DNA聚合酶，其作用是 。⑤引物：其作用是使 能够从引物的 端开始连接 。 (4)过程：目的基因DNA 后解为 ， 结合；然后以 为模板，在 酶作用下进行 ,即将4种脱氧核甘酸加到引物的 端，如此重复循环多次。由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的 ，因而每一次循环后目的基因的量可以增加 ，即成 扩增（ n,其中n为 ）。每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步： ①变性：当温度上升到 ℃时，双链DNA 为单链。 ②复性：当温度下降到 ℃左右时， 通过 与两条单链DNA结合。 ③延伸：当温度上升到 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在 的作用下，根据 原则合成新的DNA链。 (5)操作：PCR过程可以在 中自动完成。 (6)鉴定：常采用 来鉴定PCR的产物。 4.获取目的基因的其他方法：在获得转基因产品的过程中，除通过PCR获取目的基因外，还可以通过 来获取目的基因。 二、基因表达载体的构建 1．基因表达载体构建的目的：让目的基因在受体细胞中 ，并且可以 给下一代，同时使目的基因能够 。 2．基因表达载体的组成：一个基因表达载体应含有 等。 3．基因表达载体的构建过程：首先用一定的 切割载体，使它出现一个切口；然后用 切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA 将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。 三、将目的基因导入受体细胞 1.将目的基因导入植物细胞 （1）花粉管通道法：花粉管通道法有多种操作方式。例如，可以用微量注射器将含 的DNA溶液直接注入 中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在 上，使目的基因借助 进入胚囊。 （2）农杆菌转化法： ①转化：转化是指 进入受体细胞内，并且在受体细胞内 的过程。 ②农杆菌的特点：农杆菌能在自然条件下侵染 植物，而对大多数 植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有 ，当它侵染植物细胞后，能将 上的 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的 上。 ③转化过程：如果将目的基因插入 中，通过农杆菌的 作用，就可以 。 2.将目的基因导入动物细胞：将目的基因导入动物 最常用的一种方法是利用 直接将目的基因注入动物的 中,这个 将发育成为具有 的动物。 3. 将目的基因导入微生物细胞：常以 作为受体细胞，一般先用 处理受体细胞，使细胞处于一种 的生理状态，然后再将重组的 导入其中。 四、目的基因的检测与鉴定 1.目的：目的基因的检测与鉴定的目的是判断导入受体细胞后的目的基因 。这是基因工程的第四步工作，也是检査 的一步。 2.方法： （1）分子生物学水平的检测：通过 等技术检测受体细胞的 上是否插入了 。利用 技术检测目的基因是否转录出了 。用相应抗体进行 检测目的基因是否翻译成 等。 （2）个体水平的鉴定：除进行分子水平检测外，还需要进行 ，例如，通过 等判断是否获得了抗性及抗性程度。 五、DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.实验原理 （1）DNA片段的扩增：PCR利用了 原理，通过调节 来控制DNA双链的 。PCR仪实质上就是一台能够自动调控 的仪器。一次PCR一般要经历 次循环。 （2）琼脂糖凝胶电泳：DNA分子具有 的基团，在一定的pH下,这些基团可以带上 。在 的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动，这个过程就是 。PCR的产物一般通过 来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的 、DNA分子的 等有关。凝胶中的DNA分子通过 ，可以在波长为300nm的 灯下被检测出来。 2.方法步骤 （1）移液：用 器按照配方或PCR试剂盒的说明书，在 中依次加入各组分。待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。 （2）离心：将微量离心管放在离心机上，离心约 s，使反应液集中在管的 。 （3）反应：将装有反应液的微量离心管放入 中，设置程序进行反应。 （4）根据待分离的DNA片段的 ，用 配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为 的琼脂糖溶液，并加入适量的 染料混匀。 （5）将扩增得到的PCR产物与 (内含指示剂)混合，再用 将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。 （6）接通电源，根据 来设定电压，一般为 。待指示剂前沿迁移接近 时，停止电泳。 （7）电泳结束后，取出凝胶置于 下观察和照相。 3.操作提示 （1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行 处理。 （2）缓冲液和酶应 成小份，并在 ℃储存。使用前将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上 融化。 （3）在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都 。 （4）在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 4.结果分析与评价 （1）可以通过在 下直接观察DNA条带的 来评价扩增的结果。（P85“问题1”） （2）如果扩增不成功，可能的原因有： 等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有： 等。 第3节 基因工程的应用 一、基因工程在农牧业方面的应用 1.转基因抗虫植物 (1)方法：从某些生物中分离出具有 的基因，将它导入作物中培育出具有 的作物。 (2)成果：已问世的转基因抗虫棉花、玉米、大豆、水稻和马铃薯等。 2．转基因抗病植物 (1)背景：许多栽培作物由于自身缺少抗病基因，因此用常规育种的方法很难培育出 。 (2)方法：科学家将来源于某些 等的 导入植物中，培育出了转基因抗病植物。 (3)成果：转基因抗病毒 等。 3．转基因抗除草剂植物 (1)背景：杂草常常危害农业生产，而大多数除草剂不仅能 ，还会 ，导致作物减产。 (2)方法：将 的基因导入作物，可以培育出抗除草剂的作物品种。 (3)优点：在喷洒除草剂时， 。 (4)成果：转基因抗除草剂 等。 4.改良植物的品质：利用转基因技术可以提高植物的 等。例如，将 的蛋白质编码基因导入植物中，可以提高这种氨基酸的含量。我国科学家成功地将与 的基因导入矮牵牛中，使它呈现出自然界没有的颜色变异，大大提高了它的观赏价值。 5.提高动物的生长速率： （1）原理及方法：由于外源生长激素基因的 可以使转基因动物生长得更快，因此科学家将这类基因导入动物体内，以提高动物的 。 （2）成果：我国科学家将 导入鲤鱼,在同等养殖条件下，转基因鲤鱼的生长速率比非转基因鲤鱼提高了42%〜115%。 6．改善畜产品的品质：有些人由于 分泌少,不能完全消化牛奶中的乳糖，食用牛奶后会出现腹泻等不适症状，这称为 。我国约有1/3的成年人对乳糖不耐受。为了解决这一问题，科学家将 导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量 ，而其他营养成分不受影响。 二、基因工程在医药卫生领域的应用 （1）对微生物或动植物的细胞进行 ，使它们能够生产药物。这些药物包括 等，它们可以用来预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、传染病、糖尿病和类风湿关节炎等。我国生产的 等基因工程药物均已投放市场。 （2）利用基因工程技术，让哺乳动物 。科学家将 重组在一起，通过 的方法导入哺乳动物的 中，由这个 发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过 来生产所需要的药物,这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。目前，科学家已经在牛、山羊等动物乳腺生物反应器中，获得了 等重要的医药产品。 （3）基因工程技术还可能使 的设想成为现实。目前，科学家正尝试利用 技术对猪的器官进行改造，培育出不会引起 反应的转基因克隆猪器官。 三、基因工程在食品工业方面的应用 （1）利用基因工程菌生产食品工业用氨基酸。例如，阿斯巴甜是一种普遍使用的甜味剂，主要由 形成，这两种氨基酸就可以通过基因工程实现 。 （2）利用基因工程菌生产食品工业用酶。例如，奶酪是一种被广泛食用的发酵奶制品。大多数奶酪的生产需要使用凝乳酶来凝聚固化奶中的 。科学家将 导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过 批量生产凝乳酶。另外，加工转化糖浆需要的 酶，加工烘烤食品要用到的 酶等也都可以通过构建 ，然后用 技术大量生产。 （3）利用基因工程菌生产食品工业用 。 四、其他方面的应用：基因工程使人们 培育出具有优良性状的动植物品种，获得很多过去难以得到的 ，甚至还能培育出可以 的“超级细菌”来 第4节 蛋白质工程的原理和应用 一、蛋白质工程及其崛起的缘由 1.蛋白质工程：蛋白质工程是指以蛋白质分子的 作为基础，通过 ，来改造 ，或制造 ，以满足人类生产和生活的需求。目前，蛋白质工程已成为研究 的重要手段，并将广泛应用于医药和其他工农业生产中。 2.蛋白质工程崛起的缘由：基因工程原则上只能生产 ，这些天然蛋白质是生物在 过程中形成的,它们的结构和功能符合 的需要，却不一定完全符合 的需要。 二、蛋白质工程的基本原理 1.目标：蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质 的特定需求，对蛋白质的 。由于 ，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成 来完成。 2.蛋白质工程的基本途径：预期的蛋白质功能→设计预期的 →推测应有的 序列→找到并改变相对应的 序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。下图为蛋白质工程的基本思路，图中A～E处应填写的内容依次为： 。 三、蛋白质工程的应用 (1)医药工业方面：①科学家通过对 的改造，研发出速效胰岛素类似物产品。 ②干扰素在体外保存相当困难，如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成 ，那么在–70℃的条件下，干扰素可以保存半年。③小鼠单克隆抗体会使人产生免疫反应,从而导致它的治疗效果大大降低，科学家将小鼠抗体上 “嫁接”到人的抗体上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会降低很多。 (2)其他工业方面：用于改进酶的 ，如利用蛋白质工程获得枯草杆菌蛋白酶的 ，筛选出符合工业化生产需求的 ，提高该酶的使用价值。 (3)农业方面：①科学家尝试改造某些 ，以提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量。