1.2 纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得课件-2023-2024学年高二下学期生物浙科版（2019）选择性必修3

第一章 发酵工程 第二节 纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得 由不同微生物个体繁殖后代组成的大片菌落 ? 接种：微生物进入培养基质的过程。 自然接种：牛奶暴露在空气中，会由于微生物落入、生长、繁殖而变质。 人为接种：挑取目标微生物的纯种将其转移到液体培养基中培养，或在培养基斜面连续划线用于保存菌种（接种环）。 一、采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化 单菌落：在固体培养基上通过接种、培养获得的由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团。 平板划线法 稀释涂布平板法 1.平板划线法 2.稀释涂布平板法 （一）单菌落分离方法 1．平板划线法 (1)原理 ： (2)工具： (3)划线方式： 接种环划线的过程中，菌液被逐渐分散，最终出现单个细菌，形成单菌落。 连续平行划线、扇形划线、多次连续平行划线 接种环 思考1：不同划线方式下单菌落一般出现在划线的什么位置？ 思考2：不同划线方式下接种环何时灼烧？ 1.平板划线法 第1区划线 接种环灭菌 第2区划线 接种环灭菌 第3区划线 接种环灭菌 接种环灭菌 1 2 3 4 5 多次连续平行划线法 思考：若完成图示操作，共做了五次划线，接种环灼烧灭菌了几次？ 平板划线操作中三种灼烧的目的不同 1.蘸取菌液前灼烧 2.每次划线前灼烧 3.划线操作结束后灼烧 避免接种环上可能存在的微生物污染菌种。 杀死残留菌种，保证每次划线接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端；能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者。 避免灭菌后接种环的高温烫死菌种 注意不要划破培养基： ①一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的； ②二是存留在划破处的单个细胞会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。 每次实验：划3个平板（重复实验）1个不接种（空白对照） 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 7 将平板倒置，放入培养箱培养： 防止皿盖上的水珠落入培养基，影响菌落形成，造成污染。 用接种环蘸菌液____次，在固体培养基表面划线，下一次划线应从上一次划线的______开始。每次划线前接种环要 ，聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，可以在划线的末端出现不连续的 。若共划线五次，接种环要烧灼____次。另外：每次划线都不能与之前的线条_____；不能将最后一次划线与第一次划线相连；不能_____培养基。培养基需 后，放入培养箱培养。 划破 重叠 6 末端 1 灭菌 单菌落 倒置 注意：1.无论是何种划线法，蘸取菌种前和划线后，接种环都要灼烧灭菌。 2.无论是何种划线法，菌种只蘸取一次。 思考 例题1.微生物接种的方法很多,平板划线法是常用的一种。下图是平板划线示意图,划线的顺序为①②③④。下列相关叙述错误的是(　　) A.划线操作时,将蘸有菌种的接种环插入培养基 B.平板划线后,培养微生物时要倒置培养 C.不能将第④区域的划线与第①区域的划线相连 D.在第②~④区域中划线前都要对接种环进行灭菌 A 划线时不能将接种环插入培养基,而是在培养基表面划线 例题2.下列有关分离酵母菌实验操作的叙述,错误的是(　　) A.在第二次划线时,接种环上的菌种直接来源于菌液 B.第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 C.每次划线前,灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种 D.划线结束后,灼烧接种环能及时杀死接种环上的菌种,避免细菌污染环境和感染操作者 A 例3：在分离、纯化大肠杆菌实验中，划线接种 （甲）、培养结果（乙）如图所示。 有关叙述错误的是 （ ） Ａ．接种前应对培养基进行高压蒸汽灭菌 Ｂ．连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落 Ｃ．接种过程中至少需要对接种环灼烧 ５ 次 Ｄ．甲中 ａ 区域为划线的起始位置 D 例4： 若实验室为分离纯化优良菌种进 行如下操作，排序最合理的是 （ ） Ａ．②①④③ Ｂ．②①④①③② Ｃ．②①④②③② Ｄ．