2025届高三生物一轮复习导学案基因工程的基本工具及操作程序

第10部分第6节《基因工程的基本工具及操作程序》-2025届高考一轮复习-基础摸查+基础夯实+优化提升 基础摸查 【真题导入】 1．为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是(　　) A．①＋③ B．①＋② C．③＋② D．③＋④ 2．下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是(　　) A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近 B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂 C．预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNA D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热 3．某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　) A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间 C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度 4. 纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题： (1)纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由________________组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是_______________________________________。 (2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是__________________。 PCR扩增时，需在__________催化下，在引物__________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 (3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X－GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y－M重组质粒(在EcoRV位点插入片段)。请完成下表。 分步实验目标 简易操作、结果、分析 PCR鉴定正向重组质粒Y－M(图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向) ①选择图Ⅱ引物__________； ②PCR目的产物约为__________bp 确保M及连接处序列正确，Y－M的连接处上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的识别序列 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是__________(选填序列编号) 检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明__________________________________ (4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经______________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的__________倍。 【考点陈列】 考点一　重组DNA技术的基本工具 1．基因工程的概念 别名 ________技术 操作环境 生物体外 操作对象 操作水平 ________水平 结果 创造出更符合人们需要的新的________________和________________ 2.基因工程的诞生和发展 (1)肺炎链球菌转化实验不仅证明DNA是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间________。 (2)DNA双螺旋结构的提出和______________的证明。 (3)中心法则的确立。 (4)________________的破译。 (5)基因转移载体和___________的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。 (6)________体外重组的实现。 (7)重组DNA表达实验的成功。 (8)DNA测序和合成技术的发明。 (9)________技术的发明。 (10)___________技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。 3．重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) (2)DNA连接酶 (3)载体 拓展1： 构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。 已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是，限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是，根据图示分析回答下列问题： (1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。 (2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。 ___________________________________________________________拓展2：图解限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 考点二　基因工程的基本操作程序 1．目的基因的筛选与获取 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞_______________或获得预期________________等的基因。 (2)筛选合适的目的基因 ①从相关的已知________的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用________________和序列比对工具进行筛选。 (3)目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②PCR________和扩增目的基因 a．PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据________的原理，在体外提供参与DNA复制的各种________与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行________________的技术。 b．PCR反应的条件：一定的________、DNA模板、2种________、4种________、_______DNA聚合酶，以及能自动调控_________的仪器。 c．PCR扩增的过程 d．PCR产物的鉴定：常采用________________来鉴定。 ③通过构建____________来获取目的基因。 2．基因表达载体的构建——基因工程的核心 (1)目的：使目的基因______________，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成及作用 (3)构建过程 注意：启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 DNA DNA mRNA mRNA 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸) 3.将目的基因导入受体细胞 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法、___________ 显微注射法 ____处理法 受体细胞 原核细胞 转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 辨析： (1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。 (2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。 4．目的基因的检测与鉴定 拓展： PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。在该过程中，引物非常关键，回答下列有关引物的问题： (1)什么是引物？ ___________________________________________________________ (2)PCR技术为什么需要引物？ ___________________________________________________________(3)利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么？ ___________________________________________________________(4)在PCR扩增目的基因之前，需先设计引物，对设计的两种引物之间的碱基序列的要求是什么？ ___________________________________________________________(5)为检测胚乳细胞中Wx基因是否表达，科研人员提取胚乳中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是什么？ ___________________________________________________________(6)若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？ ___________________________________________________________ 考点三　DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 1．DNA的粗提取与鉴定 (1)基本原理 (2)操作流程 注意：加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。 2．DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)实验基础 ①PCR原理：利用了________________原理。 ②电泳：DNA分子具有可解离的基团，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷______的电极移动，这个过程就是电泳。 ③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的________________等有关。 (2)PCR实验操作步骤 (3)DNA的电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为______的紫外灯下被检测出来。 拓展： 1．在“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验中，防止DNA被污染的操作有哪些？ ___________________________________________________________2．如何来评价扩增的效果？ ___________________________________________________________ 【考点专攻】 考点一　重组DNA技术的基本工具 1．质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是(　　) A．质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子 B．在所有的质粒上都能找到一个或多个限制酶切割位点 C．携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制 D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择 2．下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断，下列说法错误的是(　　) 限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点 BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG 注：Y为C或T，R为A或G。 A．HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端 B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部 C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端 D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列 归纳： 与DNA有关的几种酶的比较 考点二　基因工程的基本操作程序 3．大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述错误的是(　　) A．PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译 B．单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变 C．第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR产物DNA的两条链 D．利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程 4．下图表示培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是(　　) A．过程A需要限制酶和DNA聚合酶的参与 B．过程B需要用CaCl2处理，以提高番茄细胞细胞壁的通透性 C．抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上，就能正常表达 D．转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通过抗病毒接种实验进行鉴定 归纳： (1)PCR技术和DNA复制的比较 (2)PCR扩增过程中的循环图示与规律 循环次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物A(或B)的DNA分子数 1 3 7 2n－1 同时含引物A、B的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗的引物数量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2 考点三　DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 5．下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图。下列相关叙述不正确的是(　　) A．选用植物细胞提取DNA时需先研磨破碎细胞 B．图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显 C．图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精 D．图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂出现蓝色 6．下列以洋葱为实验材料进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是(　　) A．洋葱研磨液需要用滤纸过滤，以保证提取的DNA量 B．滤液中加入冷酒精后，用玻璃棒搅拌会使DNA的提取量增加 C．向含DNA的滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液有利于去除杂质 D．用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化 基础夯实 1．判断关于基因工程的基本工具的叙述 (1)限制酶只能用于切割目的基因(　　) (2)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(　　) (3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(　　) (4)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因(　　) 2．判断关于基因工程的基本操作程序的叙述 (1)根据不同的需要，目的基因是不同的，但都是能编码蛋白质的基因(　　) (2)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制(　　) (3)表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点(　　) (4)PCR反应中温度的周期性改变是为了使DNA聚合酶催化不同的反应(　　) 3．