②科学家利用蛋白质工程的思路设计优良 ，通过改造微生物蛋白质的结构，增强微生物防治病虫害的效果。 处理环境污染, 03 重难专攻 重难点1基因工程的基本工具、DNA 的粗提取与鉴定 1.分析DNA被切割后的片段的方法 方法一：逐项判断法 对题目中的选项逐项分析，看酶切结果是否与题目信息一致 方法二：套用规律 (1)若酶切后碱基数与原DNA相同，则DNA上只有一个酶切位点，该DNA为环状DNA。 (2)若DNA上只有一个酶切位点，同时酶切结果有两个片段，则属于链状DNA。 (3)酶切结果的片段数不一定等于酶切片段的种类数 2.选择限制酶应遵循的原则 (1)限制酶的酶切位点应位于目的基因两侧,不能将目的基因破坏。 (2)所选限制酶应使得到的目的基因和质粒具有相同的末端,从而能互补配对。 (3)所选限制酶应保证质粒上至少保留一个标记基因不被破坏。 (4)可以选用双酶切割,避免目的基因或质粒自身环化,保证两者正向连接。 3.“DNA粗提取与鉴定”实验中各步骤的原理或目的 步骤 原理或目的 充分研磨 使细胞破碎，DNA溶解于研磨液中 过滤 （或离心） 除去细胞膜等不溶杂质,得到与蛋白质等杂质混合在一起的溶解于滤液(或上清液)中的DNA 搅拌 （或离心） 析出DNA 加入预冷的酒精溶液,某些蛋白质溶于酒精,DNA不溶于酒精,将DNA和某些蛋白质等杂质初步分离 溶解 用2molL的NaCl溶液溶解DNA 鉴定DNA 二苯胺试剂现配现用，沸水浴加热，溶液变蓝色则证明有DNA存在 重难点2PCR扩增的原理及过程、基因工程的操作程序 1.通过比较 PCR 与体内 DNA 复制的差异来梳理PCR 过程 比较项目 PCR 体内DNA复制 场所 离心管中 细胞内 方式 半保留全连续局部区域复制 半保留半不连续全链复制 起始位点 引物3'端 复制起始位点 酶 一种耐高温的DNA聚合酶(Taq 酶) 多种酶 反应条件 温度变幅大 温和 解旋 高温解旋 解旋酶解旋 引物 一小段短单链DNA 一小段短单链RNA 产物 引物界定的片段 核基因组 循环次数 人为设置 与细胞分裂同步 2. 通过 PCR 中的相关计算来理解 PCR 过程 结合PCR的过程,在PCR中存在以下数量关系: 项目 n轮循环 DNA 分子数 2n 含引物1(或2)的DNA分子数 2n-1 同时含引物1、2的 DNA 分子数 2n-2 共消耗的引物数量 2n+1-2 两端等长的子代 DNA分子数 2n-2n 3.构建基因表达载体的3点提醒 (1)目的基因的获取与基因表达载体的构建都涉及碱基互补配对。 (2)在构建基因表达载体时,目的基因应插入启动子和终止子之间。 (3)复制原点是DNA复制的起始位点,若复制原点被破坏,则载体将不能复制。即完整的基因表达载体并非只有启动子、目的基因、终止子和标记基因,还有复制原点等结构。 4.农杆菌转化法中两次拼接和两次导入 第一次拼接：将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上 第一次导入：将含目的基因的T质粒导入农杆菌 第二次导入：含目的基因的重组Ti质粒导入受体细胞(非人工操作) 第二次拼接：插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上(非人工操作) 5.目的基因导入不同受体细胞的常用方法 目的基因导入植物细胞——农杆菌转化法、花粉管通道法 目的基因导入动物受精卵——显微注射法 目的基因导入大肠杆菌——Ca2+处理法 重难点3基因工程的应用 1.解答基因工程应用类试题的3个步骤 基因工程的应用类试题常以某方面的具体应用为背景进行考查,其实质还是考查基因工程的基本工具与操作程序,因此仍需要掌握相应的流程: 第一步：掌握流程 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞(动物细胞:采用显微注射法将目的基因导入受精卵。植物细胞:采用花粉管通道法、农杆菌转化法将目的基因导入体细胞。微生物细胞:采用Ca2+处理法将目的基因导入微生物细胞)→目的基因的检测与鉴定 第二步：知晓原理 基因重组 第三步：区分差异，明确优势 如掌握基因工程育种与杂交育种的区别，进一步理解基因工程育种的优势所在 重难点4蛋白质工程的基本思路 1.蛋白质工程类试题的解题思路 分析蛋白质工程类试题,需从操作手段、设计思路结果等方面入手: 2.蛋白质工程和基因工程的比较 项目 蛋白质工程 基因工程 过程 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 实质 定向改造或生产人类所需要的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品 结果 可生产自然界中不存在的蛋白质 只能生产自然界中已存在的蛋白质 联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程 04 教考衔接 1．从图甲酶切结果分析，图乙中目的基因（长度为2.0kb）插入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所用的限制酶是（    ）    A．②，BamHⅠ B．①，EcoRⅠ C．①，EcoRⅠ和HindⅢ D．②，EcoRⅠ和HindⅢ 2．第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因（如图甲）插入到适宜的质粒（如图乙）中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcoRI和Sau3AI。下列分析正确的是（    ） A．限制性内切核酸酶广泛存在于真核生物中 B．构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AI切割目的基因和质粒 C．图乙中只用EcoRI切割后的质粒，含有1个游离的磷酸基团 D．用EcoRI切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物 3．下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将两者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述正确的是（    ） A．应选择限制酶E 和酶G 同时处理pBR322质粒和人生长激素基因 B．所选用的受体菌不能含有和基因 C．用含四环素的培养基筛选出含有重组质粒的受体菌 D．同时用酶E、酶F 和酶G 处理图中质粒，电泳后可得到5个条带 4．某兴趣小组设计的“DNA的粗提取与鉴定”实验的部分操作流程如图所示。下列相关叙述正确的是（    ） A．实验材料选择猪的红细胞可免去研磨的过程 B．将图1中研磨液过滤后的沉淀物置于的冰箱中能防止DNA被降解 C．图2往容器中加入体积分数的冷酒精能使DNA溶解于其中 D．图3中的两支试管均加入的溶液和二苯胺试剂 5．以洋葱为材料进行“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（    ） A．将蒸馏水加入切碎的洋葱中充分研磨以释放核DNA B．洋葱研磨后应使用垫有滤纸的漏斗进行过滤 C．将滤液静置后，取沉淀物溶解到95%的冷酒精中 D．将粗提取的DNA用二苯胺试剂鉴定会呈现蓝色 6．利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，则（　　） A．需要已知目的基因的全部序列以便设计引物 B．共需2n＋1－2个引物参与子代DNA分子的合成 C．应向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶、缓冲液等 D．理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占15/16 7．T4溶菌酶在高温时易失去活性。研究人员对编码T4溶菌酶的基因进行改造，使T4溶菌酶第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，提高了酶的耐热性。下列相关叙述正确的是（　　） A．T4溶菌酶耐热性提高的原因是组成该酶的氨基酸种类和数量发生了改变 B．T4溶菌酶的改造属于蛋白质工程，自然界中的酶都可通过蛋白质工程进行改造 C．该方法得到的T4溶菌酶不需要功能的鉴定 D．若高温使蛋白质分子的空间结构发生改变，蛋白质的功能也会受到影响 8．已知生物体内有一种 P 蛋白，如果将 P 蛋白的某一个氨基酸替换，改变后的蛋白质（P1蛋白）不但保留P 蛋白的功能，而且具有了酶的催化活性。下列说法错误的是（    ） A．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异 B．可以通过对P 蛋白基因进行改造或人工合成获得P1 蛋白基因 C．蛋白质工程操作过程中，也需要限制酶、DNA 连接酶和载体 D．细胞内合成P 蛋白与P1 蛋白的过程中，遗传信息的流向是相同的 9．天然胰岛素制剂容易形成二聚体或六聚体，皮下注射注射胰岛素后往往要经历一个逐渐解离为单体的过程，这在一定程度上延缓了疗效。科学家利用蛋白质工程将胰岛素中B28位脯氨酸替换成天冬氨酸或者将它与B29位的赖氨酸交换位置，从而有效抑制了胰岛素的聚合。下列叙述正确的是（    ） A．在蛋白质工程改造胰岛素过程中，需要遵循碱基互补配对原理 B．通过基因工程和蛋白质工程生产的胰岛素的氨基酸序列相同 C．对胰岛素进行改造通过直接改造胰岛素的分子结构来实现 D．对胰岛素进行分子设计必须从预期胰岛素的结构特点入手 10．（不定项）重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景。如图表示利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列说法正确的是（    ） A．引物中G+C的含量越高，引物与模板DNA结合的稳定性越高 B．在第一阶段由于引物2和引物3发生碱基互补配对，因此需将两者置于不同反应系统中 C．引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行1次复制后，共产生3种双链DNA分子 D．在引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图示双链DNA，至少要经过3次复制 11．为使水稻获得抗除草剂性状，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入水稻植株，获得抗草甘膦转基因水稻。 注：GUS基因表达产物经染色能从无色变成蓝色 (1)将草甘膦抗性基因作为 ，与Ti质粒用相同的 和DNA连接酶处理构建基因表达载体。 (2)用 处理农杆菌后获得感受态细胞，将其与基因表达载体混合完成转化后，在添加 的培养基中，经筛选1得到含基因表达载体的农杆菌。 (3)取某品种水稻的幼胚，先进行 处理，然后接种到培养基中，水稻幼胚细胞发生 形成愈伤组织。用含基因表达载体的农杆菌侵染该愈伤组织。 (4)PCR扩增时需要根据草甘膦抗性基因序列设计 种引物，引物是 。 (5)利用PCR技术，可以鉴定被侵染的愈伤组织中是否含有草甘膦抗性基因。草甘膦抗性基因的部分序列如下： 5’---ATGGCT………AGGAAC---3’ 3’---TACCGA………TCCTTG---5’ 根据上述序列应选择引物 （填字母）进行PCR。 A．引物：5’-TACCGA-3’ B．引物：5’-GTTCCT-3’ C．引物：5’-AUGGCU-3’ D．引物：5’-ATGGCT-3’ (6)除了鉴定愈伤组织中是否含有目的基因以外，还可以利用GUS基因表达产物的鉴定进行图中的筛选2，以确定目的基因是否 。