4.1 基因工程赋予生物新的遗传特性 课件 2023—2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第一节　体液调节是通过化学信号实现的调节 第一节　体液调节是通过化学信号实现的调节 第四章 基因工程 第二节　神经系统通过下丘脑控制内分泌系统 第二节　神经系统通过下丘脑控制内分泌系统 第一节　基因工程赋予生物新的遗传特性 利用转基因大肠杆菌生产人胰岛素 那么，什么是基因工程？ 科学家是如何完成上述过程的呢？ 基因工程定义：有意识地把一个人们所需要的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要产物的技术。 其核心是构建重组的DNA分子，又称重组DNA技术。 （1）操作对象：基因 （2）操作水平：分子水平 基因重组 （3）基本原理： （4）操作结果： 产生新基因？ 赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品 被转移的基因仍然具有一定的独立性和完整性，其结构不变，只是位置改变 （5）优点： 克服远缘杂交不亲和，定向改造生物的遗传性状 单击此处编辑母版文本样式 基因工程诞生的理论基础包括： （1）DNA是遗传物质的证明 （2）DNA双螺旋结构的发现 （3）遗传信息的传递和表达的机制认定 （“中心法则”的确立） （4）遗传密码的破译 所有生物的DNA具有相同的化学组成（脱氧核苷酸）和空间结构（双螺旋结构）。 单击此处编辑母版文本样式 5’ 5’ 3’ 3’ 基因工程诞生的理论基础包括： （1）DNA是遗传物质的证明 （2）DNA双螺旋结构的发现 （3）遗传信息的传递和表达的机制认定 （“中心法则”的确立） （4）遗传密码的破译 所有生物的DNA具有相同的化学组成（脱氧核苷酸）和空间结构（双螺旋结构）。 即同一个基因在不同生物体内能够表达出相同的蛋白质。 各种生物共用一套遗传密码。 人的胰岛素基因在大肠杆菌细胞内能合成人的胰岛素。 单击此处编辑母版文本样式 工具 剪刀 胶水 分子运输车 限制性内切核酸酶： DNA连接酶： 载体： 准确切割DNA分子 将DNA片段连接起来 将重组DNA分子导入受体细胞 限制性内切核酸酶----“剪刀” 主要来自原核生物 数千种 ▲不是一种酶，而是一类酶。 来源 种类 特点 GAATTC CTTAAG 能识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每一条链特定部位的磷酸二酯键断开。 9 回文序列：一条链上按5'到3'读取的序列与其互补链上按5'到3'读取的序列一致。 识别序列长度 通常是4--8个核苷酸对 作用部位 特定切点上的磷酸二酯键 结果 产生黏性末端或平末端 GAATTC CTTAAG 限制性内切核酸酶----“剪刀” 思考一：用限制酶切割后的DNA分子，有几个黏性末端？这几个粘性末端有何特点？ 两个，黏性末端相同且它们之间正好能够互补配对。 11 　 黏性末端　　　　 黏性末端 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 12 相同的黏性末端 相同的黏性末端 限制性内切核酸酶----“剪刀” EcoR Ⅰ 中轴线 粘性末端 平末端 Sam Ⅰ 14 练习1 画出以下限制酶作用后产生的黏性末端。 ↓ BamHⅠ：5’-GGATCC-3’ ↓ BglⅠ：5’-AGATCT-3’ ↓ BstBⅠ：5’-TTCGAA-3’ 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ 5’-TTCGAA-3’ 3’-AAGCTT-3’ 练习2 请判断以下黏性末端是由几种限制酶作用产生的。 3种 用不同种限制酶切割不同的DNA分子，黏性末端可能互补配对吗？ 练习3： 限制性核酸内切酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC— 限制性核酸内切酶II的识别序列和切点是↓GATC— 下图表示含有某目的基因的DNA分子片段。 （1）若想将目的基因剪切下来，应选择何种限制性内切酶？ 切断4个磷酸二酯键,产生4个黏性末端 酶II （2）要想获得某个特定的基因，需要切断几个磷酸二酯键？产生几个黏性末端？ 酶切位点（Restriction Enzyme cutting site）：DNA上一段碱基的特定序列，限制性内切酶能够识别出这个序列并在此将DNA序列切成两段。 CTTCATG GAAGTACTTAA GAATTCCGTAGAATTCCGATT CTTAAGGCATCTTAAGGCTAA 用同一种限制酶来切割两种来源不同的DNA AATTCCGTAG GGCATCTTAA AATTCCCTAA GGGATT CTTCATGAATTCCCTAA GAAGTCTTAAGGATT AATTCCGTAG GGCATCTTAA 甲DNA片段（载体） 乙DNA片段 （含目的基因） 两个DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， 磷酸二酯键 DNA连接酶—— 基因的“胶水” DNA连接酶 ---- “胶水” 将双链 DNA双链片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。 作用 20 DNA连接酶 ---- “胶水” E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 从大肠杆菌中分离得到 只能链接互补黏性末端 从T4噬菌体中分离得到 黏性末端与平末端均可连接，但连接平末端的效率相对比较低。 种类 ★DNA连接酶没有识别特异性！ 21 限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键， 只是一个是切开，一个是连接 氢键的断裂与形成与限制酶、DNA连接酶无关。 