专题10 基因工程-2025年高考生物【热点·重点·难点】专练（北京专用）

专题10 基因工程 目录 1.命题趋势：明考情知方向 2.重难诠释：知重难、掌技巧、攻薄弱 3.创新情境练：知情境练突破 4.限时提升练：（30min）综合能力提升 考点 三年考情分析 2025考向预测 基因工程 （2024. 北京卷.T19）PCR扩增的原理与过程 （2023. 北京卷.T19）,PCR扩增的原理与过程 （2023.北京卷.T21）基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用 （2022.北京卷.T21）基因表达载体的构建,转基因生物安全性 考点预测：基因工程及应用 考法预测：在特定情境下，通过设计合适的 引物、利用特定限制酶剪切，进行基因编辑或基因拼接，达到改变特定基因、实现基因重组、获 得融合蛋白等目的，操作过程复杂，所涉及的内容为当前最前沿的技术成果等。 1、 重难点 （一）基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 （1）方法：从基因文库中直接获取。基因文库类型:基因组文库（包含一种生物的所有基因）；部分基因文库（包含一种生物的一部分基因）（cDNA文库）。 （2）人工合成：逆转录法、化学合成法。 （3）利用PCR技术获取和扩增 2.基因表达载体的构建 （1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时使其能够表达和发挥作用。 （2）基因表达载体的组成和功能 3. 将目的基因导入受体细胞 （1） 导入植物细胞：农杆菌转化法、花粉管通道法。 （2） 导入动物细胞：显微注射法。受体细胞：受精卵。 （3） 导入微生物细胞：Ca2+处理。可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 4.目的基因的检测与鉴定 检测水平 检测目的 检测方法 分子水平 目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上 PCR 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交 个体水平 转基因生物是否表现出相应的特性 如抗虫、抗病的接种实验 2、 高分技巧 （一）基因表达载体的构建 1.注意事项 （1）目的基因应插到启动子与终止子之间的部位。 （2）目的基因的插入不能破坏标记基因。 （3）切割质粒和获取目的基因的限制酶必须产生相同的末端。（碱基互补，便于连接） 2.两种酶切方法 （1）单酶切：用一种限制酶切割目的基因和质粒，所得目的基因与质粒两头的末端相同。在进行连接反应时，目的基因和载体是随机碰撞的，因此容易造成自身环化和反向连接(即目的基因的上下游方向颠倒地与载体相连，结果目的基因的转录从下游到上游，导致密码子全部改变，目的基因不能正常表达)。 （2）双酶切：用两种限制酶切割目的基因及质粒，可使目的基因与质粒两头的末端不相同，可避免自身环化和反向连接。 3.限制酶选择的要求 （1） 应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”。 （2） 不能选择切割位点位于目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点内部的限制酶，以防破坏目的基因。 （3） 为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因及质粒。 （建议用时：10分钟） 1．（新技术）我国科学家开发了一种利用自体肝细胞治疗遗传性肝病的新技术（如图）。用基因编辑技术对体外培养的患者肝细胞进行基因修复后，将细胞移植给人酪氨酸血症模型小鼠，小鼠肝功能得到有效改善。相关叙述错误的是（    ） A．用胶原蛋白酶或胰蛋白酶处理可分散肝组织细胞 B．基因编辑工具使肝细胞内致病基因修复为正常基因 C．此过程利用显微注射技术将正常基因导入肝细胞 D．使用免疫缺陷小鼠可避免异种移植引发的免疫排斥 2．（联系生活）转基因抗虫棉在我国的种植面积已占全国棉花种植面积的90%。研究者利用PCR技术检测杂草中有无转基因成分，得到如下图所示结果。相关分析错误的是（    ） A．空白实验是未加入DNA模板得到的电泳结果 B．推测棉田杂草6、7与抗虫棉的亲缘关系较近 C．结果说明校园杂草与棉花间一定存在生殖隔离 D．转基因成分进入杂草体内可能会引发生态问题 3．（技术分析）科学家通过对已灭绝的古人类——尼安德特人的基因组进行测序，发现尼安德特人的部分基因通过智人流向现代人类。下列有关叙述错误的是（　　） A．基因组测序的研究需要借助PCR技术 B．尼安德特人可能是通过与智人杂交将其基因遗传给现代人类 C．证明尼安德特人是现代人近亲的依据是 DNA 的核苷酸种类 D．该项研究能够为人类的起源与现代人的进化提供有力的证据 4．（机理探究）油菜是我国的重要油料作物，其生长受到核盘菌引起的菌核病威胁。科研人员试图培育抗菌核病的转基因油菜新品种，其抗性机理如下图所示，相关叙述正确的是（    ） A．将含防御基因的基因表达载体导入核盘菌后，侵染油菜获得转基因植株 B．核盘菌侵染转基因油菜后，启动防御基因表达出相应蛋白质抵御核盘菌侵染 C．未受到核盘菌侵染时，油菜细胞不能合成转录因子B，不启动防御基因表达 D．转基因油菜中的启动子pB属于诱导型启动子，能够精确调控防御基因的表达 5．（综合分析）酵母人工染色体pYAC2是以酵母菌为受体细胞构建基因文库时的常用载体。下图为pYAC2的结构示意图，导入受体细胞前用限制酶BamHⅠ切割可使其成为线性的染色体。pYAC2适配的受体菌菌落呈红色，sup4基因表达能够抑制其性状表现，使菌落呈白色。相关叙述错误的是（    ） A．导入pYAC2的受体菌能够在不含色氨酸的培养基中生存 B．用BamHⅠ切割pYAC2后，TEL端粒序列位于染色体的两端 C．着丝粒序列CEN4的存在可防止pYAC2在细胞分裂中丢失 D．将带有目的基因的重组pYAC2导入受体菌后应挑选白色菌落 （建议用时：30分钟） 一、选择题 1．（2020·北京·高考真题）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。 为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（    ） A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④ 2．（2018·北京·高考真题）用XhoI和SalI两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是（　　） A．如图中两种酶识别的核苷酸序列不同 B．如图中酶切产物可用于构建重组DNA C．泳道①中是用SalI处理得到的酶切产物 D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA 3．（2024·北京海淀·一模）双向启动子可同时结合两个 RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是（　　） A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞 B．为连入GUS 基因，需用SalI和SphI酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用 4．（2024·北京昌平·二模）下图示利用重叠延伸PCR技术改造目的基因的原理。相关叙述错误的是（    ） A．图示操作中至少需要用2种限制酶对目的基因进行处理 B．操作中引物2和引物3序列应含有拟突变位点，且可以互补 C．应选用引物1和引物4进行PCR3，以获得大量目的基因序列 D．此过程实现的基因序列改变属于基因突变，未发生基因重组 5．（2024·北京东城·二模）为更有效地处理含重金属的废水，研究人员将植物的金属结合蛋白基因导入大肠杆菌构建工程菌。由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。下图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述正确的是（    ） A．