判断关于DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定的叙述 (1)进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃条件下储存(　　) (2)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关(　　) (3)为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换(　　) (4)DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，遇甲紫会呈现红色(　　) 4．填空默写 (1)(选择性必修3 P67)基因工程：___________________。 (2)(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的________序列，并且使每一条链中特定部位的______________________断开。 (3)(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因，便于__________。 (4)(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供_______、________、4种_______和耐高温的_________。 (5)(选择性必修3 P80)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有________________等。 (6)(选择性必修3 P81)转化：_____________________。 优化提升 一、选择题 1．T4 DNA连接酶可将任意2个具有相同黏性末端的DNA片段连接在一起。该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸(AMP)通过共价键与酶相连，随后AMP转移至DNA片段，进而完成连接反应。下列叙述正确的是(　　) A．T4 DNA连接酶的底物种类较多，故其无专一性 B．T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分已改变 C．ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键 D．T4 DNA连接酶需保存于最适温度和pH条件下 2．如图表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相关的酶作用位点。下列叙述错误的是(　　) A．甲、乙、丙都属于黏性末端 B．甲、乙片段可形成重组DNA分子，但甲、丙不能 C．DNA连接酶的作用位点在图乙中b处 D．切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子 3．基因工程利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性内切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点分别如图所示。下列分析错误的是(　　) A．构建重组DNA时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体 B．构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体 C．图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有两个游离的磷酸基团 D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA 4．下列有关获取目的基因的叙述，错误的是(　　) A．目的基因就是编码蛋白质的基因 B．筛选和获取目的基因是基因工程的第一步 C．来自苏云金杆菌的Bt基因可作为转基因抗虫棉的目的基因 D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会 5．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　　) A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 6．如图是快速RT－PCR过程示意图，①和②为逆转录酶催化的逆转录过程，③是PCR过程。据图分析，下列叙述错误的是(　　) A．逆转录酶具有DNA聚合酶的能力 B．③PCR过程只需要引物b C．RT－PCR可检测基因表达水平 D．RT－PCR可检测新冠病毒等RNA病毒 7．引物的设计是影响PCR扩增反应的效率和特异性的关键因素，下列相关叙述正确的是(　　) A．引物的碱基数量越少则退火温度越低、目标DNA获得率越高 B．根据需要可在引物的5′端添加限制酶识别序列、点突变序列等 C．两种引物的退火温度差异较大，可减少引物与模板的非特异性结合 D．引物的GC含量越高，结合特异性越强，越利于目标DNA的扩增 8．下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述错误的是(　　) 注：AmpR：氨苄青霉素抗性基因；TetR：四环素抗性基因。 A．应选择的限制酶组合是酶F和酶G B．所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因 C．用含氨苄青霉素的培养基筛选出的是含重组质粒的受体菌 D．同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到4个条带 9．实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法不正确的是(　　) A．做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针 B．RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增 C．若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒 D．病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原—抗体杂交 10．DNA琼脂糖凝胶电泳是指利用在溶液中带负电荷的DNA分子在电场中向正极移动的原理，分离、纯化或分析PCR扩增后的待检DNA片段的生物化学技术。下列说法错误的是(　　) A．DNA片段相对分子质量越大，迁移就越慢 B．凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA片段的检测 C．拟回收的DNA区带融化后可先用DNA抽取剂抽提，再用70%的冷酒精沉淀抽提DNA片段，从而提高回收率 D．新冠病毒核酸检测出现假阳性的原因可能是阳性对照中模板核酸与样品交叉污染 11．载体是基因工程中携带外源 DNA 片段(目的基因)进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。如图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示意图，下列相关叙述错误的是(　　) A．重组载体A、重组载体B分别是基因克隆载体和基因表达载体 B．载体A和载体 B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因 C．必须把目的基因插入重组载体A 的启动子和终止子之间 D．培养细菌A和细菌B的培养基在营养成分和功能上有明显差异 12.限制性内切酶EcoR Ⅰ识别并切割双链DNA，用EcoR Ⅰ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为（　　） A.6 B.250 C.4 000 D.24 000 13.某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是（　　） A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度 14.下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是（　　） A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近 B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂 C.预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热 15.粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（　　） A.加入适量的木瓜蛋白酶 B.37～40 ℃的水浴箱中保温10～15分钟 C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精 D.加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→加入NaCl调节浓度至0.14 mol/L 16.