两次筛选后得到的转基因愈伤组织经过细胞的 过程，获得转基因水稻。 12．PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0．9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题： (1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。 (2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入 和 两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用 （填“E．coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。 相关限制酶的识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 HindⅢ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoRI G↓AATTC CTTAA↑G PvitⅡ CAG↓CTG GTC↑GAC PstI CTGC↓AG GA↑CGTC KpnI G↓GTACC CCATG↑G BamHI G↓GATCC CCTAG↑G 注：箭头表示切割位点 (3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于 的生理状态，以提高转化效率。 (4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2， 号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。 注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb的DNA分子条带未出现在图中 (5)将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的 （填“G1”或“S”或“G2/M”）期。 13．金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题： （1）从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过 获得 用于PCR扩增。 （2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的 位点。设计引物时需要避免引物之间形成 ，而造成引物自连。 （3）图中步骤1代表 ，步骤2代表复性，步骤3代表 ，这三个步骤组成一轮循环。 （4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏 的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但 的引物需要设定更高的退火温度。 （5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有 (填序号：①升高退火温度　②降低退火温度　③重新设计引物)。 14．心脏移植是挽救终末期心脏病患者生命唯一有效的手段，然而心脏移植过程中会发生缺血再灌注损伤（IRI），可能导致心脏坏死。研究发现，IRI通过促进Caspase 8等一系列凋亡基因的表达，导致细胞凋亡最终引起器官损伤。根据Caspase 8基因合成的小干扰RNA（siRNA）可以使Caspase 8基因沉默，有效抑制IRI所致的器官损伤。图1是利用猪的心肌细胞开展siRNA作用研究的示意图，图2是此研究可能用到的4种限制酶及其切割位点，回答下列问题： (1)图1中步骤②构建重组质粒需要使用多种工具酶。常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，图2中 酶切割后的DNA片段可以用E。coliDNA连接酶连接，图中 酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。 (2)图1中步骤③将重组质粒导入猪的心肌细胞最常用的方法是 。siRNA对应DNA序列在心肌细胞中表达产生siRNA的步骤④称为 。siRNA与RISC组装形成基因沉默复合物，通过抑制基因表达的 过程，使Caspase 8基因沉默，从而降低IRI引起的细胞凋亡。 (3)研究人员根据Caspase 8基因的碱基序列，设计了三种序列分别导入猪的心肌细胞，通过测定靶基因Caspase 8的mRNA含量来确定最优序列。测定mRNA含量时，需提取心肌细胞的总RNA，经过 过程得到cDNA，再进行PCR扩增，测定PCR产物量，结果如图3所示，据此判断最优序列是 。 15．普通矮牵牛因缺乏蓝色色素合成所需的转座酶而不能开蓝色花，研究人员尝试把从蔷薇花瓣细胞中分离提取的转座酶F35H基因转入普通的矮牵牛，培育蓝色矮牵牛新品种，该过程所用的质粒与含转座酶F35H基因的DNA片段上相关限制酶的酶切位点如下图1和图2所示。已知限制性内切核酸酶BamHI、Sau3A I、Hind III识别的序列和酶切位点分别是、、，请分析并回答下列问题： (1)图1中质粒上还有一个没有标出的结构是 ，启动子的功能是 。 (2)用图中的质粒和转座酶F35H基因构建基因表达载体时，用来切割质粒和目的基因的限制酶是 。 (3)若将目的基因插入农杆菌Ti质粒的 中后用农杆菌感染矮牵牛细胞，则可将目的基因插入到植物细胞的 上。 (4)通过基因工程获得蓝色矮牵牛新品种的育种原理是 。相比传统的育种方法，基因工程育种的优点是 （答出1点即可）。 16．基因工程：制备新型酵母菌 (1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是 (填“细胞内”或“细胞外”)。 (2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A、B，已知酵母菌体内DNA有许多A－B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物 对目的基因进行PCR。 (3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因(UGA)常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒的物质。 Ⅰ.导入目的基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA基因，再重新导入。研究人员在UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C、C′序列，以便对UGA基因进行切除。C、C′的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式 进行连接。 Ⅱ.切去UGA基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。 (4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图 。 学科网（北京）股份有限公司1 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$概念：指按照人们的愿望，通过转基因等技术。赋予生物 以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型 和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在 DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组 DNA技术. 来源：原核生物 作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每 一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 限制性核酸内切酶 不能破坏目的基因：至少要保存一个标记基因 选择限制酶的方法 为避免目的基因及质粒自身环化、反向连接。也可使用不 同的限制酶切割目的基因所在片段和质粒（双酶切奶 重组DNA技术的基本工具 作用：能够将两个DNA片段连接起来 DNA连接酶 基本工具 种类：E,coli DNA连接酶.T4DNA连接酶 作用：作为载体，将外源基因送入受体细胞 常用载体：质粒 DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点 载体 作为载体的三个条件 能在细胞内自我复制，或整合到受体DNA上，随受体 DNA同步复制 含有特殊的标记基因。如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗 性基因 目的基因的获取 方法：基因文库法、PCR法、逆转录法、人工合成法 目的：使基因在受体细胞中稳定存在，并目遗传给下一代 使目的基因能够表达和发挥作用 基因表达载体的组成：启动子、目的基因、终止子、标记 基因工程 基因表达载体的构建 基因、复制原点 用适宜的限制酶切割载体 构建过程 用同一种限制酶或能产生相同黏性末端的限制酶切割目的 基因 基因工程的基本操作程序 用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体上 植物细胞：花粉管通道法、农杆菌转化法 将目的基因导入受体细胞 动物细胞：显微注射法 微生物：Ca2+处理 分子水平的检测 通过PCR等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了 目的基因的检测与鉴定 目的基因检测目的基因是否转录出mRNA 个体生物学水平的检测 在农牧业方面的应用 基因工程的应用 在医药卫生领域的应用 在食品工业方面的应用 概念：蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生 物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现 有蛋白质。或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生 活的需求 基本思路：从预期的蛋白质功能出发一设计预期的蛋白质 结构一→推测应有的氨基酸序列一找到并改变相对应的脱氧 蛋白质工程 核苷酸序列（基因）或合成新的基因一获得所需要的蛋白质 在医药工业方面一研发速效镜岛素类似物一改造干扰素 —抗体改造 应用 工业方面一改进酶的性能或开发新的工业用酶 农业方面：改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物 光合作用的效率，增加粮食的产量改造微生物蛋白质的结 构，设计优良微生物农药，使它防治病虫害的效果增强 第3章 基因工程 内容导航 01 思维导图 知识串联重难点1基因工程的基本工具、DNA 的粗提取与鉴定 重难点2 PCR扩增的原理及过程、基因工程的操作程序 重难点3基因工程的应用 重难点4蛋白质工程的基本思路 02 考点速记 核心必记 03 重难专攻 素养提升 04 教考衔接 科学练题 （详图见附件PDF）01 思维导图 02 考点速记 第1节 DNA重组技术的基本工具 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 1.