不直接选择P构建表达载体是因为它不含起始密码子和终止密码子 B．将目的基因插入载体P时，应选择SmaI进行酶切，再用DNA连接酶连接 C．构建表达载体时，应选择XhoI和PstI酶切载体E和含目的基因的载体P D．基因表达载体构建完成后，需利用农杆菌转化法导入受体细胞 6．（2024·北京西城·二模）为加速绿色荧光蛋白基因（GFP）进化，快速获得荧光强度更高的GFP蛋白，科研人员将DNA1（编码易错DNA聚合酶）和DNA2共同导入大肠杆菌（如图）。下列说法错误的是（    ） A．用卡那霉素筛选含DNA1的大肠杆菌 B．易错DNA聚合酶催化GFP基因复制 C．GFP基因在此复制过程中突变率升高 D．连续传代并筛选强荧光菌落加速GFP进化 7．（2024·北京丰台·二模）为研究玉米的抗逆机制，科研人员利用图中的双分子荧光互补技术分析玉米M5与B72蛋白的相互作用。下列说法正确的是（　　） A．直接将YFP剪切为N端和C端后，分别与M5和B72蛋白连接 B．设计特异性引物以玉米cDNA为模板扩增M5和B72基因 C．将M5和B72基因融合后连接到质粒上的YFP基因中 D．将含有M5和B72的基因表达载体分别导入不同细胞中 8．（2024·北京门头沟·一模）下列生物技术操作不会达成预期目标的是（    ） A．将胰岛素基因表达质粒转入酵母菌，筛选获得产胰岛素工程菌 B．将肠乳糖酶基因导入奶牛乳腺细胞，培育产低乳糖牛乳的奶牛 C．将体外改造后能识别特定癌细胞的T细胞回输患者，进行癌症治疗 D．将花青素代谢相关基因导入植物体细胞，获得具有特定花色的植株 9．（2024·北京朝阳·一模）为了构建可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌，研究人员构建基因表达载体（如图所示），并导入不能合成尿嘧啶的酵母菌。 下列相关分析不正确的是（　　） A．尿嘧啶合成基因可以作为表达载体上的标记基因 B．该方法需利用限制酶和DNA连接酶实现目的基因与载体的连接 C．扩增目的基因时应在引物的5'端添加与线性化载体两端相同的DNA序列 D．在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果 10．（2024·北京东城·一模）西北牡丹在白色花瓣基部呈现色斑，极具观赏价值。研究发现，紫色色斑内会积累花色素苷。PrF3H基因控制花色素苷合成途径中关键酶的合成。如图，分别提取花瓣紫色和白色部位的DNA，经不同处理后PCR扩增PrF3H基因的启动子区域，电泳检测扩增产物。分析实验结果可以得出的结论是（　　） A．花瓣紫色与白色部位PrF3H基因的碱基序列存在差异 B．白色部位PrF3H基因启动子甲基化程度高于紫色部位 C．PrF3H基因启动子甲基化程度高有利于花色素苷合成 D．启动子甲基化可调控基因表达说明性状并非由基因控制 11．（2024·北京西城·一模）图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程，其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是（    ） A．PCR扩增A时可在引物中加入PstI和XhoI的酶切位点 B．在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌 C．用农杆菌转化植物愈伤组织选择呈现蓝色的组织进行培养 D．启动子若为除草剂诱导启动子将减少细胞物质和能量浪费 12．（2024·北京石景山·一模）蛛丝蛋白是一种特殊纤维蛋白，具有强度高、韧性大等特点，在人工肌腱等医学领域有着诱人的前景。某研究小组提取一种丝绒蜘蛛中的蛛丝蛋白基因，将其导入大肠杆菌生产蛛丝蛋白。下列叙述正确的是（　　） A．构建蛛丝蛋白基因表达载体需要限制酶和DNA聚合酶 B．可通过显微注射的方法将蛛丝蛋白基因导入大肠杆菌 C．基因表达载体上的复制原点可调控蛛丝蛋白基因的表达 D．可通过蛋白质工程设计与改造蛛丝蛋白的结构以增强其韧性 13．（2024·北京丰台·一模）V蛋白对登革热病毒的增殖有抑制作用。V蛋白含有285个氨基酸，其cDNA长1241bp。将V蛋白在大肠杆菌中诱导表达，经纯化后免疫小鼠，最终获得5株分泌V单抗的杂交瘤细胞，提取单抗与V蛋白杂交，电泳结果如下图，相关叙述错误的是（    ） A．V蛋白的cDNA中含有不编码V蛋白的序列 B．获得的5株杂交瘤细胞都能无限增殖 C．用V蛋白免疫小鼠的目的是获得相应抗体 D．可培养5A8杂交瘤细胞大量生产单克隆抗体 14．（2024·北京密云·模拟预测）研究者获得导入S基因的基因编辑小鼠的过程如下图所示，下列相关叙述正确的是（　　） A．过程①一般需要用促性腺激素处理 B．过程②是在雌鼠a的输卵管内完成 C．过程③需将表达载体注射到子宫中 D．过程④需抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥 15．（2024·北京门头沟·一模）某生物学社团利用洋葱进行实验。下列相关叙述正确的是（    ） A．洋葱鳞片叶内、外表皮细胞均可用于探究植物细胞的吸水和失水 B．洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂并水浴加热，溶液由蓝色变为紫色 C．制作洋葱根尖有丝分裂装片时，解离、漂洗都能更好地将细胞分散开 D．粗提取的洋葱DNA溶于2mol·L-1 NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色 二、非选择题 16．（2024·北京·高考真题）灵敏的嗅觉对多数哺乳动物的生存非常重要，能识别多种气味分子的嗅觉神经元位于哺乳动物的鼻腔上皮。科学家以大鼠为材料，对气味分子的识别机制进行了研究。 (1)嗅觉神经元的树突末梢作为感受器，在气味分子的刺激下产生 ，经嗅觉神经元轴突末端与下一个神经元形成的 将信息传递到嗅觉中枢，产生嗅觉。 (2)初步研究表明，气味受体基因属于一个大的基因家族。大鼠中该家族的各个基因含有一些共同序列（保守序列），也含有一些有差异的序列（非保守序列）。不同气味受体能特异识别相应气味分子的关键在于 序列所编码的蛋白区段。 (3)为了分离鉴定嗅觉神经元中的气味受体基因，科学家依据上述保守序列设计了若干对引物（图甲），利用PCR技术从大鼠鼻腔上皮组织mRNA的逆转录产物中分别扩增基因片段，再用限制酶HinfⅠ对扩增产物进行充分酶切。图乙显示用某对引物扩增得到的PCR产物（A）及其酶切片段（B）的电泳结果。结果表明酶切片段长度之和大于PCR产物长度，推断PCR产物由 组成。 (4)在上述实验基础上，科学家们鉴定出多种气味受体，并解析了嗅觉神经元细胞膜上信号转导的部分过程（图丙）。 如果钠离子通道由气味分子直接开启，会使嗅觉敏感度大大降低。根据图丙所示机制，解释少量的气味分子即可被动物感知的原因 。 17．（2023·北京·高考真题）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。 (1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与 互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。 (2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从 点到 点。 (3)为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK： ①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。请完善制备小鼠IK的技术路线： →连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→ →获得小鼠IK。 (4)各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是 。 18．（2022·北京·高考真题）生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。 (1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是 。 (2)为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案1相比，方案2的主要优势是 ，因而被用于制备监测鱼（MO）。 (3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。 Ⅰ.启动子： 。 ①ERE②UAS③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P肌） Ⅱ.基因： A．GFP    B．Gal4    C．雌激素受体基因（ER）  D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg） (4)SM不育的原因是：成体SM自身产生雌激素，与受体结合后 造成不育。 (5)使拟用于实际监测的SM不育的目的是 。 19．（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 筛选组织特异表达的基因 筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。 真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。 很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。 获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。 研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。 (1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生 的过程称为细胞分化，分化是基因 的结果。 (2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。 A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 C．一个增强子只能作用于一个基本启动子 D．很多增强子在不同组织中的活性不同 (3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测 。 (4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 （略）。 20．（2024·北京海淀·二模）葡萄糖二酸（GA）可作为原料应用于食品、能源和医药等领域，科研人员通过改造工程菌以实现GA的大量生产。 (1)M酶和U酶是GA合成途径中的两个关键酶，科研人员将图1所示质粒1导入 处理的大肠杆菌，改造后的大肠杆菌可合成GA． (2)为实现对工程菌合成GA的实时监测，科研人员设计了质粒2。并进行下表所示两种检测方案。 方案一 质粒1和2共同导入大肠杆菌菌株E中 在液体培养基中培养一段时间 菌液分为5组 每组上清液加入适量GA，检测荧光强度。 方案二 质粒1和2分别导入大肠杆菌菌株E和菌株S中 将E菌液与S菌液混合，混合菌液培养一段时间后分为5组 ①据图1分析检测方案的原理为 。 ②检测结果如图2，据图对比两种方案，并结合两种质粒适用范围，选择其中一种更优方案并说明理由： 。 (3)进一步发现由于产物GA呈酸性影响了大肠杆菌合成GA的能力，因而科研人员尝试以酵母菌为受体细胞导入质粒1，改造后的酵母菌以葡萄糖为原料合成并分泌GA的途径如图3。但M酶的活性远小于U酶，限制了GA产量。为改进M酶的催化效率，将含不同突变的M酶基因分别导入酵母菌，利用上述所选方案菌株监测不同酵母菌的GA产量，操作为 ，取等量培养液，测定其荧光值和吸光度（反应菌体浑浊程度），挑选 高的菌株即为GA高产菌株。 (4)据图3分析还可以通过 等方法改造酵母菌以提高GA的产量。 21．（2024·北京西城·二模）科研人员获得了携带两种抗稻瘟病的抗性基因Pib和Pikm的水稻品系——川抗30，以及携带螟虫抗性基因CrylC的水稻品系——昌恢。为获得同时携带抗螟虫基因和两种抗稻瘟病基因的改良株系，开展了相关研究。 (1)水稻的稻瘟病抗性与敏感为一对 。利用川抗30品系与野生型稻瘟病敏感水稻杂交，F1表现为稻瘟病抗性，F1与野生型杂交，子代性状及分离比为 ，证明Pib和Pikm位于非同源染色体上。 (2)昌恢品系水稻在品质和产量上明显优于川抗30，科研人员结合分子标记技术筛选目标基因进行杂交育种，以获得改良优质水稻。请写出制备优质、高产的纯合双抗（抗螟虫和抗稻瘟病）水稻的杂交育种技术路线（总体思路） 。 (3)研究者利用PCR技术检测改良优质水稻中是否含有Pib基因。 ①下表为利用PCR进行检测的反应体系的配方，请将表格补充完整。 PCR反应体系 组分 总体积/10μL 10倍浓缩的扩增缓冲液 1μL i 1.5μL 4种脱氧核苷酸等量混合液（2.5mmol·L-1） 0.5μL 引物I/II（5.0μmol·L-1） 1/1μL Taq DNA聚合酶 0．20μL H2O ii ②图为Pib基因的部分序列。 5'—…AATGCCC…ATGTGGA…—3' 3'—…TTACGGG…TACACCT…—5' 根据图，选择 作为引物对Pib基因进行扩增。 A．5'—…AATGCCC…—3'    B．5'—…TCCACAT…—3' C．5'—…TTACGGG…—3'    D．5'—…ATGTGGA…—3' 研究者最终确定改良优质水稻具备了相关抗性基因，成功培育出优质、高产的双抗水稻。 (4)检测发现本研究获得的优质双抗水稻的部分性状与昌恢品系相比出现株高上升、千粒重下降的现象，但是利用基因定点编辑技术获得的纯合抗性突变株系，其他性状未发生改变，原因可能是 。请从育种的角度对这两种技术进行评价。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！2 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题10 基因工程 目录 1.命题趋势：明考情知方向 2.重难诠释：知重难、掌技巧、攻薄弱 3.创新情境练：知情境练突破 4.限时提升练：（30min）综合能力提升 考点 三年考情分析 2025考向预测 基因工程 （2024. 北京卷.T19）PCR扩增的原理与过程 （2023. 北京卷.T19）,PCR扩增的原理与过程 （2023.北京卷.T21）基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用 （2022.北京卷.T21）基因表达载体的构建,转基因生物安全性 考点预测：基因工程及应用 考法预测：在特定情境下，通过设计合适的 引物、利用特定限制酶剪切，进行基因编辑或基因拼接，达到改变特定基因、实现基因重组、获 得融合蛋白等目的，操作过程复杂，所涉及的内容为当前最前沿的技术成果等。 1、 重难点 （一）基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 （1）方法：从基因文库中直接获取。基因文库类型:基因组文库（包含一种生物的所有基因）；部分基因文库（包含一种生物的一部分基因）（cDNA文库）。 （2）人工合成：逆转录法、化学合成法。 （3）利用PCR技术获取和扩增 2.基因表达载体的构建 （1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时使其能够表达和发挥作用。 （2）基因表达载体的组成和功能 3. 将目的基因导入受体细胞 （1） 导入植物细胞：农杆菌转化法、花粉管通道法。 （2） 导入动物细胞：显微注射法。受体细胞：受精卵。 （3） 导入微生物细胞：Ca2+处理。可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 4.目的基因的检测与鉴定 检测水平 检测目的 检测方法 分子水平 目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上 PCR 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交 个体水平 转基因生物是否表现出相应的特性 如抗虫、抗病的接种实验 2、 高分技巧 （一）基因表达载体的构建 1.