下列有关电泳的叙述，不正确的是（　　） A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率 C.进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动 D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定 二、非选择题 17.PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题： （1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是　　　　（用数字序号表示）。 （2）操作③中使用的酶是　　　　。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、　　　　三步，其中复性的结果是　　　　　　　　　。 （3）为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与　　　　特异性结合。 （4）PCR（聚合酶链式反应）技术是指　　　　　　　　　。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。 18.用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 回答下列问题： （1）常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中　　　　酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中　　　　　　酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。 （2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是　　　　。 （3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能　　　　；质粒DNA分子上有　　　　　　　　，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是___________________________________。 （4）表达载体含有启动子，启动子是指____________________。 19.某质粒上有Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题： （1）将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是　　　　；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为　　　　。该方法中农杆菌的作用是______________________。 （2）在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ两种酶的好处是__________________。 （3）含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？　　　　（填“是”或“否”）。为什么？________________________________________。 （4）将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B（含氨苄青霉素）和C（含四环素和氨苄青霉素）两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。 20.人类胰岛素基因位于第11号染色体上，长度为8 416 bp，人类胰岛素的氨基酸序列已知。回答下列相关问题。 （1）上图是利用PCR技术获取人胰岛素基因的方法，除了此方法外，还可以利用的方法是____________________________。 （2）利用PCR技术获取人胰岛素基因，在缓冲液中除了要添加模板和引物外，还需要添加的物质有_______________________。 （3）经过　　　　轮循环可以得到所需的目的基因，一个DNA分子经过5轮循环，需要引物A　　　　个，从PCR的过程和DNA分子的特点，试着写出设计引物需要注意的问题：__________________、 ________________________（答出2点即可）。 （4）利用SDS－凝胶电泳分离不同DNA分子，迁移速度取决于　　　　　　　　。 （5）利用图示方法获取的目的基因，直接构建基因表达载体后导人大肠杆菌，　　（填“能”或“不能”）表达出人胰岛素，理由是________________________。 21．如图是利用工程菌(大肠杆菌)生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和Hind Ⅲ的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题： (1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有________的因子。过程①所用到的组织细胞是_______________，③过程的目的是________________，⑤过程常用__________________处理大肠杆菌。 (2)如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ对图中质粒进行切割，形成的DNA片段种类有________种，这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有______种和______种。 (3)如果只用限制酶PstⅠ切割目的基因和质粒，完成过程④、⑤后(受体大肠杆菌不含AmpR、TetR)，将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取甲培养基上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选______________________的大肠杆菌；接种到乙培养基上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是_____________。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是_______________。 22．某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题： (1)目的基因的扩增 ①提取真菌细胞__________________，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。 ②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致__________________。 ③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除Taq DNA聚合酶以外的各成分混合后，加热到80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增。下列叙述正确的有________。 A．TaqDNA聚合酶最适催化温度范围为50～60 ℃ B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物 C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸 D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了TaqDNA聚合酶的特异性 (2)重组质粒的构建 ①将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进____________________，形成A－m结合体。将A－m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及________酶等，完成质粒的环化。 ②若正确构建的重组质粒A－m仍能被SmaⅠ切开，则SmaⅠ的酶切位点可能在_________________________________________。 (3)融合蛋白的表达 ①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A－m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是________________________。 ②若通过抗原－抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明___________，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。 