来源：切割DNA的工具是限制性核酸内切酶，又称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。 2.作用：限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 3.结果：DNA分子经限制酶切割产生DNA片段，它们的末端通常有两种形式—黏性末端和平末端。 二、DNA连接酶——“分子缝合针” 1.作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 2.类型：在基因工程操作中，常用的DNA连接酶主要有两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E.coliDNA连接酶；另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4DNA连接酶。前者只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段。后者既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低。 三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 1.作用：将外源基因送入细胞。 2.类型：在基因工程中通常是利用质粒作为载体,还有噬菌体、动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。 四、DNA的粗提取与鉴定 1.实验原理 （1）提取DNA的原理：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如，利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。 （2）鉴定DNA的原理：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。 2.方法步骤 （1）称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。 （2）去除滤液中的杂质。方案一：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液；方案二：直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液。 （3）DNA的析出：方案一：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA；用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；方案二：将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。 （4）DNA的鉴定：取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶解于其中一支试管的NaCl溶液中，再向两支试管中加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 3.结果分析与评价：观察提取的DNA的颜色，如果不是白色状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色，说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。 第2节 基因工程的基本操作程序 一、目的筛选与获取 1.目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因,如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 2.筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是筛选合适的目的基因较为有效的方法之一。测序技术的发展，以及遗传序列数据库、序列比对工具等的应用，为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 3．获取目的基因的方法：①人工合成目的基因。例如，我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家人工合成了目的基因。②常用PCR特异性地快速扩增目的基因。③通过构建基因文库来获取目的基因。 4.利用PCR获取和扩增目的基因 (1)含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。该技术由穆里斯等人于1988年发明。 （2）原理：DNA半保留复制。 （3）基本条件：①场所：在一定的缓冲溶液中进行，其中一般要添加Mg2＋。②DNA复制的模板：DNA母链。③合成子链的原料：4种脱氧核苷酸。④酶：耐高温的DNA聚合酶，其作用是催化合成DNA子链。⑤引物：其作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 (4)过程：目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸,即将4种脱氧核甘酸加到引物的3'端，如此重复循环多次。由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（2n,其中n为扩增循环的次数）。每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步： ①变性：当温度上升到90℃时，双链DNA解聚为单链。 ②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 ③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 (5)操作：PCR过程可以在PCR扩增仪中自动完成。 (6)鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 4.获取目的基因的其他方法：在获得转基因产品的过程中，除通过PCR获取目的基因外，还可以通过构建基因文库来获取目的基因。 二、基因表达载体的构建 1．基因表达载体构建的目的：让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 2．基因表达载体的组成：一个基因表达载体应含有目的基因、标记基因、启动子、终止子等。 3．基因表达载体的构建过程：首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。 三、将目的基因导入受体细胞 1.将目的基因导入植物细胞 （1）花粉管通道法：花粉管通道法有多种操作方式。例如，可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 （2）农杆菌转化法： ①转化：转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 ②农杆菌的特点：农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 ③转化过程：如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。 2.将目的基因导入动物细胞：将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射直接将目的基因注入动物的受精卵中,这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。 3. 将目的基因导入微生物细胞：常以大肠杆菌作为受体细胞，一般先用Ca2＋处理受体细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。 四、目的基因的检测与鉴定 1.目的：目的基因的检测与鉴定的目的是判断导入受体细胞后的目的基因是否可以稳定维持和表达其遗传特性。这是基因工程的第四步工作，也是检査基因工程是否做成功的一步。 2.方法： （1）分子生物学水平的检测：通过PCR等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因。利用PCR技术检测目的基因是否转录出了mRNA。用相应抗体进行抗原—抗体杂交检测目的基因是否翻译成蛋白质等。 （2）个体水平的鉴定：除进行分子水平检测外，还需要进行个体生物学水平的鉴定，例如，通过抗虫、抗病接种实验等判断是否获得了抗性及抗性程度。 五、DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.实验原理 （1）DNA片段的扩增：PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。 （2）琼脂糖凝胶电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 2.方法步骤 （1）移液：用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。 （2）离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在管的底部。 （3）反应：将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。 （4）根据待分离的DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，并加入适量的核酸染料混匀。 （5）将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。 （6）接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 （7）电泳结束后，取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 3.操作提示 （1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 （2）缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。使用前将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 （3）在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 （4）在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 4.结果分析与评价 （1）可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。（P85“问题1”） （2）如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。（P85“问题2”） 第3节 基因工程的应用 一、基因工程在农牧业方面的应用 1.转基因抗虫植物 (1)方法：从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将它导入作物中培育出具有抗虫性的作物。 (2)成果：已问世的转基因抗虫棉花、玉米、大豆、水稻和马铃薯等。 2．