名称 作用部位 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 切割DNA分子 DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链， 形成两条长链 归纳总结 几种相关酶的比较 23 24 名称 作用部位 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 切割DNA分子 DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链， 形成两条长链 归纳总结 几种相关酶的比较 25 运输车——载体 质粒、有些动植物病毒和噬菌体都可以作为载体，其中最常用的是质粒。 种类 用途 质粒、噬菌体 植物病毒 动物病毒 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞 将外源基因导入植物细胞 将外源基因导入动物细胞 质粒：独立于细菌拟核DNA之外的较小的环状DNA分子。 作用 将目的基因转入受体细胞； 在受体细胞内对目的基因进行大量复制 。 便于插入目的基因 运载体需具备的条件 ①含有复制起点，能够独立自主复制并稳定存在 ②有一个至多个限制酶酶切位点 ③具有标记基因，便于筛查含有重组DNA分子的细胞 标记基因的筛选原理 CTTCATG GAAGTACTTAA GAATTCCGTAGAATTCGGATT CTTAAGGCATCTTAAGCCTAA 用同一种限制酶来切割两种来源不同的DNA AATTCCGTAG GGCATCTTAA AATTCCCTAA GGGATT CTTCATGAATTCCCTAA GAAGTACTTAAGGGATT AATTCCGTAG GGCATCTTAA 甲DNA片段 乙DNA片段 质粒中的限制酶切位点 目的基因 只有这一种可能吗？ CTTCATG GAAGTACTTAA AATTCCCTAA GGGATT CTTCATG GAAGTACTTAA AATTCCGTAG GGCATCTTAA AATTCCGTAG GGCATCTTAA AATTCCCTAA GGGATT 。。。。。。 注意的事项 获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶，是为了？ 但是使用该法缺点是？ 为了避免上述情况发生，可采取的措施是？ 为了产生相同的黏性末端，便于连接 分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体 目的基因和质粒的自身环化 例题1.下图是四种不同质粒的结构示意图,其中ori为复制起点,ampr为氨苄青霉素抗性基因,tetr为四环素抗性基因,箭头表示一种限制性内切核酸酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA分子的细胞,应选用的质粒是(　　) C 例题2.在基因工程中,需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒,便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是 ,限制酶Ⅱ的识别序列和切割位点是 。根据下图判断,下列操作正确的是(　　) A.目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割 B.目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割 C.质粒用限制酶Ⅱ切割,目的基因用 限制酶Ⅰ切割 D.质粒用限制酶Ⅰ切割,目的基因用 限制酶Ⅱ切割 D 例题3.图甲、乙分别表示质粒和外源DNA,其中箭头表示相关限制酶的酶切位点。下列相关叙述正确的是(　　) A.用质粒和外源DNA构建重组质粒过程中,不能使用SmaⅠ切割 B.图甲所示的质粒分子在经SmaⅠ切割后含有4个游离的磷酸基团 C.为获取重组质粒,将切割后的质粒与目的基因片段混合,并加入DNA聚合酶 D.用EcoRⅠ、Hind Ⅲ和BamHⅠ中的任意一种酶切割质粒和外源基因都可以 A DNA的粗提取和鉴定 36 材料可否用鸡血？可否用兔血？ 不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。 37 38 保持平衡，防止仪器抖动，保护仪器 39 提纯DNA时，选用体积分数为95%的冷酒精的原因： ①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； ②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出； ③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。 防止DNA断裂，影响提取总量 作为对照 41 实验组 对照组 水浴加热 基因工程的基本操作程序: 1、获取目的基因、 2、构建重组DNA分子、 3、将重组DNA 分子导入受体细胞、 4、检测目的基因及其表达产物等。 目的基因的筛选与获取 知识回顾 必修二：请从DNA水平上给基因下一个定义，要求既能反映基因与DNA的关系，又能体现基因的作用。 基因通常是有遗传效应的DNA片段。 但一段DNA片段不一定是基因。 --A TGCATGC ATCGATGCTAGCGATCGC TAAGCAC AG--- --T ACGTACG TAGCTACGATCGCTAGCG ATTCGTG TC--- 基因1 基因2 非基因片段 45 编码蛋白质的核苷酸序列是不连续的，编码蛋白质的序列称为外显子，外显子之间不能编码蛋白质的序列称为内含子。 