23．如图pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素(一种抗生素)抗性基因；mel为黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而三种限制酶SacⅠ、SphⅠ、BglⅡ在pIJ702上分别只有一处识别序列。回答下列问题： 项目 pIJ702 pZHZ8 BglⅡ 5.7 kb 6.7 kb 表1 固体培养基中硫链丝菌素浓度(μg/mL) 0 1 2 5 10 不含质粒的链霉菌生长状况 ＋＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋ － － 注：“＋”表示生长；“－”表示不生长。 表2 (1)限制酶可以识别双链DNA中特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的________________断裂，切割形成的末端有______________________两种。 (2)以SacⅠ和SphⅠ切取目的基因，与质粒pIJ702上长度为0.4 kb的SacⅠ/SphⅠ片段进行置换，构建重组质粒pZHZ8。上述两种质粒经限制酶BglⅡ酶切后所得片段长度见表1。由此判断目的基因的片段长度为____________kb，判定目的基因中含有一个BglⅡ切割位点的理由是______________________________。 (3)导入目的基因时，首先用Ca2＋处理链霉菌使其成为感受态(能吸收周围环境中DNA分子的生理状态)细胞，再将重组质粒pZHZ8溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下可以促进链霉菌完成________________过程。 (4)不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素的固体培养基上生长状况如表2所示。若要筛选导入pZHZ8的链霉菌细胞，所需硫链丝菌素浓度至少应在________μg/mL以上，挑选成功导入pZHZ8的链霉菌的具体方法是___________________。若要检测整合到染色体DNA上的目的基因是否发挥功能作用，第一步需检测受体细胞的______(填“DNA”或“RNA”)。 参考答案： 基础摸查 【真题导入】 1．B 2．A　 3．D　 4．(1)磷脂、蛋白质　发出星射线，形成纺锤体　 (2)溶解DNA　耐高温DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)　3′　 (3)a、b　1 100　Q3　X蛋白参与中心体的形成　 (4)逆转录　32 【考点陈列】 考点一　 归纳 1．重组DNA　基因　DNA分子　生物类型　生物产品 2．(1)转移　(2)半保留复制　(4)遗传密码　(5)限制酶、DNA连接酶和逆转录酶　(6)DNA　(9)PCR　(10)基因组编辑 3．(1)原核生物　数千　特定核苷酸序列　磷酸二酯键　黏性末端　(2)磷酸二酯键　大肠杆菌　黏性末端　黏性末端 (3)环状双链DNA分子　噬菌体　有一个至多个　自我复制　受体DNA　标记 拓展 (1)限制性内切核酸酶Ⅰ： 限制性内切核酸酶Ⅱ： (2)用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割质粒。 限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。 考点二　 归纳 1．(1)性状　表达产物　(2)①结构和功能清晰　②序列数据库　(3)②获取　a．DNA半保留复制　组分　大量复制　b．缓冲溶液　引物　脱氧核苷酸　耐高温的　温度　c．90　单链　50　引物　72　d．琼脂糖凝胶电泳　③基因文库 2．(1)在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代　(2)启动子　标记基因 3．花粉管通道法　Ca2＋　体细胞或受精卵　受精卵 拓展 (1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 (2)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。 (3)目的基因的两条反向平行的链都作为模板，其碱基序列不同。 (4)两种引物之间不能互补配对。 (5)引物是依据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)。 (6)经过n轮循环需要消耗引物数为(2n＋1－2)个，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。 考点三　 归纳 1．(1)不溶于　2 mol/L　二苯胺　(2)95%　沸水 2．(1)①DNA的热变性　②相反　③大小和构象　(2)微量移液器　离心管　底部　(3)300 nm 拓展 1．(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。(2)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。(3)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 2．观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。 【考点专攻】 考点一 1．D 2．D 考点二 3．C 4．D 考点三 5．D 6．D 基础夯实 1．(1)×　(2)×　 (3)×　(4)×　 2．(1)×　(2)×　(3)×　 (4)×　 3．(1)×　(2)×　(3)×　(4)×　 4．(1)按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品　 (2)特定核苷酸　磷酸二酯键　 (3)重组DNA分子的筛选　 (4)DNA模板　2种引物　脱氧核苷酸　DNA聚合酶 (5)启动子、终止子　 (6)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程 优化提升 1．C 2．C 3．D 4．A 5．B 6．B 7．B　 8．C　 9．C　 10．C　 11．C　 12.C 13.D 14.A 15.A 16.C 17.（1）④②③①　 （2）耐高温的DNA聚合酶　延伸　两种引物通过碱基互补配对分别与两条单链DNA模板结合　 （3）病原菌DNA　 （4）一种在生物体外快速扩增特定DNA片段的技术 18.（1）EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ　EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ　 （2）磷酸二酯键　 （3）自我复制　限制酶切割位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞　 （4）RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列 19.（1）Ti质粒　T­DNA　感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上 （2）防止目的基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率；防止目的基因与质粒反向连接 （3）否　含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏 （4） 20.（1）从基因文库获取或人工合成　 （2）四种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶 （3）3　31　引物自身不能有互补序列；引物之间不能有互补序列　 （4）DNA分子的大小　 （5）不能　因为此方法获得的目的基因中含有内含子，大肠杆菌无法正常识别内含子，而对内含子部分转录的mRNA进行翻译，导致合成的蛋白质出现错误 21．(1)调控作用　人垂体组织细胞　将平末端处理为黏性末端　Ca2＋　 (2)9　3　3　 (3)含四环素抗性基因　完整的pBR322质粒(或含有AmpR、TetR的质粒)　在丙中能存活，在乙中不能存活 22．(1)①RNA　②蛋白M上不含tag标签　③BC　 (2)①黏性末端碱基互补配对　DNA连接　②基因m的连接处、基因m的内部　 (3)①受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因，可以长成菌落　②融合基因表达(或重组质粒A－m构建成功) 23．(1)磷酸二酯键　黏性末端和平末端　 (2)1.4　pIJ702上的原有BglⅡ切割位点被目的基因置换得到的环状pZHZ8，仍能被BglⅡ切割成一条线段　 (3)转化　 (4)5　根据导入pIJ702的链霉菌菌落呈黑色、导入pZHZ8的链霉菌菌落呈白色的特点，通过观察菌落的颜色进行挑选　RNA 学科网（北京）股份有限公司 $$