转基因抗病植物 (1)背景：许多栽培作物由于自身缺少抗病基因，因此用常规育种的方法很难培育出抗病的新品种。 (2)方法：科学家将来源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物中，培育出了转基因抗病植物。 (3)成果：转基因抗病毒甜椒、番木瓜和烟草等。 3．转基因抗除草剂植物 (1)背景：杂草常常危害农业生产，而大多数除草剂不仅能杀死田间杂草，还会损伤作物，导致作物减产。 (2)方法：将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可以培育出抗除草剂的作物品种。 (3)优点：在喷洒除草剂时，田间杂草会被杀死而作物不会受到损伤。 (4)成果：转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等。 4.改良植物的品质：利用转基因技术可以提高植物的营养价值、观赏价值等。例如，将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中，可以提高这种氨基酸的含量。我国科学家成功地将与植物花青素代谢相关的基因导入矮牵牛中，使它呈现出自然界没有的颜色变异，大大提高了它的观赏价值。 5.提高动物的生长速率： （1）原理及方法：由于外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长得更快，因此科学家将这类基因导入动物体内，以提高动物的生长速率。 （2）成果：我国科学家将外源生长激素基因导入鲤鱼,在同等养殖条件下，转基因鲤鱼的生长速率比非转基因鲤鱼提高了42%〜115%。 6．改善畜产品的品质：有些人由于乳糖酶分泌少,不能完全消化牛奶中的乳糖，食用牛奶后会出现腹泻等不适症状，这称为乳糖不耐受。我国约有1/3的成年人对乳糖不耐受。为了解决这一问题，科学家将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响。 二、基因工程在医药卫生领域的应用 （1）对微生物或动植物的细胞进行基因改造，使它们能够生产药物。这些药物包括细胞因子、抗体、疫苗和激素等，它们可以用来预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、传染病、糖尿病和类风湿关节炎等。我国生产的重组人干扰素、血小板生成素、促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子等基因工程药物均已投放市场。 （2）利用基因工程技术，让哺乳动物批量生产药物。科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物,这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。目前，科学家已经在牛、山羊等动物乳腺生物反应器中，获得了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和a-抗胰蛋白酶等重要的医药产品。 （3）基因工程技术还可能使建立移植器官工厂的设想成为现实。目前，科学家正尝试利用基因工程技术对猪的器官进行改造，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。 三、基因工程在食品工业方面的应用 （1）利用基因工程菌生产食品工业用氨基酸。例如，阿斯巴甜是一种普遍使用的甜味剂，主要由天冬氨酸和苯丙氨酸形成，这两种氨基酸就可以通过基因工程实现大规模生产。 （2）利用基因工程菌生产食品工业用酶。例如，奶酪是一种被广泛食用的发酵奶制品。大多数奶酪的生产需要使用凝乳酶来凝聚固化奶中的蛋白质。科学家将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。另外，加工转化糖浆需要的淀粉酶，加工烘烤食品要用到的脂肪酶等也都可以通过构建基因工程菌，然后用发酵技术大量生产。 （3）利用基因工程菌生产食品工业用维生素。 四、其他方面的应用：基因工程使人们更容易培育出具有优良性状的动植物品种，获得很多过去难以得到的生物制品，甚至还能培育出可以降解多种污染物的“超级细菌”来处理环境污染, 第4节 蛋白质的原理和应用 一、蛋白质工程及其崛起的缘由 1.蛋白质工程：蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。目前，蛋白质工程已成为研究蛋白质结构和功能的重要手段，并将广泛应用于医药和其他工农业生产中。 2.蛋白质工程崛起的缘由：基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的,它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。 二、蛋白质工程的基本原理 1.目标：蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。 2.蛋白质工程的基本途径：预期的蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。下图为蛋白质工程的基本思路，图中A～E处应填写的内容依次为：转录、翻译、推测、多肽链、预期功能。 三、蛋白质工程的应用 (1)医药工业方面：①科学家通过对胰岛素基因的改造，研发出速效胰岛素类似物产品。 ②干扰素在体外保存相当困难，如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，那么在–70℃的条件下，干扰素可以保存半年。③小鼠单克隆抗体会使人产生免疫反应,从而导致它的治疗效果大大降低，科学家将小鼠抗体上结合抗原的区域“嫁接”到人的抗体上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会降低很多。 (2)其他工业方面：用于改进酶的性能或开发新的工业用酶，如利用蛋白质工程获得枯草杆菌蛋白酶的突变体，筛选出符合工业化生产需求的突变体，提高该酶的使用价值。 (3)农业方面：①科学家尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量。②科学家利用蛋白质工程的思路设计优良微生物农药，通过改造微生物蛋白质的结构，增强微生物防治病虫害的效果。 03 重难专攻 重难点1基因工程的基本工具、DNA 的粗提取与鉴定 1.分析DNA被切割后的片段的方法 方法一：逐项判断法 对题目中的选项逐项分析，看酶切结果是否与题目信息一致 方法二：套用规律 (1)若酶切后碱基数与原DNA相同，则DNA上只有一个酶切位点，该DNA为环状DNA。 (2)若DNA上只有一个酶切位点，同时酶切结果有两个片段，则属于链状DNA。 (3)酶切结果的片段数不一定等于酶切片段的种类数 2.选择限制酶应遵循的原则 (1)限制酶的酶切位点应位于目的基因两侧,不能将目的基因破坏。 (2)所选限制酶应使得到的目的基因和质粒具有相同的末端,从而能互补配对。 (3)所选限制酶应保证质粒上至少保留一个标记基因不被破坏。 (4)可以选用双酶切割,避免目的基因或质粒自身环化,保证两者正向连接。 3.“DNA粗提取与鉴定”实验中各步骤的原理或目的 步骤 原理或目的 充分研磨 使细胞破碎，DNA溶解于研磨液中 过滤 （或离心） 除去细胞膜等不溶杂质,得到与蛋白质等杂质混合在一起的溶解于滤液(或上清液)中的DNA 搅拌 （或离心） 析出DNA 加入预冷的酒精溶液,某些蛋白质溶于酒精,DNA不溶于酒精,将DNA和某些蛋白质等杂质初步分离 溶解 用2molL的NaCl溶液溶解DNA 鉴定DNA 二苯胺试剂现配现用，沸水浴加热，溶液变蓝色则证明有DNA存在 重难点2 PCR扩增的原理及过程、基因工程的操作程序 1.通过比较 PCR 与体内 DNA 复制的差异来梳理PCR 过程 比较项目 PCR 体内DNA复制 场所 离心管中 细胞内 方式 半保留全连续局部区域复制 半保留半不连续全链复制 起始位点 引物3'端 复制起始位点 酶 一种耐高温的DNA聚合酶(Taq 酶) 多种酶 反应条件 温度变幅大 温和 解旋 高温解旋 解旋酶解旋 引物 一小段短单链DNA 一小段短单链RNA 产物 引物界定的片段 核基因组 循环次数 人为设置 与细胞分裂同步 2. 通过 PCR 中的相关计算来理解 PCR 过程 结合PCR的过程,在PCR中存在以下数量关系: 项目 n轮循环 DNA 分子数 2n 含引物1(或2)的DNA分子数 2n-1 同时含引物1、2的 DNA 分子数 2n-2 共消耗的引物数量 2n+1-2 两端等长的子代 DNA分子数 2n-2n 3.构建基因表达载体的3点提醒 (1)目的基因的获取与基因表达载体的构建都涉及碱基互补配对。 (2)在构建基因表达载体时,目的基因应插入启动子和终止子之间。 (3)复制原点是DNA复制的起始位点,若复制原点被破坏,则载体将不能复制。即完整的基因表达载体并非只有启动子、目的基因、终止子和标记基因,还有复制原点等结构。 4.农杆菌转化法中两次拼接和两次导入 第一次拼接：将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上 第一次导入：将含目的基因的T质粒导入农杆菌 第二次导入：含目的基因的重组Ti质粒导入受体细胞(非人工操作) 第二次拼接：插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上(非人工操作) 5.目的基因导入不同受体细胞的常用方法 目的基因导入植物细胞——农杆菌转化法、花粉管通道法 目的基因导入动物受精卵——显微注射法 目的基因导入大肠杆菌——Ca2+处理法 重难点3基因工程的应用 1.解答基因工程应用类试题的3个步骤 基因工程的应用类试题常以某方面的具体应用为背景进行考查,其实质还是考查基因工程的基本工具与操作程序,因此仍需要掌握相应的流程: 第一步：掌握流程 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞(动物细胞:采用显微注射法将目的基因导入受精卵。植物细胞:采用花粉管通道法、农杆菌转化法将目的基因导入体细胞。微生物细胞:采用Ca2+处理法将目的基因导入微生物细胞)→目的基因的检测与鉴定 第二步：知晓原理 基因重组 第三步：区分差异，明确优势 如掌握基因工程育种与杂交育种的区别，进一步理解基因工程育种的优势所在 重难点4蛋白质工程的基本思路 1.蛋白质工程类试题的解题思路 分析蛋白质工程类试题,需从操作手段、设计思路结果等方面入手: 2.蛋白质工程和基因工程的比较 项目 蛋白质工程 基因工程 过程 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 实质 定向改造或生产人类所需要的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品 结果 可生产自然界中不存在的蛋白质 只能生产自然界中已存在的蛋白质 联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程 04 教考衔接 1．从图甲酶切结果分析，图乙中目的基因（长度为2.0kb）插入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所用的限制酶是（    ）    A．②，BamHⅠ B．①，EcoRⅠ C．①，EcoRⅠ和HindⅢ D．②，EcoRⅠ和HindⅢ 【答案】C 【分析】切制DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。