真核生物基因 1、非编码区： ①启动子： 位于基因的“上游”，有RNA聚合酶结合的位点，控制转录的开始 ②终止子： 位于基因末端，当RNA聚合酶到达时，释放出RNA产物，转录结束 2、编码区： 具有调控作用 非编码区 非编码区 编码区 与RNA聚合酶结合位点 外显子 内含子 1 2 3 4 5 加 工 mRNA前体 成熟mRNA 不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列 编码序列=外显子 1 2 3 4 5 启动子 终止子 转 录 原核生物基因 编码蛋白质的核苷酸序列是连续的。 非编码区 非编码区 编码区 信使RNA 基因的一条链 Ａ Ｂ Ｃ 原核生物基因 真核生物基因 非编码区 位置 作用 主要结构 编码区 位于基因的两端 对基因的表达起调控作用 启动子 终止子 与RNA聚合酶结合，控制转录的开始 当RNA聚合酶到达时，释放出RNA产物，转录结束 核苷酸序列是连续的，转录出的mRNA可直接作为翻译的模板 核苷酸序列是不连续的，分为外显子和内含子，两者均会被转录成mRNA前体，再在核内切去内含子对应部分，加工成为成熟的mRNA。   启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 化学成分 作用 DNA片段 mRNA上三个相邻碱基 DNA片段 mRNA上三个相邻碱基 RNA聚合酶识别和结合的部分，驱动转录的开始 决定转录的结束 翻译的起始信号 决定翻译过程的结束 （一）获取目的基因 1、目的基因：如：人的胰岛素基因、植物的抗病基因等。 根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。 如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 （2）目的基因的序列已知： 从基因文库获得 （1）目的基因的序列未知： 2、目的基因获取方法： 化学合成法 已经给了目的基因：利用PCR技术扩增 基因组文库 cDNA文库 基因组文库：含有某种生物全部基因片段的克隆群体。 （1）建立基因组文库 某生物所有DNA 特定的限制酶 基因组所有基因 每个基因和载体结合重组DNA分子 导入受体菌 基因组文库 基因组文库：含有某种生物全部基因片段的克隆群体。 （2）建立cDNA基因文库 双链DNA片段（cDNA） 某种生物的成熟mRNA 单链DNA 导入受体菌中储存 cDNA文库 逆转录酶 DNA聚合酶 与载体连接 真核细胞的cDNA的获取 编码区 非编码区 非编码区 DNA聚合酶 剪接有关的酶 RNA聚合酶 mRNA前体 mRNA 单链DNA cDNA 逆转录酶 转录 加工 逆转录 复制 启动子 终止子 基因 不含非编码序列。即不含非编码区和内含子 由于基因的选择性表达，不同组织细胞的cDNA文库是不同的，同一组织细胞在不同的发育阶段，cDNA文库也有差异。 例如，胰岛素基因的cDNA只能在由胰岛β细胞建立的cDNA文库中找到。 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 基因中启动子 基因中内含子 基因多少 小 大 无 有 无 有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 蛋白质的 氨基酸序列 mRNA的 核苷酸序列 基因的 核苷酸序列 目的基因 推测 推测 化学合成 DNA合成仪 ①前提：基因比较小、核苷酸序列已知 ③方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因 ②过程： （3）化学合成法 聚合酶链式反应（简称PCR）是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 优点：简单、快速、灵敏 应用：医学鉴定、法医鉴定、古生物学研究 （4）利用PCR技术扩增目的基因 前提: 要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列 解旋酶、DNA聚合酶 DNA的两条链 游离的4种脱氧核苷酸 ATP 1）模板： 2）原料： 3）能量： 4）酶： DNA复制的条件 解旋酶 DNA聚合酶 母链(模板链) 子链(新合成的链) 四种脱氧核苷酸 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 体外用高温代替！ 引物 解旋酶和高温都能使DNA的氢键断裂，使DNA的两条链解旋。 DNA聚合酶 61 （1）原理： DNA半保留复制 （2）条件（反应体系）： 模板： 原料： 酶： 引物： 四种脱氧核苷三磷酸 （dNTP）） DNA模板 （1）原理： DNA半保留复制 （2）条件（反应体系）： 耐高温的DNA聚合酶 （Taq DNA聚合酶） 四种脱氧核苷三磷酸 （dNTP） DNA模板 引物 稳定的缓冲溶液 （一般添加Mg2+） 含目的基因的DNA模板、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、缓冲液 PCR过程: DNA模板 4种脱氧核苷三磷酸 （dNTP） 耐高温的TaqDNA聚合酶 引物 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 5' 3' 变性90-95℃ 退火50-60℃ 延伸72℃ 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' ①变性 ②退火 ③延伸 反应过程：模板DNA双链在高温下（90~95 ℃）氢键断裂，解旋成2条DNA单链 温度降低（50~60 ℃）后，2个引物分别与各自互补的DNA单链结合 分别以两条DNA单链为模板，4种脱氧核苷三磷酸为原料，耐高温的Taq DNA聚合酶在适宜的温度（约72℃）下，以引物与模板形成的小段DNA双链区为起点，催化合成一条新的DNA互补链。 