①④①③② B （2）稀释涂布平板法 a.原理 ：用无菌水将菌液进行一系列的梯度稀释，在适当的稀释度下，可培养得到相互分开的单菌落。 单击此处编辑母版文本样式 b.过程： 稀释菌液 涂布 培养 吸取1ml细菌培养液加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10-1的稀释液，依次方法得到10-5 ~ 10-7稀释液。 b.过程： 稀释菌液 涂布 培养 吸取1ml细菌培养液加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10-1的稀释液，依次方法得到10-5 ~ 10-7稀释液。 在培养皿侧面或底面做好标记后,用移液枪取0.1ml稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上。再将涂布器放在酒精灯火焰上灼烧，待涂布器冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。 b.过程： 稀释菌液 涂布 培养 吸取1ml细菌培养液加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10-1倍的稀释液，依次方法得到10-5 ~ 10-7倍稀释液。 在培养皿侧面或底面做好标记后,用移液枪取0.1ml稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上。再将涂布器放在酒精灯火焰上灼烧，待涂布器冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。 将培养皿倒置，在37℃恒温箱中培养24~48h。 活动：接种、培养并分离酵母菌 单击此处编辑母版文本样式 二、活动：接种、培养并分离酵母菌 获得_________后，可挑取菌落，并用 接种至斜面培养基中。 单菌落 平板划线法 目的：保存菌种 平板划线法 稀释涂布平板法 单击此处编辑母版文本样式 液体培养基接种 目的：扩大培养 培养:将所有培养容器置于______℃下培养24 h。 25 液体培养基： 平板培养基： 恒温摇床、振荡培养 恒温培养箱、倒置培养 恒温摇床 单击此处编辑母版文本样式 平板划线法 稀释涂布平板法 接种工具 接种环 涂布器 优点 操作简单 菌落更易分开；可以计数 培养结果 共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征 两种分离、纯化菌种方法的比较 例7：划线分离法和涂布分离法是接种微生物的两种常用方法，下列描述正确的是 （ ） Ａ．都要将菌液进行一系列的梯度稀释 Ｂ．划线分离法是将不同稀释度的菌液通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作 Ｃ．涂布分离法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基进行培养 Ｄ．都能在培养基表面形成单个菌落 D 例题8： （ 温州十校联合体期初联考）有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。 某同学欲从污染的土壤中筛选出高效降解原油的菌株。 请回答下列问题： （１）在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以 为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于 培养基。 （２）纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有 和 。 常用的操作工具分别是 和 。 （３）为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小， 分解圈大说明该菌株的降解能力 。 （４）实验室常用的灭菌方法有过滤灭菌法、 和 。 无菌技术要求实验操作应 附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。 原油 选择 平板划线法 稀释涂布平板法 接种环 涂布器 强 灼烧灭菌 高压蒸汽灭菌 酒精灯火焰 例题9：图甲、图乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题： （１）图甲是利用 法进行微生物接种，图乙是利用 法进行微生物接种。 （２）这两种方法所用的接种工具分别是 和 ； 对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是灼烧和酒精消毒。 （３）下图是采用上述接种方法接种后培养的效果图解，其接种方法是 （填“图甲”或“图乙”）。 （4）下列关于微生物培养和利用的叙述不正确的是（ ） 。 Ａ．