它们能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 【详解】分析图1可知，重组质粒被EcoRⅠ酶切后，得到5.8kb的片段，说明重组质粒中只有一个EcoRⅠ的酶切位点；重组质粒被BamHⅠ酶切后产生3.8kb和2.0kb两种片段，说明重组质粒中有2个BamHⅠ的酶切位点；重组质粒被EcoRⅠ和HindⅢ酶切后，产生4.5kb和1.3kb两种片段，说明重组质粒中有EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点，且二种酶切位点之间的片段为4.5kb和1.3kb。结合图2分析可知，重组质粒①符合上述分析的结果，重组质粒②中EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点之间的片段为2.3kb和3.5kb，不符合图1酶切的结果。综上所述，C正确，ABD错误。 2．第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因（如图甲）插入到适宜的质粒（如图乙）中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcoRI和Sau3AI。下列分析正确的是（    ） A．限制性内切核酸酶广泛存在于真核生物中 B．构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AI切割目的基因和质粒 C．图乙中只用EcoRI切割后的质粒，含有1个游离的磷酸基团 D．用EcoRI切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物 【答案】B 【分析】根据题意和图示分析可知：图甲中可以看出，在目的基因上存在三种酶切位点，只有EcoR I具有两个切点，而BglⅡ和Sau3A I具有只有一个切点。图乙中也具有这三种限制酶的切割位点。 【详解】A、限制性内切核酸酶主要发现于原核生物中，尤其是细菌中，而不是真核生物中。它们能识别DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端或平末端，A错误； B、如果用BglⅡ和Sau3A I切割目的基因，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样用BglⅡ和Sau3A I切割质粒也形成这两种相同的黏性末端，因此它们可构成重组DNA，B正确； C、质粒为环状DNA，其上只含有一个EcoRI的切点，因此用EcoRI切割后，该环状DNA分子变为线性双链DNA分子，因每条链上含有一个游离的磷酸基团，因此切割后含有两个游离的磷酸基团，C错误； D、从图甲看出，用EcoRI切割目的基因后两端各有一切口，与图乙中EcoRI切口对接时，可有两种可能，即可产生两种重组DNA，D错误。 3．下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将两者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述正确的是（    ） A．应选择限制酶E 和酶G 同时处理pBR322质粒和人生长激素基因 B．所选用的受体菌不能含有和基因 C．用含四环素的培养基筛选出含有重组质粒的受体菌 D．同时用酶E、酶F 和酶G 处理图中质粒，电泳后可得到5个条带 【答案】B 【分析】分析图可知，切割目的基因和质粒最好用酶F和酶G，这样既避免切割后DNA片段的自身环化，又保留质粒上的标记基因，由图可知构建的基因表达载体破坏了四环素抗性基因，保留了氨苄青霉素抗性基因。 【详解】A、若选择酶E切割质粒，会破坏质粒上的四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，使构建的基因表达载体由于缺少标记基因而无法筛选，因此为避免切割后DNA片段的自身环化，又保留质粒上的标记基因切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G，A错误； B、由于AmpR和TetR基因是标记基因，故所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因，以便对含有目的基因的受体菌进行选择，B正确； C、若用酶F和酶G切割质粒和目的基因，则构建的基因表达载体中四环素抗性基因被破坏，因此含有重组质粒的受体菌不抗四环素，故不能用含四环素的培养基筛选出含有重组质粒的受体菌，可用含氨苄青霉素的培养基筛选出导入重组质粒的受体菌和导入空质粒的受体菌，在用含四环素的培养基进一步筛选导入重组质粒的受体菌，C错误； D、据图可知同时用酶E、酶F和酶G三种限制酶处理图中质粒，因酶E有两个作用位点，故将质粒切割成了4个DNA片段，电泳后可得到4个条带，D错误。 4．某兴趣小组设计的“DNA的粗提取与鉴定”实验的部分操作流程如图所示。下列相关叙述正确的是（    ） A．实验材料选择猪的红细胞可免去研磨的过程 B．将图1中研磨液过滤后的沉淀物置于的冰箱中能防止DNA被降解 C．图2往容器中加入体积分数的冷酒精能使DNA溶解于其中 D．图3中的两支试管均加入的溶液和二苯胺试剂 【答案】D 【分析】图1是破碎细胞，获取含DNA的滤液，图2过程是DNA析出过程，图3对提取后的DNA进行鉴定。 提取原理：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaC溶液中溶解度不同选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质 沉淀，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。 【详解】A、由于哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和细胞器，因此不能作为提取DNA的材料，A错误； B、将图1中研磨液放在4℃的冰箱中可以使酶的活性降低，防止DNA降解，B错误； C、提纯DNA时，加入的是预冷的、体积分数为95%的酒精溶液，DNA不溶于酒精溶液，C错误； D、取两支试管，编为1、2号，各加入2mol/L的氯化钠溶液2L,向1号试管中加入一些白色纤维状物，振荡使其溶解，然后向两支试管中各加入2mL二苯胺试剂，沸水浴加热5分钟。为了保证对照实验的准确性，因此两支试管中均要加入二苯胺试剂，D正确。 5．以洋葱为材料进行“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（    ） A．将蒸馏水加入切碎的洋葱中充分研磨以释放核DNA B．洋葱研磨后应使用垫有滤纸的漏斗进行过滤 C．将滤液静置后，取沉淀物溶解到95%的冷酒精中 D．将粗提取的DNA用二苯胺试剂鉴定会呈现蓝色 【答案】D 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理： 1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（DNA在0.14mol/L的氯化钠中溶解度最低）；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。 2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。 3、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、植物细胞含有细胞壁，蒸馏水加入不会导致细胞破裂，因此研磨洋葱时需加入洗涤剂，作用是溶解细胞膜，有利于细胞破裂，释放核DNA，A错误； B、洋葱研磨后应使用垫有纱布（或尼龙布）的漏斗进行过滤，B错误； C、DNA不溶于酒精溶液，因此沉淀物不能溶解到95%的冷酒精中，C错误； D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此粗提取的DNA可以用二苯胺试剂鉴定会呈现蓝色，D正确。 6．利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，则（　　） A．需要已知目的基因的全部序列以便设计引物 B．共需2n＋1－2个引物参与子代DNA分子的合成 C．应向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶、缓冲液等 D．理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占15/16 【答案】B 【分析】PCR技术：①概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；②原理：DNA复制；③条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；④方式：以指数的方式扩增，即约2n；⑤过程：高温变性、低温复性、中温延伸。 【详解】A、PCR是一项在生物体外复制特定的DNA分子片段的技术，只要有模板基因就行，不需要知道其序列就可扩增，保证引物能与模板基因结合就可以开始复制，即部分序列就可以设计引物，A错误； B、PCR技术的原理是DNA复制，根据DNA分子半保留复制特点可知，共有2n-1对引物参与子代DNA分子的合成，每对引物包含2个，即共需2n+1−2 个引物，B正确； C、PCR是利用高温进行解旋，不需要加入解旋酶，C错误； D、第4轮循环产物共得到24=16个DNA片段，其中亲本的2个模板链不含引物，故含两种引物的DNA片段占14/16=7/8，D错误。 7．T4溶菌酶在高温时易失去活性。研究人员对编码T4溶菌酶的基因进行改造，使T4溶菌酶第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，提高了酶的耐热性。下列相关叙述正确的是（　　） A．T4溶菌酶耐热性提高的原因是组成该酶的氨基酸种类和数量发生了改变 B．T4溶菌酶的改造属于蛋白质工程，自然界中的酶都可通过蛋白质工程进行改造 C．该方法得到的T4溶菌酶不需要功能的鉴定 D．若高温使蛋白质分子的空间结构发生改变，蛋白质的功能也会受到影响 【答案】D 【分析】蛋白质工程的基本途径：从预期蛋白质的功能出发→设计预期的蛋白质的结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。 【详解】A、由题意可知，T4溶菌酶耐热性提高的原因是组成该酶的氨基酸种类及空间结构均发生了改变，A错误； B、T4溶菌酶的改造属于蛋白质工程，酶大多是蛋白质，少数是RNA，蛋白质工程只能用于改造蛋白质类，B错误； C、该方法得到的T4溶菌酶需要功能的鉴定，C错误； D、结构决定功能，若高温使蛋白质分子的空间结构发生改变，蛋白质的功能也会受到影响，D正确。 8．已知生物体内有一种 P 蛋白，如果将 P 蛋白的某一个氨基酸替换，改变后的蛋白质（P1蛋白）不但保留P 蛋白的功能，而且具有了酶的催化活性。下列说法错误的是（    ） A．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异 B．可以通过对P 蛋白基因进行改造或人工合成获得P1 蛋白基因 C．蛋白质工程操作过程中，也需要限制酶、DNA 连接酶和载体 D．细胞内合成P 蛋白与P1 蛋白的过程中，遗传信息的流向是相同的 【答案】A 【分析】蛋白质工程就是通过对蛋白质化学、蛋白质晶体学和蛋白质动力学的研究，获得有关蛋白质理化特性和分子特性的信息，在此基础上对编码蛋白质的基因进行有目的的设计和改造，通过基因工程技术获得可以表达蛋白质的转基因生物系统，这个生物系统可以是转基因微生物、转基因植物、转基因动物，甚至可以是细胞系统。 