注意事项 （1）目的基因应插到启动子与终止子之间的部位。 （2）目的基因的插入不能破坏标记基因。 （3）切割质粒和获取目的基因的限制酶必须产生相同的末端。（碱基互补，便于连接） 2.两种酶切方法 （1）单酶切：用一种限制酶切割目的基因和质粒，所得目的基因与质粒两头的末端相同。在进行连接反应时，目的基因和载体是随机碰撞的，因此容易造成自身环化和反向连接(即目的基因的上下游方向颠倒地与载体相连，结果目的基因的转录从下游到上游，导致密码子全部改变，目的基因不能正常表达)。 （2）双酶切：用两种限制酶切割目的基因及质粒，可使目的基因与质粒两头的末端不相同，可避免自身环化和反向连接。 3.限制酶选择的要求 （1） 应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”。 （2） 不能选择切割位点位于目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点内部的限制酶，以防破坏目的基因。 （3） 为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因及质粒。 （建议用时：10分钟） 1．（新技术）我国科学家开发了一种利用自体肝细胞治疗遗传性肝病的新技术（如图）。用基因编辑技术对体外培养的患者肝细胞进行基因修复后，将细胞移植给人酪氨酸血症模型小鼠，小鼠肝功能得到有效改善。相关叙述错误的是（    ） A．用胶原蛋白酶或胰蛋白酶处理可分散肝组织细胞 B．基因编辑工具使肝细胞内致病基因修复为正常基因 C．此过程利用显微注射技术将正常基因导入肝细胞 D．使用免疫缺陷小鼠可避免异种移植引发的免疫排斥 【答案】C 【分析】在进行细胞培养时，首先要对新鲜取材的动物组织进行处理，或用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间，将组织分散成单个细胞。然后，用培养液将细胞制成细胞悬液，再将细胞悬液放 入培养瓶或培养皿内，置于适宜环境中培养。 【详解】A、动物细胞培养过程中，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理部分组织使细胞分散获得单个细胞，A正确； B、分析图可知，将携带正常基因的重组腺病毒并利用CRISPR/Cas9基因编辑工具，可以使肝细胞内致病基因修复为正常基因，B正确； C、分析图可知，该过程是利用载体——重组腺病毒将正常基因导入肝细胞，并不是利用显微注射技术将正常基因导入肝细胞，C错误； D、免疫缺陷小鼠免疫功能受损，所以使用免疫缺陷小鼠可避免异种移植引发的免疫排斥，D正确。 故选C。 2．（联系生活）转基因抗虫棉在我国的种植面积已占全国棉花种植面积的90%。研究者利用PCR技术检测杂草中有无转基因成分，得到如下图所示结果。相关分析错误的是（    ） A．空白实验是未加入DNA模板得到的电泳结果 B．推测棉田杂草6、7与抗虫棉的亲缘关系较近 C．结果说明校园杂草与棉花间一定存在生殖隔离 D．转基因成分进入杂草体内可能会引发生态问题 【答案】C 【分析】由图可知，2转基因抗虫棉和棉田杂草6和7均含有转基因成分。转基因抗虫棉是指棉花细胞染色体上整合有外源抗虫基因的棉花品种。抗虫基因通常为来源于苏云金芽孢杆菌的Bt基因。 【详解】A、空白试验应该是DNA标准样液（Marker），未加入DNA模板得到的电泳结果，作为空白对照，A正确； B、根据杂草6和7含有转基因成分可以推测，杂草6和7可能与抗虫棉的亲缘关系较近，获得了转基因特性，B正确； C、根据6和7含有转基因成分可知，杂草可能与棉花的亲缘关系较近，不能说明两者是否存在生殖隔离，C错误； D、转基因成分进入杂草内，可能导致杂草获得转基因特性，可能会引发生态问题，D正确。 故选C。 3．（技术分析）科学家通过对已灭绝的古人类——尼安德特人的基因组进行测序，发现尼安德特人的部分基因通过智人流向现代人类。下列有关叙述错误的是（　　） A．基因组测序的研究需要借助PCR技术 B．尼安德特人可能是通过与智人杂交将其基因遗传给现代人类 C．证明尼安德特人是现代人近亲的依据是 DNA 的核苷酸种类 D．该项研究能够为人类的起源与现代人的进化提供有力的证据 【答案】C 【分析】不同生物的DNA和蛋白质等生物大分子的共同点，揭示人们当今生物有着共同的原始祖先，其差异的大小则揭示当今生物种类亲缘关系的远近，以及它们在进化史上出现的顺序。 【详解】A、基因组测序，需要借助PCR技术扩增相应的基因，A正确； B、由题意“尼安德特人的部分基因通过智人流向现代人类”可推知，尼安德特人可能通过与智人杂交将其基因遗传给现代人类，B正确； C、尼安德特人和现代人的 DNA 的核苷酸种类相同，但二者DNA的核苷酸的排列顺序不同，因此证明尼安德特人是现代人近亲的依据可以是 DNA 的核苷酸的排列顺序，C错误； D、基因组测序技术的研究，能够在分子水平上为人类的起源与现代人的进化提供有力的证据，D正确。 故选C。 4．（机理探究）油菜是我国的重要油料作物，其生长受到核盘菌引起的菌核病威胁。科研人员试图培育抗菌核病的转基因油菜新品种，其抗性机理如下图所示，相关叙述正确的是（    ） A．将含防御基因的基因表达载体导入核盘菌后，侵染油菜获得转基因植株 B．核盘菌侵染转基因油菜后，启动防御基因表达出相应蛋白质抵御核盘菌侵染 C．未受到核盘菌侵染时，油菜细胞不能合成转录因子B，不启动防御基因表达 D．转基因油菜中的启动子pB属于诱导型启动子，能够精确调控防御基因的表达 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、将含防御基因的基因表达载体导入核盘菌后，侵染油菜，之后还需要对防御基因进行检测和鉴定，A错误； B、分析题图可知，核盘菌侵染转基因油菜后，启动防御基因转录出小干扰RNA抵御核盘菌侵染，而非表达出蛋白质，B错误； C、未受到核盘菌侵染时，油菜细胞不能激活细胞内的转录因子B，导致防御基因不能表达，C错误； D、转基因油菜中的启动子pB只有在核盘菌侵染时才能激活目的基因的表达，属于诱导型启动子，能够精确调控防御基因的表达，D正确。 故选D。 5．（综合分析）酵母人工染色体pYAC2是以酵母菌为受体细胞构建基因文库时的常用载体。下图为pYAC2的结构示意图，导入受体细胞前用限制酶BamHⅠ切割可使其成为线性的染色体。pYAC2适配的受体菌菌落呈红色，sup4基因表达能够抑制其性状表现，使菌落呈白色。相关叙述错误的是（    ） A．导入pYAC2的受体菌能够在不含色氨酸的培养基中生存 B．用BamHⅠ切割pYAC2后，TEL端粒序列位于染色体的两端 C．着丝粒序列CEN4的存在可防止pYAC2在细胞分裂中丢失 D．将带有目的基因的重组pYAC2导入受体菌后应挑选白色菌落 【答案】D 【分析】载体：除质粒外，还有噬菌体和动植物病毒等。质粒作为载体的条件：①有一个至多个限制酶酶切位点；②进入受体细胞后能自我复制或整合到宿主细胞DNA上进行同步复制；③有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 【详解】A、pYAC2上含有TRP1（色氨酸合成酶基因），导入pYAC2的受体菌能够合成色氨酸，能够在不含色氨酸的培养基中生存，A正确； B、pYAC2上有两个BamHⅠ切割位点，用BamHⅠ切割后，pYAC2成为线性的染色体，TEL端粒序列位于染色体的两端，B正确； C、着丝粒是确保细胞分裂时染色体正确分离的重要结构，pYAC2上的CEN4（着丝粒序列）可防止pYAC2在细胞分裂中丢失，C正确； D、分析题图可知，目的基因插入会破坏sup4基因，导致sup4基因不能表达，故pYAC2适配的受体菌菌落仍呈红色，将带有目的基因的重组pYAC2导入受体菌后应挑选红色菌落，D错误。 故选D。 （建议用时：30分钟） 一、选择题 1．（2020·北京·高考真题）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。 