利用图乙所示接种法可以分离微生物但不能对微生物进行计数 Ｂ．接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单菌落 Ｃ．以尿素为唯一氮源的培养基可分离出能利用尿素的细菌 Ｄ．图乙所示接种法中使用的接种工具须保存在酒精中 平板划线 稀释涂布平板 接种环 涂布器 图乙 A 某同学尝试过程③的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图乙所示。 该同学的接种方法是 ； 推测该同学接种时可能的操作失误是 。 稀释涂布平板法 涂布不均匀 思考： 无法计数 159 17 2 0 无法计数 141 13 1 0 无法计数 150 11 3 1 9ml 无菌水 加入0.1ml稀释液 分离、计数微生物——稀释涂布平板法 例：将1g土样加到盛有99ml无菌水的三角瓶中，如图进行稀释，每个稀释度涂布三个平板，根据结果计算1g土样中菌的数量？ 注意： 1.分离得到单菌落一般以培养皿中有20个以内菌落为宜。 2.计算微生物数量一般以培养皿中有30~300个菌落为宜。 无法计数 159 17 2 0 无法计数 141 13 1 0 无法计数 150 11 3 1 9ml 无菌水 加入0.1ml稀释液 分离、计数微生物——稀释涂布平板法 例：将1g土样加到盛有99ml无菌水的三角瓶中，如图进行稀释，每个稀释度涂布三个平板，根据结果计算1g土样中菌的数量？ （159+141+150）÷3÷0.1×105 =1.5×108个/g 每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)； M代表稀释倍数 例.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) （ ） A.2.34×108 B.2.34×109 C.234 D.23.4 B 分离、计数微生物——稀释涂布平板法 分离、计数微生物——稀释涂布平板法 无法计数 159 17 2 0 无法计数 141 13 1 0 无法计数 150 11 3 1 9ml 无菌水 0.1ml 例：计算1ml菌液中菌落数？ （159+141+150）÷3÷0.1×103 =1.5×106个/g Q：统计的菌数往往比活菌的实际数目要？ 少。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 一、如何分离得到微生物成分？ 二、如何测定微生物数量？ 1.平板划线法 2.稀释涂布平板法 1.稀释涂布平板法 2.显微镜计数法（需用到血细胞计数板） 二、稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量 1. 稀释涂布平板法（可计数活菌） 每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)； M代表稀释倍数 计数原理：利用特定血细胞计数板，在显微镜下观察计数一定体积的样品中微生物的数量。 二、稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量 2.显微镜计数法 单击此处编辑母版文本样式 1. 每个血细胞计数板的正中央有2个计数区（图上红圈内），任选一个区。每个计数区分9个大方格，中央为红细胞计数区，4个角为白细胞计数区。 认识血细胞计数板 2. 中间的红细胞计数区共25个中方格（蓝色圈内），每个中方格又分为16个小方格，红细胞计数区内共400个小方格（黑点）。 上下玻璃 间距0.1mm 计数区 计数区 红细胞计数区 V红=1mm*1mm*0.1mm 16中*25小 单击此处编辑母版文本样式 第 4 天 红细胞计数区 “五点取样” ①压线：数上不数下，数左不数右 ②3次计数后取平均值 单击此处编辑母版文本样式 血细胞计数板计数时不能区分死菌和活菌。 35 https://www.bilibili.com/video/BV15d4y1F7WB/?spm_id_from=333.337.search-card.all.click&vd_source=7c1f23c7e42a3980d9f95f7f3ff17649 若计数室为1mm×1mm×0.1mm方格，由400个小方格组成，如果一个小方格内酵母菌过多,难以计数,应先_______后再计数。若多次重复计数后，算得每个小方格中平均有5个酵母菌，则10mL该培养液中酵母菌总数有________个。 稀释 2×108 Q：统计的菌数往往比活菌的实际数目要？ 偏大，不能区分死菌和活菌 思考： 单击此处编辑母版文本样式 红细胞计数区由25×16=400个小方格组成，容纳液体的总体积为0.1 mm3。现将1 mL酵母菌样品加99 mL无菌水稀释，用无菌吸管吸取少许摇匀的酵母菌悬液滴在盖玻片边缘，使其自行渗入计数区，并用滤纸吸去多余菌液。