【详解】A、蛋白质工程和基因工程的操作对象都是基因，两者的根本区别是蛋白质工程可制造出自然界没有的蛋白质，A错误； B、可以通过对P蛋白基因进行改造（基因结构的改变）或人工合成获得P1 蛋白基因，B正确； C、蛋白质工程操作过程中，需要酶和载体作为工具，C错误； D、细胞内合成P蛋白与P1蛋白的过程中，遗传信息的流向是相同的，都是从DNA→mRNA→蛋白质，D错误。 9．天然胰岛素制剂容易形成二聚体或六聚体，皮下注射注射胰岛素后往往要经历一个逐渐解离为单体的过程，这在一定程度上延缓了疗效。科学家利用蛋白质工程将胰岛素中B28位脯氨酸替换成天冬氨酸或者将它与B29位的赖氨酸交换位置，从而有效抑制了胰岛素的聚合。下列叙述正确的是（    ） A．在蛋白质工程改造胰岛素过程中，需要遵循碱基互补配对原理 B．通过基因工程和蛋白质工程生产的胰岛素的氨基酸序列相同 C．对胰岛素进行改造通过直接改造胰岛素的分子结构来实现 D．对胰岛素进行分子设计必须从预期胰岛素的结构特点入手 【答案】A 【分析】蛋白质工程的过程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。 【详解】A、在蛋白质工程改造胰岛素过程中，需要遵循碱基互补配对原理，改造对应的密码子或基因，A正确； B、由题文信息可知：改造后胰岛素中B28位脯氨酸替换成天冬氨酸或者将它与B29位的赖氨酸交换位置，故通过基因工程和蛋白质工程生产的胰岛素的氨基酸序列不完全相同，B错误； C、设计胰岛素的改造中，要对胰岛素基因的结构进行改造，C错误； D、对胰岛素进行分子设计的主要依据是胰岛素的预期功能，D错误。 10．（不定项）重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景。如图表示利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列说法正确的是（    ） A．引物中G+C的含量越高，引物与模板DNA结合的稳定性越高 B．在第一阶段由于引物2和引物3发生碱基互补配对，因此需将两者置于不同反应系统中 C．引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行1次复制后，共产生3种双链DNA分子 D．在引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图示双链DNA，至少要经过3次复制 【答案】ABC 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，其作用是使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。PCR每个循环包括变性、复性、延伸三个步骤，每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增。 【详解】A、G-C碱基对之间形成三个氢键，因此引物中G+C的含量越高，则其与模板链之间形成G-C碱基对越多，稳定性越高，A正确； B、由图可知，引物2和引物3分别与目的基因两条链的对应位置结合，因此二者之间存在互补配对片段，为防止扩增时引物2与引物3之间进行配对，需将其置于不同反应系统中，B正确； C、引物1和2位于一个反应系统中，引物3和4位于另一个反应系统中，这两个反应系统均进行1次复制，由引物1扩增的DNA与引物4扩增的DNA完全相同，因此只能产生3种双链DNA分子，即引物1（或4）扩增的双链DNA，引物2扩增的双链DNA，引物3扩增的双链DNA，C正确； D、引物2与目的基因的相应模板链结合，可形成一个双链不等长的DNA分子，该DNA分子中引物2所在的那条链再与引物1结合即可扩增获得同时含有引物1和引物2的双链等长的DNA分子，如图中所示，因此至少需要经过2次复制，D错误。 11．为使水稻获得抗除草剂性状，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入水稻植株，获得抗草甘膦转基因水稻。 注：GUS基因表达产物经染色能从无色变成蓝色 (1)将草甘膦抗性基因作为 ，与Ti质粒用相同的 和DNA连接酶处理构建基因表达载体。 (2)用 处理农杆菌后获得感受态细胞，将其与基因表达载体混合完成转化后，在添加 的培养基中，经筛选1得到含基因表达载体的农杆菌。 (3)取某品种水稻的幼胚，先进行 处理，然后接种到培养基中，水稻幼胚细胞发生 形成愈伤组织。用含基因表达载体的农杆菌侵染该愈伤组织。 (4)PCR扩增时需要根据草甘膦抗性基因序列设计 种引物，引物是 。 (5)利用PCR技术，可以鉴定被侵染的愈伤组织中是否含有草甘膦抗性基因。草甘膦抗性基因的部分序列如下： 5’---ATGGCT………AGGAAC---3’ 3’---TACCGA………TCCTTG---5’ 根据上述序列应选择引物 （填字母）进行PCR。 A．引物：5’-TACCGA-3’ B．引物：5’-GTTCCT-3’ C．引物：5’-AUGGCU-3’ D．引物：5’-ATGGCT-3’ (6)除了鉴定愈伤组织中是否含有目的基因以外，还可以利用GUS基因表达产物的鉴定进行图中的筛选2，以确定目的基因是否 。两次筛选后得到的转基因愈伤组织经过细胞的 过程，获得转基因水稻。 【答案】(1) 目的基因 限制性核酸内切酶 (2) CaCL2溶液 潮霉素 (3) 消毒  脱分化 (4) 2  使DNA聚合酶能够从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸 (5)BD (6) 表达 再分化 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。 从分子水平上检测目的基因的方法：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录—mRNA与DNA分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原-抗体杂交技术。 【详解】（1）构建的基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点，目的基因与运载体要用限制酶切割获得相同的末端才能进行连接，本实验中，草苷膦抗性基因为目的基因。 （2）细菌最常用的转化方法是：首先用Ca2+处理细胞，使细胞成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。若农杆菌得到含目的基因的表达载体，则也同时含有潮霉素抗性基因，因此可以用加有潮霉素的选择培养基把它筛选出来。 （3）外植体脱离了母体，易受微生物感染，在体外培养的条件下要消毒处理，再接种。外植体在培养基中发生脱分化，进行细胞分裂，形成愈伤组织。 （4）PCR技术要用到两种引物，使DNA聚合酶能够从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸。 （5）已知草甘膦抗性基因的部分序列，由于PCR技术中，子链合成的方向是从5，到3，，因此应选择引物BD进行PCR技术。 （6）SUS基因表达产物经染色能从无色变成蓝色，还可以利用GUS基因表达产物的鉴定进行图中的筛选2，以确定目的基因是否表达。两次筛选后得 到的转基因愈伤组织经过细胞的再分化过程，获得转基因水稻。 12．PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0．9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题： (1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。 (2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入 和 两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用 （填“E．coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。 相关限制酶的识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 HindⅢ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoRI G↓AATTC CTTAA↑G PvitⅡ CAG↓CTG GTC↑GAC PstI CTGC↓AG GA↑CGTC KpnI G↓GTACC CCATG↑G BamHI G↓GATCC CCTAG↑G 注：箭头表示切割位点 (3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于 的生理状态，以提高转化效率。 (4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2， 号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。 注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb的DNA分子条带未出现在图中 (5)将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的 （填“G1”或“S”或“G2/M”）期。 【答案】(1)逆转录 (2) EcoRI PvitⅡ T4DNA连接酶 (3)感受态 (4)3 (5)G2/M 【分析】分析图中质粒含有多个限制酶切位点，在启动子和终止子之间有三个酶切位点，KpnI在质粒上有两个酶切位点，PvitⅡ酶切后获得平末端。 图4中G1期和S期细胞减少，而G2期细胞数目明显增多。 将目的基因导入微生物细胞：Ca2+处理法。 【详解】（1）利用RNA获得cDNA的过程称为逆转录。 （2）根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间．图中看出，两者之间存在于三种限制酶切点，但是由于KpnI在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcoRI和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列；根据PvitⅡ的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4DNA连接酶连接质粒和目的基因。 （3）转化时用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。 （4）由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质粒，如果用EcoRI和PvitⅡ两种酶切割重组质粒电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于phb2基因大小为0．9kb，所以对应电泳图是菌落3。 （5）比较图4中G1期和S期细胞减少，而G2期细胞数目明显增多，说明了G1期和S期细胞可以进入G2期，而G2期的细胞没有能够完成分裂进入G1期，因此PHB2蛋白应该作用于G2/M期。 13．金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题： （1）从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过 获得 用于PCR扩增。 （2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的 位点。设计引物时需要避免引物之间形成 ，而造成引物自连。 （3）图中步骤1代表 ，步骤2代表复性，步骤3代表 ，这三个步骤组成一轮循环。 （4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏 的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但 的引物需要设定更高的退火温度。 （5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有 (填序号：①升高退火温度　②降低退火温度　③重新设计引物)。 【答案】 逆转录 cDNA 限制性核酸内切酶（限制酶） 碱基互补配对 变性 延伸 引物与模板 GC含量高 ②③ 【分析】PCR技术： 1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 2、原理：DNA复制。 3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。 4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 5、过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【详解】（1）PCR扩增目的基因，首先要有目的基因作为模板，所以从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录过程获得cDNA，从而用于PCR扩增。 （2）构建重组质粒，首先用限制酶切割含目的基因的DNA片段和质粒，所以位于目的基因两端的引物中需要增加适量的限制酶切割位点；设计的引物之间不能有碱基互补配对，否则引物自连，不能与模板相连。 （3）PCR反应过程是变性→复性→延伸，根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为退火，步骤3为延伸，这三个步骤组成一轮循环。 （4）退火表示引物与模板链相连，若温度过高会破坏引物与模板的碱基配对；由于G-C间三个氢键，A-T间两个键，所以G-C含量越高的引物，退火温度越高。 （5）PCR反应得不到任何扩增产物，可能是退火温度过高，导致引物与模板不能相连，或引物间相互配对，引物自连，不能与模板相连，可通过降低退火温度或重新设计引物进行改进。故选②③。 14．心脏移植是挽救终末期心脏病患者生命唯一有效的手段，然而心脏移植过程中会发生缺血再灌注损伤（IRI），可能导致心脏坏死。研究发现，IRI通过促进Caspase 8等一系列凋亡基因的表达，导致细胞凋亡最终引起器官损伤。根据Caspase 8基因合成的小干扰RNA（siRNA）可以使Caspase 8基因沉默，有效抑制IRI所致的器官损伤。图1是利用猪的心肌细胞开展siRNA作用研究的示意图，图2是此研究可能用到的4种限制酶及其切割位点，回答下列问题： (1)图1中步骤②构建重组质粒需要使用多种工具酶。常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，图2中 酶切割后的DNA片段可以用E。coliDNA连接酶连接，图中 酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。 (2)图1中步骤③将重组质粒导入猪的心肌细胞最常用的方法是 。siRNA对应DNA序列在心肌细胞中表达产生siRNA的步骤④称为 。siRNA与RISC组装形成基因沉默复合物，通过抑制基因表达的 过程，使Caspase 8基因沉默，从而降低IRI引起的细胞凋亡。 (3)研究人员根据Caspase 8基因的碱基序列，设计了三种序列分别导入猪的心肌细胞，通过测定靶基因Caspase 8的mRNA含量来确定最优序列。测定mRNA含量时，需提取心肌细胞的总RNA，经过 过程得到cDNA，再进行PCR扩增，测定PCR产物量，结果如图3所示，据此判断最优序列是 。 【答案】(1) EcoRⅠ、PstⅠ EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ 磷酸二酯键 (2) 显微注射法 转录 翻译 (3) 逆转录 序列2 【分析】基因工程的基本操作步骤包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、 DNA 连接酶、运载体。 【详解】（1）限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶都能连接黏性末端，另外T4DNA连接酶还可以连接平末端，因此图中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段（具有黏性末端）可以用E.coliDNA连接酶连接，EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成磷酸二酯键。 （2）将重组质粒导入动物细胞常采用显微注射法，步骤④以DNA为模板合成RNA，为转录过程。mRNA是翻译的模板，据图1可知，基因沉默复合物作用于Caspase8 mRNA，抑制了基因表达的翻译过程，使Caspase8基因沉默。 （3）测定mRNA含量时，需提取细胞总RNA，经过逆转录过程得到cDNA，再进行PCR扩增，通过PCR产物的量间接反映细胞中相关基因的mRNA含量；据图3可知，在序列2作用下，PCR产物量最少，推测Caspase8的mRNA含量最低，表明其抑制效果最好，是最优序列。 15．普通矮牵牛因缺乏蓝色色素合成所需的转座酶而不能开蓝色花，研究人员尝试把从蔷薇花瓣细胞中分离提取的转座酶F35H基因转入普通的矮牵牛，培育蓝色矮牵牛新品种，该过程所用的质粒与含转座酶F35H基因的DNA片段上相关限制酶的酶切位点如下图1和图2所示。已知限制性内切核酸酶BamHI、Sau3A I、Hind III识别的序列和酶切位点分别是、、，请分析并回答下列问题： (1)图1中质粒上还有一个没有标出的结构是 ，启动子的功能是 。 (2)用图中的质粒和转座酶F35H基因构建基因表达载体时，用来切割质粒和目的基因的限制酶是 。 (3)若将目的基因插入农杆菌Ti质粒的 中后用农杆菌感染矮牵牛细胞，则可将目的基因插入到植物细胞的 上。 (4)通过基因工程获得蓝色矮牵牛新品种的育种原理是 。相比传统的育种方法，基因工程育种的优点是 （答出1点即可）。 【答案】(1) 复制原点 驱动（基因）转录 (2)Hind III和Sau3A I (3) T-DNA 染色体DNA (4) 基因重组 能够按照人们的意愿定向改造生物的性状，能够打破物种间的生殖隔离 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）图1质粒标出了启动子、终止子、抗性标记基因，但没有标出复制原点。其中启动子的作用是启动转录，是RNA聚合酶结合的部位。 （2）由图1和图2可知，用图中质粒和转座酶F35H基因构建基因表达载体时，最好选用HindⅢ和Sau3AⅠ限制酶来分别切割质粒和含目的基因的DNA片段，因为质粒和目的基因都有这两种限制酶识别位点，并且切割后产生的黏性末端不同，不会出现自身环化现象，有利于质粒和目的基因结合，同时BamHI限制酶会破坏质粒上的标记基因，不宜采用。 （3）农杆菌转化法是将目的基因插到Ti质粒的T-DNA上，目的是利用T-DNA的可转移的特点将目的基因插入植物细胞的染色体DNA上，将目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先将目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T-DNA中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的染色体DNA上 （4）基因工程育种依据的原理是基因重组，与传统育种方法相比，基因工程育种的优点有时间短、克服远缘杂交不亲和的障碍、定向改造生物性状。 16．基因工程：制备新型酵母菌 (1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是 (填“细胞内”或“细胞外”)。 (2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A、B，已知酵母菌体内DNA有许多A－B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物 对目的基因进行PCR。 (3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因(UGA)常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒的物质。 Ⅰ.导入目的基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA基因，再重新导入。研究人员在UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C、C′序列，以便对UGA基因进行切除。C、C′的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式 进行连接。 Ⅱ.切去UGA基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。 (4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图 。 【答案】(1)细胞外 (2)P1和P6 (3) 缺乏尿嘧啶 2 含有5-氟乳清酸 (4)3 【分析】PCR技术： ①概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术； ②原理：DNA复制； ③条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）； ④方式:以指数的方式扩增，即约2n； ⑤过程：高温变性、低温复性、中温延伸。 【详解】（1）由于酵母菌不能吸收淀粉，所以导入分解淀粉的酶发挥作用的场所在细胞外。 （2）根据题干信息可知，当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同(都含有同源序列A、B)，需要选择P1和P6这对引物进行PCR。 （3）Ⅰ.选择了尿嘧啶合成基因(UGA)作标记基因，则应该将酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上培养，如果导入成功，则形成菌落；如果没有导入，则缺乏尿嘧啶，不能生存；方式一，C和C′方向相反，如果切割，则末端在一条链上，不能连接，所以选择方式二，连接方向相同，切割后形成末端，便于连接。Ⅱ.由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒的物质，所以应该在含有5-氟乳清酸的培养基上筛选切去UGA基因的酵母菌，如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。 （4）根据前面分析，C和C′的中间插入UGA，A和B之间插入的目的基因，所以图3正确。 学科网（北京）股份有限公司1 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$