为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（    ） A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④ 【答案】B 【分析】根据图示中引物的位置可知，引物①扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物③扩增的片段不含启动子，引物②扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列。 【详解】图示中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①+②，即B正确，ACD错误。 故选B。 2．（2018·北京·高考真题）用XhoI和SalI两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是（　　） A．如图中两种酶识别的核苷酸序列不同 B．如图中酶切产物可用于构建重组DNA C．泳道①中是用SalI处理得到的酶切产物 D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA 【答案】D 【详解】【分析】该题考查DNA的结构、限制酶的特点和功能等。DNA一般是双螺旋结构；限制酶可以识别特定的脱氧核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割。 【详解】限制酶识别特定的脱氧核苷酸序列，不同的限制酶能识别不同的核苷酸序列，由电泳图可知XhoI和SalI两种酶分别切割时，识别的序列不同，A正确；同种限制酶切割出的DNA片段，具有相同的黏性末端，再用DNA连接酶进行连接，可以构成重组DNA，B正确；Sal I将DNA片段切成4段，Xho I将DNA片段切成3段，根据电泳结果可知泳道①为Sal I，泳道②为Xho I，C正确；限制酶切割双链DNA，酶切后的DNA片段仍然是双链DNA，D错误，所以选D。 【点睛】注意图1两种限制酶的识别位点数量，Sal I有3个识别位点，能将DNA片段切成4段，Xho I有2个识别位点，能将DNA片段切成3段。 3．（2024·北京海淀·一模）双向启动子可同时结合两个 RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是（　　） A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞 B．为连入GUS 基因，需用SalI和SphI酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，A正确； B、如果用SphI 酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，B错误； C、如果成功导入含有壮观霉素抗性基因的基因表达载体，受体细胞就具有抗壮观霉素的能力，在含有壮观霉素的培养基上能生存，因此可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C正确； D、双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。 故选B。 4．（2024·北京昌平·二模）下图示利用重叠延伸PCR技术改造目的基因的原理。相关叙述错误的是（    ） A．图示操作中至少需要用2种限制酶对目的基因进行处理 B．操作中引物2和引物3序列应含有拟突变位点，且可以互补 C．应选用引物1和引物4进行PCR3，以获得大量目的基因序列 D．此过程实现的基因序列改变属于基因突变，未发生基因重组 【答案】A 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。其过程如下: ①高温变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。 ②低温复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 ③中温延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【详解】 A、图示操作中不需要用限制酶处理目的基因，A错误； B、实现基因的定点诱变时，需要根据目的基因序列设计两种常规引物，以及根据拟突变位点处碱基序列的位置设计两种突变引物，图中属于突变引物的是引物2、3；与常规引物相比，图中的2、3两种引物必须要有一段互补的序列，可以进行碱基互补配对，而且应含有拟突变位点，否则无法实现进行PCR3筛选的突变产物的形成，B正确； C、进行重叠延伸时，上链和下链在突变位点处的碱基序列互补，能起到引物2、3的作用，不需要另加引物。但是，若要获得大量目的基因需要进行PCR3，引物选择2、3，C正确； D、利用重叠延伸PCR技术实现了基因的定点诱变。可见，此过程实现的基因序列改变属于基因突变，未发生基因重组，D正确。 故选A。 5．（2024·北京东城·二模）为更有效地处理含重金属的废水，研究人员将植物的金属结合蛋白基因导入大肠杆菌构建工程菌。由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。下图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述正确的是（    ） A．不直接选择P构建表达载体是因为它不含起始密码子和终止密码子 B．将目的基因插入载体P时，应选择SmaI进行酶切，再用DNA连接酶连接 C．构建表达载体时，应选择XhoI和PstI酶切载体E和含目的基因的载体P D．基因表达载体构建完成后，需利用农杆菌转化法导入受体细胞 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：可利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测；①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、由图可知，不直接选择P构建表达载体是因为它不含启动子与终止子，A错误； BC、由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，据图可知，中间载体P和载体E均含有XhoI和PstI酶识别序列，故可选用XhoI和PstI酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcoRV识别位点，并且其切割的为平末端，可以用于连接目的基因，SmaI酶虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于XhoI和PstI酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割，B错误，C正确； D、由于将目的基因导入大肠杆菌，因此用钙离子处理法最有效，D错误。 故选C。 6．（2024·北京西城·二模）为加速绿色荧光蛋白基因（GFP）进化，快速获得荧光强度更高的GFP蛋白，科研人员将DNA1（编码易错DNA聚合酶）和DNA2共同导入大肠杆菌（如图）。下列说法错误的是（    ） A．用卡那霉素筛选含DNA1的大肠杆菌 B．易错DNA聚合酶催化GFP基因复制 C．GFP基因在此复制过程中突变率升高 D．连续传代并筛选强荧光菌落加速GFP进化 【答案】A 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、由图可知，卡那霉素抗性基因与GFP基因融合到DNA2上后导入大肠杆菌，因此用用卡那霉素筛选含DNA2的大肠杆菌，A错误； B、易错DNA聚合酶能催化DNA的复制，即能催化GFP基因复制，B正确； C、易错DNA聚合酶使DNA复制过程中发生基因突变的概率增加，因此GFP基因在复制过程中突变率升高，C正确； D、连续传代并筛选，逐代淘汰，就会筛选出荧光菌落，从而加速GFP进化，D正确。 故选A。 7．（2024·北京丰台·二模）为研究玉米的抗逆机制，科研人员利用图中的双分子荧光互补技术分析玉米M5与B72蛋白的相互作用。下列说法正确的是（　　） A．直接将YFP剪切为N端和C端后，分别与M5和B72蛋白连接 B．设计特异性引物以玉米cDNA为模板扩增M5和B72基因 C．将M5和B72基因融合后连接到质粒上的YFP基因中 D．