过程： （包括多次循环） 1.名称：脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、 脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧胸腺苷三磷酸(dTTP)。 dNTP既可以作为合成DNA子链的原料， 又可为DNA的合成提供能量。 四种脱氧核苷三磷酸（dNTP） 3.作用： 2.结构： dNTP 脱氧核苷酸 ATP （腺苷三磷酸） 引物 引物其实就是引子，是一小段单链DNA，是作为DNA复制的起始点，决定PCR扩增产物的特异性和长度。 1.概念： 2.引物的长度： 其长度常用的是15～30bp 过短导致特异性低。 过长导致其延伸温度过高，影响Taq DNA聚合酶活性。 3.引物的种类： PCR扩增时应有两种引物，即分别能与两条模板链配对的两种单链DNA。 4.结合位点： 5.设计引物的要求： 模板链的3’端 (天津）采用PCR技术扩增HSA基因。图3中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。 引物 引物其实就是引子，是一小段单链DNA，是作为DNA复制的起始点，决定PCR扩增产物的特异性和长度。 1.概念： 2.引物的长度： 其长度常用的是15～30bp 过短导致特异性低。 过长导致其延伸温度过高，影响Taq DNA聚合酶活性。 3.引物的种类： PCR扩增时应有两种引物，即分别能与两条模板链配对的两种单链DNA。 4.结合位点： 由于DNA复制只能是5'→3 '进行，而DNA的两条单链又是反向平行的。 5.设计引物的要求： 模板链的3’端 （江苏）设计引物是 PCR 技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（图 1），请分别说明理由。 ①第1组： ； ②第2组： 。 引物I和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 引物I’自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 引物 引物其实就是引子，是一小段单链DNA，是作为DNA复制的起始点，决定PCR扩增产物的特异性和长度。 1.概念： 2.引物的长度： 其长度常用的是15～30bp 过短导致特异性低。 过长导致其延伸温度过高，影响Taq DNA聚合酶活性。 3.引物的种类： PCR扩增时应有两种引物，即分别能与两条模板链配对的两种单链DNA。 4.结合位点： 由于DNA复制只能是5'→3 '进行，而DNA的两条单链又是反向平行的。 5.设计引物的要求： 要考虑长度、G/C碱基对的数目外，还要避免两个引物间发生互补，避免自身互补发生折叠等。 模板链的3’端 1.细胞内DNA复制时是否需要引物?为什么? 提示 需要。因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA单链,只能将游离的脱氧核苷酸连接在一条DNA单链的3'端,所以细胞内DNA复制时需要引物。 2.PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗? 提示 不是,PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。 3.经过第几轮扩增后,扩增出的含有目的基因的DNA片段才不含黏性末端?比例是多少? 提示 第三轮。1/4。 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 思考： PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？ PCR中的计算总结 1 2 3 n 2 4 8 2n 2 4 8 2n 2-1 4-1 8-1 2n-1 2-2 4-2 8-2 2n-2 4-2 8-2 16-2 2n+1-2 0 0 2 2n-2n 2 4 5 5 例题1.实验室常用PCR技术对DNA进行体外扩增,下列相关叙述正确的是(　　) A.温度在90~95 ℃时DNA的磷酸二酯键断开 B.引物与模板结合后向5'方向延伸 C.反应过程包括变性→退火→延伸 D.需要解旋酶和耐高温的Taq DNA聚合酶 C 例题2：PCR技术现在已经应用到临床诊断、法医鉴定、分子生物学、农牧业等领域。下图为某同学实验中，所用引物与模板配对情况（DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸）。下列说法正确的是 A．若用引物Ⅱ和Ⅲ进行该DNA分子扩增2次后可获得5种序列不同的产物 B．退火温度过高导致引物不能与模板牢固结合，PCR扩增效率下降 C．设计以上引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对造成引物自连 D．为方便构建重组DNA分子，可在引物中增加限制性内切核酸酶位点 BCD https://www.bilibili.com/video/BV1Fg4y1T7Kn/?spm_id_from=333.337.search-card.all.click&vd_source=7c1f23c7e42a3980d9f95f7f3ff17649 1.试剂 PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28-33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1-2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5-10μL 总体积 50μL PCR扩增DNA片段 2.