现观察到图中所示a、b、c、d、e5个中方格内共有酵母菌44个，则上述1 mL酵母菌样品中约有菌体(　　) 换算为一个大方格（0.lmm³）稀释液中的菌株数 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法 主要用具 显微镜、血细胞计数板 培养基 计数依据 菌株本身 培养基上的菌落数 优点 计数方便、操作简单 计数的都是活菌 缺点 死菌活菌都计算在内 操作复杂，有一定误差 计算公式 1ml原液含菌株数=每小格平均菌株数×400×10×1000×稀释倍数 lml原液含菌株数= 平均菌落数÷涂布平板所用稀释液体积 x 稀释倍数 微生物的数量测定 换算 1mm3稀释液中的菌株数 换算 1ml稀释液中的菌株数 换算 1ml原液中的菌株数 活动：能分解尿素的微生物的分离与计数 1、实验原理 当培养基中只有尿素作为氮源时，只有能分泌脲酶的微生物才能在该培养基中生长。 尿素（脲）是蛋白质降解的产物，会对环境造成污染。 植物无法直接吸收利用尿素。 土壤中某些细菌能分泌脲酶，可通过降解尿素作为其生长所需的氮源。 活动：能分解尿素的微生物的分离与计数 1、实验原理 当培养基中只有尿素作为氮源时，只有能分泌_________的微生物才能在该培养基中生长。 脲酶 尿素 中性 碱性 氨 根据菌落周围是否出现_________区域，进一步鉴定尿素分解菌。在相同培养条件下，圆形红色区域愈大，表明这种菌利用尿素的能力________。 红色 越强 黄色 红色 Q：真的只有尿素分解菌能生长么？如何确定？ 酚红 指示剂 2、实验目的要求 尿素培养基(以尿素为唯一氮源的培养基) 3、实验材料用具 土壤样品，蛋白胨，酵母提取物，NaCl，琼脂，琼脂糖，葡萄糖，K2HPO4，酚红，蒸馏水，尿素溶液，三角瓶，烧杯，培养皿，有塞试管，试管架，移液器，G6玻璃砂漏斗，装有75%酒精的广口瓶，涂布器，酒精灯，火柴，高压灭菌锅，恒温培养箱等。 从有哺乳动物排泄物的地方取得土样 琼脂含氮， 琼脂糖为纯净物，不含氮 对尿素进行过滤灭菌 ①制备培养基 4、实验步骤 ②灭菌 ③倒平板 ④制备土壤细菌悬液 ⑤接种---涂布分离 ⑥培养 ⑦观察 这里注意强调两个培养基的区别，一个上面所有的菌都可以生长，一个上面只能长以尿素为氮源的菌。 4、实验方法步骤 （1）制备培养基 LB全营养培养基 蛋白胨：1g 酵母提取液0.48g NaCl：1g 琼脂：2g 尿素培养基 葡萄糖： 0.1g NaCl： 0.48g K2HPO4： 0.48g 琼脂糖： 2g 酚红： 1mg 对照组 实验组 尿素在制备培养基阶段先不加 置于250mL三角瓶，加水至100 mL，三角瓶加上封口膜待灭菌 置于250mL三角瓶，加水至60mL， 三角瓶加上封口膜待灭菌 培养基灭菌 器具灭菌 蒸馏水灭菌--制备无菌水稀释细菌悬液 操作环境灭菌 （2）灭菌 ①LB固体培养基 高压蒸汽灭菌（121℃，1kg/cm2,15-20min） ②尿素固体培养基 G6玻璃砂漏斗过滤除菌（尿素） 培养基灭菌 高压蒸汽灭菌 （112℃，500g/cm2,30min） （2）灭菌 （3）倒平板 培养基冷却至60 ℃，超净工作台内向尿素固体培养基中加入已灭菌的尿素溶液，摇匀后分装至4个培养皿，冷却至凝固。 酒精灯旁 9ml无菌水 1g土壤 10-3, 10-4... 得10-2菌悬液 99ml无菌水 （4）制备土壤细菌悬液 Q1:取得土样后需要灭菌（ ） × Q2:欲获得土壤中微生物，需要将土样放入水中震荡，使微生物分布在水中。此处所用的水要用（ ） A、自来水 B、蒸馏水 C、无菌水 D、都可以 C （4）制备土壤细菌悬液 (5)接种 ①标记（班级、姓名、日期、接种稀释度、LB或尿素） ②手、超净工作台消毒 ③涂布：用移液器按照稀释度由大到小的顺序依次取土壤稀 释液0.1ml，并在酒精灯火焰旁分别加入对应标记的培养皿 中用涂布器将稀释液均匀地涂布在培养基表面。 如果先取用稀释度小的溶液，微生物浓度大，再用同一移液器吸取稀释度大的菌液，就会提高后者的细菌数目，从而导致较大的统计误差。 单击此处编辑母版文本样式 不按照稀释度由大到小的顺序依次操作会影响实验结果。如果先取用稀释度小的溶液，微生物浓度大，再用同一移液器吸取稀释度大的菌液，就会提高后者的细菌数目，从而导致较大的统计误差。 （6）培养 倒置，37℃，24-48h 5.实验结果： LB培养基 尿素培养基 在估算土壤中能分泌脲酶的微生物的数量时，应统计哪个稀释度的培养皿?为什么? 应统计稀释度为10-3的3个培养皿中的菌落数后取平均值。 因为这个浓度的培养皿中菌落数比较适中，计数的结果误差较小。 5.实验结果： LB培养基 尿素培养基 这些微生物能够合成脲酶而将尿素分解成氨。氨可使培养基的碱性增强，使含酚红指示剂的培养基变成红色。 合理，因为自生固氮微生物能在固氮酶的作用下，将N2转化为可利用的氮源，故可在没有氮源的培养基上生长。 课后练习 Lavf58.46.101 Lavf58.51.100 $$