将含有M5和B72的基因表达载体分别导入不同细胞中 【答案】B 【分析】结合题意分析可知，该操作应该是将M5和B72基因分别连接在YEP蛋白对应的基因的5'端和3'端，随后将基因表达载体导入同一细胞中。 【详解】AC、结合题意分析可知，该操作应该是将M5和B72基因分别连接在YEP蛋白对应的基因的5'端和3'端，AC错误； B、设计特异性引物以玉米cDNA为模板扩增M5和B72基因，为构建基因表达载体作准备，B正确； D、将含有M5和B72的基因表达载体导入同一细胞中，D错误。 故选B。 8．（2024·北京门头沟·一模）下列生物技术操作不会达成预期目标的是（    ） A．将胰岛素基因表达质粒转入酵母菌，筛选获得产胰岛素工程菌 B．将肠乳糖酶基因导入奶牛乳腺细胞，培育产低乳糖牛乳的奶牛 C．将体外改造后能识别特定癌细胞的T细胞回输患者，进行癌症治疗 D．将花青素代谢相关基因导入植物体细胞，获得具有特定花色的植株 【答案】B 【分析】转基因技术的原理是基因重组。基因重组和基因突变、染色体变异均属于可遗传的变异；基因治疗：指把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。 【详解】A、将含胰岛素基因表达载体的重组质粒转入酵母菌，经过筛选可以获得能生产胰岛素的工程菌，A正确； B、将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，可以培育出产低乳糖牛乳的奶牛，如果导入奶牛乳腺细胞则不能达成预期目标，B错误； C、将体外改造后能识别特定癌细胞的T细胞回输患者，可以识别特定的癌细胞，从而进行癌症治疗，C正确； D、将花青素代谢基因导入植物体细胞，再经植物组织培养获得具有特定花色的植株，D正确。 故选B。 9．（2024·北京朝阳·一模）为了构建可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌，研究人员构建基因表达载体（如图所示），并导入不能合成尿嘧啶的酵母菌。 下列相关分析不正确的是（　　） A．尿嘧啶合成基因可以作为表达载体上的标记基因 B．该方法需利用限制酶和DNA连接酶实现目的基因与载体的连接 C．扩增目的基因时应在引物的5'端添加与线性化载体两端相同的DNA序列 D．在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果 【答案】B 【分析】基因工程中常用限制酶切割目的基因和质粒（载体），用DNA连接酶连接目的基因和载体。 【详解】A、由题意可知，表达载体导入不能合成尿嘧啶的酵母菌，所以可将尿嘧啶合成基因作为表达载体上的标记基因，若导入表达载体后酵母菌能产生尿嘧啶，说明导入成功，A正确； B、该方法需利用DNA连接酶实现目的基因与载体的连接，不需要使用限制酶，B错误； C、扩增目的基因时应在引物的5'端添加与线性化载体两端相同的DNA序列，以便引物与目的基因配对，C正确； D、在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果，若能利用纤维素发酵，则证明转基因成功，D正确。 故选B。 10．（2024·北京东城·一模）西北牡丹在白色花瓣基部呈现色斑，极具观赏价值。研究发现，紫色色斑内会积累花色素苷。PrF3H基因控制花色素苷合成途径中关键酶的合成。如图，分别提取花瓣紫色和白色部位的DNA，经不同处理后PCR扩增PrF3H基因的启动子区域，电泳检测扩增产物。分析实验结果可以得出的结论是（　　） A．花瓣紫色与白色部位PrF3H基因的碱基序列存在差异 B．白色部位PrF3H基因启动子甲基化程度高于紫色部位 C．PrF3H基因启动子甲基化程度高有利于花色素苷合成 D．启动子甲基化可调控基因表达说明性状并非由基因控制 【答案】B 【分析】生物的性状由基因决定，还受环境条件的影响，是生物的基因和环境共同作用的结果，即表现型=基因型+环境条件。 【详解】A、紫色部位和白色部位PrF3H的碱基序列相同，只是甲基化程度不同，A错误； B、根据电泳结构白色部位加入McrBC后没有出现电泳条带，而McrBC只能切割DNA的甲基化区域，说明白色区域的启动子甲基化程度高，B正确； C、白色部位PrF3H基因启动子甲基化程度高，而色色素表达少，因此可以推测PrF3H基因启动子甲基化程度高不利于花色素苷合成，C错误； D、启动子甲基化属于表观遗传，说明生物性状是由基因决定的，D错误。 故选B。 11．（2024·北京西城·一模）图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程，其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是（    ） A．PCR扩增A时可在引物中加入PstI和XhoI的酶切位点 B．在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌 C．用农杆菌转化植物愈伤组织选择呈现蓝色的组织进行培养 D．启动子若为除草剂诱导启动子将减少细胞物质和能量浪费 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、PCR扩增A后，为使A能与质粒结合形成重组质粒，需要在A的两侧加入相应的限制酶的酶切位点，即在引物中加入PstI和XhoI的酶切位点，A正确； B、由图可知，卡那霉素抗性基因是标记基因，因此在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌，B正确； C、重组质粒中不含GUS基因，导入重组质粒的愈伤组织中不含有该基因，故不会出现蓝色组织，C错误； D、若启动子为抗除草剂诱导启动子，即只有在除草剂存在的情况下抗除草剂基因A才诱导其表达，没有除草剂时不表达，所以减少了细胞物质和能量的浪费，D正确。 故选C。 12．（2024·北京石景山·一模）蛛丝蛋白是一种特殊纤维蛋白，具有强度高、韧性大等特点，在人工肌腱等医学领域有着诱人的前景。某研究小组提取一种丝绒蜘蛛中的蛛丝蛋白基因，将其导入大肠杆菌生产蛛丝蛋白。下列叙述正确的是（　　） A．构建蛛丝蛋白基因表达载体需要限制酶和DNA聚合酶 B．可通过显微注射的方法将蛛丝蛋白基因导入大肠杆菌 C．基因表达载体上的复制原点可调控蛛丝蛋白基因的表达 D．可通过蛋白质工程设计与改造蛛丝蛋白的结构以增强其韧性 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因一DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A．构建蛛丝蛋白基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶，A错误； B．可通过感受态细胞的方法将蛛丝蛋白基因导入大肠杆菌，B错误； C．基因表达载体上的启动子可调控蛛丝蛋白基因的表达，C错误； D．若需对蛛丝蛋白进行设计和改造以增强其韧性，可通过蛋白质工程来实现，D正确。 故答案为：D。 13．（2024·北京丰台·一模）V蛋白对登革热病毒的增殖有抑制作用。V蛋白含有285个氨基酸，其cDNA长1241bp。将V蛋白在大肠杆菌中诱导表达，经纯化后免疫小鼠，最终获得5株分泌V单抗的杂交瘤细胞，提取单抗与V蛋白杂交，电泳结果如下图，相关叙述错误的是（    ） A．V蛋白的cDNA中含有不编码V蛋白的序列 B．获得的5株杂交瘤细胞都能无限增殖 C．用V蛋白免疫小鼠的目的是获得相应抗体 D．可培养5A8杂交瘤细胞大量生产单克隆抗体 【答案】C 【分析】1、单克隆抗体制备的过程：首先用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞，诱导与骨髓瘤细胞融合，第一次筛选获得杂交瘤细胞，第二次筛选获能够产生特定抗体的杂交瘤细胞，再注射到小鼠腹腔中或者体外培养，获得单克隆抗体。 2、构建cDNA文库的方法：提取某生物的mRNA，逆转录形成cDNA单链，然后通过复制形成cDNA双链，与载体体外重组，导入受体菌中储存。 【详解】A、V蛋白含有285个氨基酸，考虑终止密码子，cDNA中的碱基数应该为286×6=1716个，而V蛋白的cDNA有1241bp（碱基对），说明V蛋白的cDNA中含有不编码V蛋白的序列，A正确； B、5株杂交瘤细胞都能分泌单抗，这些杂交瘤细胞都能无限增殖，B正确； C、用V蛋白免疫小鼠的目的是能产生特定抗体的B淋巴细胞，C错误； D、如图5A8杂交瘤细胞产生的单抗与其他组相比，反应更强，说明其产生的抗体量更多，D正确。 