用具 ①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增） ②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所） ③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） ④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） https://www.bilibili.com/video/BV1yh411F7qt/?spm_id_from=333.337.search-card.all.click&vd_source=7c1f23c7e42a3980d9f95f7f3ff17649 3.DNA片段的扩增方法步骤 移液 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 离心 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约30s，使反应液集中在离心管的底部 反应 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 *可根据目的片段长度适当调整延伸时间。 *退火时不一定均为引物与DNA模板结合，也存在DNA解开的两条单链的结合，因此一般在PCR实验中引物的投入量远大于产物量（但不能随意加大浓度）； 注意： 如何鉴定PCR产物是我们所需的DNA片段？ 电泳：带电粒子在电场作用下，向与其携带电荷相反的电极迁移的过程 原理：不同带点粒子因分子大小、形状、所带电荷等因素不同，迁移速度会有差异 电泳技术的应用：分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的常用方法 1、核酸是带有负电的生物大分子，其迁移速率主要受核酸片段长度影响。 在电场强度一定时，核酸分子越大，向正极迁移速率越慢。 2、电泳时常使用凝胶作为介质，凝胶的孔隙可起到分子筛的作用。 电泳分离、鉴定、纯化核酸的原理： 3、凝胶浸没于电泳缓冲液中。电泳缓冲液的作用是在电泳过程中维持合适的pH，并使溶液具有一定的导电性，利于核酸迁移。 4、DNA片段根据长度大小在凝胶上分开，形成不连续的条带，每个条带包含的DNA片段长度是相同的。（分离） 5、DNA本身是无色的，凝胶中的DNA分子可以用荧光或放射性染料对DNA进行标记，或使用亚甲基蓝将 DNA染成蓝色，在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 6.DNA相对分子质量标准物（DNA Marker）是一组已知长度的和含量的标准DNA片段混合物，在电泳中能作为参照物（鉴定）。不同的DNA Marker所含的DNA片段的长度和含量是不同的。 7.含有DNA条带的凝胶可以用刀片切割下来，回收凝胶中的DNA，从而达到提纯的目的。 琼脂糖凝胶电泳的操作步骤 制备琼脂糖凝胶 加样 电泳 溶化、倒模、凝固、加液 染色、观察 单击此处编辑母版文本样式 单击此处编辑母版文本样式 现有一长度为 3000 碱基对（bp）的线性 DNA 分子，用限制性核酸内切酶酶切后，进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶 H 单独酶切，结果如图 1。用酶 B 单独酶切，结果如图 2。用酶 H 和酶 B 同时酶切，结果如图 3。该 DNA 分子的结构及其酶切图谱是（ ） A． B． C． D． 单击此处编辑母版文本样式 DNA标记是DNA中一些稳定的特征性碱基序列。DNA中是否含特定的DNA标记，可通过DNA标记体外复制产物的电泳图谱来判断。已知三个个体的DNA标记电泳结果如图1所示，个体1和个体2的DNA标记组成分别为S1S1和S2S2，据图推断个体3的DNA标记组成为 。 基因工程的基本操作程序: 1、获取目的基因、 2、构建重组DNA分子、 3、将重组DNA 分子导入受体细胞、 4、检测目的基因及其表达产物等。 （二）构建重组DNA分子 目的：确保目的基因在受体细胞中稳定存在和表达，并且能遗传给下一代。 基因工程的核心步骤 结合图示，概述重组DNA分子构建的流程： （1）用限制酶切割载体，使它出现一个缺口； （2）用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，获取目的基因； （3）用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体缺口处，形成重组DNA分子。 练一练：图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。 （1）在基因工程的操作中，不宜选用Sma I，原因是Sma I会破坏__________和__________________________。 （2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoR I，原因是用EcoR I切割外源DNA片段后，________________________________________________________。 目的基因 质粒上的抗生素抗性基因 目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中 图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。 （3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入Pst I一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成？ 目的基因与目的基因连接的环状产物 质粒片段与质粒片段连接的环状产物 目的基因与质粒之间反向连接 质粒自身环化 目的基因自身环化 基因工程的基本工具 基因工程的基本工具 DNA连接酶 用一种限制酶切（单酶切） A T G C A A C G T T A T AGCTT A GGATCCA CCTAGGTTCGA Bt基因 图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。 （3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入Pst I一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成？ 目的基因与目的基因连接的环状产物 质粒片段与质粒片段连接的环状产物 目的基因与质粒之间反向连接 质粒自身环化 目的基因自身环化 基因工程的基本工具 用两种限制酶切（双酶切） 质粒与质粒连接后的运载体过大，导致转化难以发生，故不予考虑 避免自身环化，增大目的基因和运载体连接的概率 能避免反向连接 DNA连接酶 选择限制酶的方法 ①应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的酶切位点)切割。 基因工程的基本操作程序: 1、获取目的基因、 2、构建重组DNA分子、 3、将重组DNA 分子导入受体细胞、 4、检测目的基因及其表达产物等。 克隆载体与表达载体 克隆载体 表达载体 用于大量扩增外源DNA的载体 使目的基因既能扩增又能表达出相应蛋白质的载体 作为基因的克隆载体，需要哪些元件呢？ ①载体的区别 ②构件 作为基因的表达载体，需要哪些元件呢？ ①复制起点：复制的起始点 ②标记基因：具有筛选作用，以便能够通过表型鉴别含有载体的细胞。如抗生素抗性基因、荧光蛋白基因。 ③一种或多种限制酶的识别序列：便于插入目的基因 ④启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质 ⑤终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录 表达载体的元件组成： （三）将目的基因导入受体细胞是基因工程操作的第三步 1、受体细胞：接受目的基因的细胞，常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动、植物细胞等 2、基因导入方法：受体细胞类型不同，导入方法不同 转化受体细胞： 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 导入方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 ——显微注射法 ——制备感受态细胞 ——农杆菌转化法 （三）将目的基因导入受体细胞是基因工程操作的第三步 为何要把重组质粒导入受体细胞？ 受体细胞可以分为那些类型？依据他们的结构与功能推测， 导入方法相同吗? 如何选择受体细胞，才能让转基因猴全身体细胞都带有目的基因？ 培育抗虫棉时也必须选用这种细胞吗，为什么？ 107 ——Ca2+处理法制备感受态细胞 ② Ca2+处理法（感受态细胞法）的一般过程： 低温、低浓度Ca2+处理大肠杆菌 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。 将重组的基因表达载体导入其中 Ca2+的作用：增加细胞膜通透性 一般利用温度变化导入 ①受体细胞：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。 （1）将目的基因导入微生物细胞 繁殖快；多为单细胞；遗传物质相对较少 低温将大肠杆菌与重组DNA分子混合，热刺激 首先低温、用Ca2+ （低浓度CaCl2溶液）处理细胞,以增大细菌细胞膜的通透性（增强细菌捕获外源DNA的能力），使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞。第二步是将重组DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞（大肠杆菌）混合，在一定的温度（低温）下使外源DNA黏附于受体细胞表面，最后进行短暂的热刺激处理，使外源DNA转入细胞。 a.载体的种类 b.重组DNA的相对分子量（越大转化率越低）和浓度 c.细菌的种类、菌龄和密度 d.CaCl2处理的时间及热刺激的时间 ③ 影响细菌转化率的因素： 实例：利用转基因大肠杆菌生产药物 原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。 ①受体细胞：受精卵。因为受精卵容易表现出全能性。 ②过程： 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 （2）导入动物细胞 ——显微注射法 ①易感染双子叶植物和裸子植物； ②内含Ti质粒 当农杆菌侵染植物细胞后，Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的植物细胞中，并将其整合到该细胞的染色体DNA上。 农杆菌特点 （3）将目的基因导入植物细胞 -----农杆菌转化法（常使用） 几次拼接？几次导入？ （3）将目的基因导入植物细胞 -----农杆菌转化法（常使用） ⑥植物组织培养 ③农杆菌与植物细胞共培养（农杆菌感染植物细胞） ①获取Ti质粒 ②目的基因插入T-DNA，形成重组Ti质粒 ⑤筛选 ？ ④去除农杆菌 两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 ②影响植物细胞转化率的因素： a.农杆菌的种类和浓度 b.共培养的时间 c.植物的种类、基因型和生长状态 （3）将目的基因导入植物细胞（农杆菌转化法） ③目的基因导入植物细胞的其他方法： 电击法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法（原生质体） 生物种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法 显微注射法 Ca2+处理法、 感受态细胞法 受体细胞 体细胞、受精卵 受精卵 原核细胞 转化过程 利用农杆菌的Ti质粒构建重组DNA分子→重组DNA分子导入农杆菌→农杆菌侵染植物细胞→目的基因随T-DNA整合到植物染色体DNA中→植物组织培养培育出植株 将重组DNA分子提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 低温、低浓度CaCI2处理大肠杆菌细胞→大肠杆菌细胞的细胞膜的通透性改变→大肠杆菌与目的基因混合，热刺激→含有目的基因的重组质粒（DNA）进入大肠杆菌细胞 导入方法： 基因工程的基本操作程序: 1、获取目的基因、 2、构建重组DNA分子、 3、将重组DNA 分子导入受体细胞、 4、检测目的基因及其表达产物等。 （四）、检测目的基因及其表达产物是基因工程的第四步 检测和鉴定的四个方面: DNA、RNA、蛋白质、个体性状 检测DNA 检测RNA、蛋白质以及个体水平上是否出现相应性状 1.目的基因是否稳定存在： 2.目的基因是否正确表达： 检测内容及形式： (检测方法1)：观察测定个体是否表现出目的基因控制的特定性状（抗虫、抗病）并稳定遗传，是判断转基因成功的直接证据。需要进行抗虫、抗病接种实验。 (检测方法2)运用抗原-抗体杂交技术鉴定蛋白质 方法：以目的基因表达出的蛋白质为抗原，制备能与其特异性结合的并能被放射性或荧光标记的抗体。 利用抗原—抗体杂交技术检测转基因抗虫棉中的Bt基因是否表达出Bt抗虫蛋白： 抗虫棉 注意：转基因个体所提取的蛋白质作为抗原（被检测物） 人工制备的特异性标记抗体作为抗体（检测工具） （四）、检测目的基因及其表达产物是基因工程的第四步 检测和鉴定的四个方面: DNA、RNA、蛋白质、个体性状 检测DNA 检测RNA、蛋白质以及个体水平上是否出现相应性状 1.目的基因是否稳定存在： 2.目的基因是否正确表达： 检测内容及形式： (检测方法3)利用PCR技术检测 根据目的基因的序列设计引物 利用待检DNA为模板进行PCR 通过电泳或DNA测序技术鉴定PCR产物 单击此处编辑母版文本样式 (2)运用PCR技术鉴定 ①根据目的基因的序列设计PCR引物，利用待检DNA为模板进行PCR。 ②通过电泳或DNA测序技术鉴定PCR产物。 步骤： PCR鉴定引物设计方案是： ①选取载体上的一个引物和插入序列的一个引物（图A），扩增出的片段大小应该是载体引物到结合位点的长度加上外源片段，②很多人喜欢直接用外源片段上的两个引物扩增(图B)，这种方法会有很多的假阳性，因为在转化过程中可能会有很多的外源片段残留在待测样品中 标记基因的筛选原理 (检测方法4)借助载体上的标记基因检测 (检测方法4)借助载体上的标记基因检测（阅读P117第二段回答） 质粒 问题1：该质粒有几个标记基因，作用是什么？ 问题2：目的基因插入到哪个位置？目的是什么？ 问题3：用于筛选的选择培养基是固体还是液体？培养基中应加入哪些特殊的物质用于筛选？ 问题4：用作受体的大肠杆菌自身能否含有上述两种标记基因？ 问题5：在培养基上培养的结果如何？ 培 养基 蓝白斑筛选 (检测方法5)利用核酸分子杂交技术检测 原理：两个不同来源核酸单链的核苷酸之间碱基互补配对 ①核酸探针：是带有放射性或荧光标记的具有特定核苷酸序列的DNA或RNA ②过程： 使待检的DNA变性成单链并固定在硝酸纤维素膜上 加入 探针 漂洗硝酸纤维素膜去除未互补结合的探针 检测硝酸纤维素膜的放射性或荧光 单击此处编辑母版文本样式 类型 检测内容 方法 分子水平的检测 个体水平的鉴定 受体细胞是否有目的基因 目的基因是否转录出了mRNA 利用标记基因、 PCR、核酸分子杂交 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原-抗体杂交 个体是否具有相应性状 病原体接种实验等 核酸分子杂交 （四）、检测目的基因及其表达产物是基因工程的第四步 1.(2015浙江10月选考)科研人员拟将已知的花色基因(目的基因)转入矮牵牛的核基因组中,培育新花色的矮牵牛。请回答: (1)为了获得大量的目的基因,将其与含有抗生素抗性基因的质粒DNA形成重组DNA,再与经 (A.氯化钙　B.氯化钠　C.蔗糖　D.葡萄糖)处理的大肠杆菌液混合,使重组DNA进入大肠杆菌。用 的玻璃刮刀将稀释后的大肠杆菌液 接种到含有抗生素的固体培养基上,经培养形成 ,再进行鉴定和扩大培养。 (2)从扩大培养的大肠杆菌中提取含有目的基因的DNA,用 分别切割含目的基因的DNA和农杆菌的Ti质粒,然后用DNA连接酶连接,形成重组DNA并导入农杆菌。 (4)将消毒后的矮牵牛叶片剪成小片,在含有目的基因的农杆菌溶液中浸泡后,取出并转移至加有适当配比生长调节剂的MS培养基(含蔗糖、琼脂和抗生素,下同)上,使叶小片先脱分化成   ,再将其转移至另一培养基诱导形成芽,芽切割后转移至 上生根,形成完整植株。 A. LB培养基　 B. MS培养基+适宜浓度NAA　 C. MS培养基+适宜浓度BA　 D. NAA/BA小于1的MS培养基) (5)取出试管苗,在适宜的光照、温度和80%以上的 等条件下进行炼苗。提取叶片组织的DNA,采用PCR技术 目的基因,鉴定目的基因是否成功导入。 真题回顾 A 灭菌（无菌） 涂布 （单）菌落 同种限制性酶 愈伤组织   B 扩增 湿度 （1） （2） (3)某小组应用基因工程方法开展适用于该生态工程的抗虫植物改良研究。为提高将重组DNA分子导入受体细胞的效率，除考虑导入方法、筛选条件、防止污染外，还需考虑的主要因素有 （答出2点即可）。农杆菌介导法是目前植物转基因的常用方法，该方法的基本过程是农杆菌感染植物时， 并将其插入到受体细胞的基因组中。欲获得稳定遗传的抗虫性强的转基因植物品种，则转入的抗虫基因必须能在受体细胞中 。 （二）某农业生态工程示意图如下，回答下列问题： 重组DNA的质量和浓度、受体细胞的 携带目的基因的T-DNA片段转移到受体细胞 稳定存在并高效地表达 2.（2018年11月 ） 生长状态与密度 3.（2020年1月）（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题： （1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经_______处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。然后测定该原生质体的活性，可采用的方法有___________________（答出2点即可）。 （2）若要获得已知序列的抗病基因，可采用________或PCR的方法。为了提高目的基因和质粒重组的成功率，选择使用_________________，对含目的基因的DNA片段进行处理，使其两端形成不同的粘性末端，对质粒也进行相同的处理，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中_____，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。 （3）原生质体在培养过程中，只有重新形成____________后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过________ 或器官发生的途径再生植株。 过滤灭菌 染色法、渗透吸水法 化学合成 两种限制酶 扩增 细胞壁 胚胎发生 （二）回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题： （1）通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白（可作为抗原），可通过 技术获得特异性探针，并 将 中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的基因。 （2）将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测 （A．质粒载体 B．转录产物 C．抗性基因 D．病原微生物） （3）植物细胞在培养过程中往往会发生 ，可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入 。并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用 培养建立的细胞系用于筛选，则可快速获得稳定遗传的抗病植株。 （3）用抗病品种与高产品种进行杂交育种过程中，有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株，可采用的方法是 。 单克隆抗体 基因文库 B 变异 高浓度致病真菌 花药离体 胚的离体培养 （2019年4月选考） 5.（2020年6月）（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题： （1）天然农杆菌的Ti质粒上存在着一段DNA片段（T-DNA），该片段可转移并整合到植物细胞染色体上。为便于转基因植物在组织培养阶段的筛选，设计重组Ti质粒时，应考虑T-DNA中要有可表达的目的基因，还需要有可表达的__________。 （2）结合植物克隆技术进行转基因实验，为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、_____________及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。若植物材料对农杆菌不敏感，则可用__________的转基因方法。 （3）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程与利用茎段诱导产生愈伤组织再获得丛状苗的过程相比，前者总培养时间__________，且不经历__________过程，因而其遗传性状稳定，是大多数植物快速繁殖的常用方法。 抗性基因 全能性表达充分 显微注射 短 脱分化 2022年1月选考（二）我国在新冠疫情防控方面取得了显著的成绩，但全球疫情形势仍然非常严峻，尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。（1）新冠病毒核酸定性检测的原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用 酶合成DNA，经 PCR扩增，然后在扩增物中加入特异的 ，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。（2）接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的 基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的 。将腺病毒复制基因敲除的目的是 。（3）单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体制备原理是：取免疫阳性小鼠的 细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和 。 逆转录 核酸探针 抗原 载体 使腺病毒失去复制能力 脾 动物血清 课后练习 Lavf58.20.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.3.79 Lavf57.83.100 $$