故选C。 14．（2024·北京密云·模拟预测）研究者获得导入S基因的基因编辑小鼠的过程如下图所示，下列相关叙述正确的是（　　） A．过程①一般需要用促性腺激素处理 B．过程②是在雌鼠a的输卵管内完成 C．过程③需将表达载体注射到子宫中 D．过程④需抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥 【答案】A 【分析】胚胎移植的生理学基础：①动物发情排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。②早期胚胎在一定时间内处于游离状态。这就为胚胎的收集提供了可能。③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体的存活提供了可能。④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。 【详解】A、过程①用促性腺激素对供体进行超数排卵处理，获得更多的卵母细胞，A正确； B、过程②是体外受精，体外受精是将获能的精子和培养成熟的卵子置于适当的培养液中共同培养一段时间，来促使它们完成受精，B错误； C、③是导入含S基因的表达载体，应该将含S基因的表达载体通过显微注射法注射至小鼠的受精卵中，C错误； D、受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应，故过程④不需要抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥，D错误。 故选A。 15．（2024·北京门头沟·一模）某生物学社团利用洋葱进行实验。下列相关叙述正确的是（    ） A．洋葱鳞片叶内、外表皮细胞均可用于探究植物细胞的吸水和失水 B．洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂并水浴加热，溶液由蓝色变为紫色 C．制作洋葱根尖有丝分裂装片时，解离、漂洗都能更好地将细胞分散开 D．粗提取的洋葱DNA溶于2mol·L-1 NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色 【答案】A 【分析】观察细胞有丝分裂实验的步骤：解离（解离液由盐酸和酒精组成，目的是使细胞分散开来）、漂洗（洗去解离液，便于染色）、染色（用甲紫、醋酸洋红等碱性染料）、制片（该过程中压片是为了将根尖细胞压成薄层，使之不相互重叠影响观察）和观察（先低倍镜观察，后高倍镜观察）。 【详解】A、洋葱鳞片叶内、外表皮细胞均含有大液泡，因而均可用于探究植物细胞的吸水和失水，只不过外表皮细胞因为液泡有颜色而更容易观察，A正确； B、洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂，由于洋葱匀浆中含有还原糖，此时在水浴加热的条件下溶液由蓝色变为砖红色，B错误； C、制作根尖有丝分裂装片时，解离、按压盖玻片得目的都是为了获得单层细胞，即这些操作均能更好地将细胞分散开，漂洗的目的是洗去解离液，C错误； D、粗提取的DNA溶于2mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后经过水浴加热可显蓝色，D错误。 故选A。 二、非选择题 16．（2024·北京·高考真题）灵敏的嗅觉对多数哺乳动物的生存非常重要，能识别多种气味分子的嗅觉神经元位于哺乳动物的鼻腔上皮。科学家以大鼠为材料，对气味分子的识别机制进行了研究。 (1)嗅觉神经元的树突末梢作为感受器，在气味分子的刺激下产生 ，经嗅觉神经元轴突末端与下一个神经元形成的 将信息传递到嗅觉中枢，产生嗅觉。 (2)初步研究表明，气味受体基因属于一个大的基因家族。大鼠中该家族的各个基因含有一些共同序列（保守序列），也含有一些有差异的序列（非保守序列）。不同气味受体能特异识别相应气味分子的关键在于 序列所编码的蛋白区段。 (3)为了分离鉴定嗅觉神经元中的气味受体基因，科学家依据上述保守序列设计了若干对引物（图甲），利用PCR技术从大鼠鼻腔上皮组织mRNA的逆转录产物中分别扩增基因片段，再用限制酶HinfⅠ对扩增产物进行充分酶切。图乙显示用某对引物扩增得到的PCR产物（A）及其酶切片段（B）的电泳结果。结果表明酶切片段长度之和大于PCR产物长度，推断PCR产物由 组成。 (4)在上述实验基础上，科学家们鉴定出多种气味受体，并解析了嗅觉神经元细胞膜上信号转导的部分过程（图丙）。 如果钠离子通道由气味分子直接开启，会使嗅觉敏感度大大降低。根据图丙所示机制，解释少量的气味分子即可被动物感知的原因 。 【答案】(1) 兴奋/动作电位/神经冲动 突触 (2)非保守 (3)长度相同但非保守序列不同的DNA片段 (4)少量的气体分子通过活化的G蛋白、活化的C酶，在C酶的催化下合成大量的cAMP使Na+通道打开，Na+内流，神经元细胞膜上产生动作电位，气味分子被动物感知 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 感受器 接受刺激并产生兴奋 感受器接受刺激后产生兴奋，兴奋通过传入神经将兴奋传到神经中枢，在大脑皮层产生相应的感觉 PCR产物含保守序列和非保守序列 蛋白质功能不同，说明其结构不同 关键在于非保守序列所编码的蛋白区段 不同气味受体能特异识别相应气味分子 说明不同气味受体的蛋白质结构不同 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）气味分子刺激感受器产生兴奋。嗅觉神经元轴突末端、神经元间隙与下一个神经元组成突触，包括突触前膜、突触间隙和突触后膜。 （2）不同气味受体能特异性识别相应气味分子的关键在于蛋白质中结构不同的部分，由非保守序列编码。 （3）由图可知，PCR产物含保守序列和非保守序列，若非保守序列不同，酶切产物的长度可能不同，导致酶切片段长度之和大于PCR产物长度，因此PCR产物由长度相同但非保守序列不同的DNA片段组成。 （4）由图丙可知，少量的气体分子通过活化G蛋白使得C酶活化，在C酶的催化下，由ATP合成大量的cAMP ，促使Na+通道打开，Na+内流，导致神经元细胞膜上产生动作电位，气味分子被动物感知。 17．（2023·北京·高考真题）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。 (1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与 互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。 (2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从 点到 点。 (3)为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK： ①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。请完善制备小鼠IK的技术路线： →连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→ →获得小鼠IK。 (4)各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是 。 【答案】(1)A/腺嘌呤 (2) Q R (3) 将Ce酶基因和Er基因连接 饲喂口服药T (4)大多数B细胞没有被BrdU标记 【分析】DNA分子的复制时间：有丝分裂和减数分裂间期；条件：模板（DNA的双链）、能量（ATP水解提供）、酶（解旋酶和DNA聚合酶等）、原料（游离的脱氧核苷酸）；过程：边解旋边复制；结果：一条DNA复制出两条DNA；特点：半保留复制。 【详解】（1）分析题意可知，EdU和BrdU都是胸腺嘧啶（T）类似物，根据碱基互补配对的原则可知，掺入DNA的EdU和BrdU均能与A（腺嘌呤）互补配对，并可以被分别检测。 （2）DNA分子复制时会发生模板链与子链的碱基互补配对，据题可知，将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，则EdU会与A结合，导致子链出现放射性，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，则BrdU也会与A结合，使放射性增强，最终实现双标记，随复制完成达到峰值，故结合题图可知，图中反映DNA复制所需时长的是从Q点到R点。　 （3）分析题意，要制备IK小鼠，需要用诱导型基因敲除小鼠，而饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，结合所给实验材料及药物可知，制备小鼠IK的技术路线为：将Ce酶基因和Er基因连接（Ce酶可作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失）→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→饲喂口服药T（诱导Er蛋白进入细胞核）→获得小鼠IK。 （4）据题可知，变胖过程中增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ），由于但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，若先用EdU饲喂小鼠IK，各种细胞DNA复制所需时间基本相同，t2时间已经经过一个细胞周期，所有的细胞应都含有EdU标记，实验假设是变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，该过程已经复制的B细胞直接分裂，不会再有DNA复制过程，故t2时间后用BrdU饲喂则不起作用，即大多数B细胞没有被BrdU标记。 18．（2022·北京·高考真题）生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。 (1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是 。 (2)为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案1相比，方案2的主要优势是 ，因而被用于制备监测鱼（MO）。 (3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。 Ⅰ.启动子： 。 ①ERE②UAS③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P肌） Ⅱ.基因： A．GFP    B．Gal4    C．雌激素受体基因（ER）  D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg） (4)SM不育的原因是：成体SM自身产生雌激素，与受体结合后 造成不育。 (5)使拟用于实际监测的SM不育的目的是 。 【答案】(1)显微注射 (2)监测灵敏度更高 (3) ② D (4)激活ERE诱导Gal4表达，Gal4结合UAS诱导dg表达，生殖细胞凋亡 (5)避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题 【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 【详解】（1）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，所以将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是显微注射法。 （2）由图可知，方案1E物质-受体复合物激活ERE，使GFP基因表达，方案2 E物质-受体复合物先激活ERE获得Gal4蛋白，然后Gal4蛋白激活UAS启动子，使GFP基因表达，方案2GFP蛋白表达量大，更灵敏。 （3）MO和另一亲本（X）杂交获得SM，MO是方案2获得，所以亲本X启动子选择UAS。要获得SM是不育个体，MO是可育的所以X必须有仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）。 （4）成体SM自身产生雌激素，与受体结合后形成复合物，激活ERE诱导Gal4表达，Gal4与UAS启动子结合诱导dg表达，使生殖细胞凋亡。 （5）监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，需要SM不育。 19．（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 筛选组织特异表达的基因 筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。 真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。 很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。 获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。 研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。 (1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生 的过程称为细胞分化，分化是基因 的结果。 (2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。 A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 C．一个增强子只能作用于一个基本启动子 D．很多增强子在不同组织中的活性不同 (3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测 。 (4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 （略）。 【答案】(1) 稳定性差异 选择性表达 (2)C (3)各组织器官中G和H的mRNA (4) 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 细胞分化 细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程 分化是基因选择性表达的结果 基因表达 包括转录和翻译 若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR等技术检测其他器官细胞中G和H两个基因是否转录出相应的mRNA （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。分化是基因选择性表达的结果。 （2）AB、依据题干“增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因 表达的调控序列”可知,增强子是含有特定碱基序列的DNA片 段，增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体 上，AB正确； C、由图C可知，一个增强子可作用于多个基本启动子，C错误； C、依据题干“很多增强子具有组织特异的活性”可知，很多增强子在不同组织中的活性不同，D正确。 故选C。 （3）若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR等技术检测其他器官细胞中G和H两个基因是否转录出相应的 mRNA。 （4）增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。而当增强子捕获载体的插入位点位于基因内部，会引起造成该增强子所调控的基因发生突变，为研究某目的基因的功能，可将图B所示载体去掉基本启动子，则该载体插入基因内部后才会发挥作用，图如下： 。 20．（2024·北京海淀·二模）葡萄糖二酸（GA）可作为原料应用于食品、能源和医药等领域，科研人员通过改造工程菌以实现GA的大量生产。 (1)M酶和U酶是GA合成途径中的两个关键酶，科研人员将图1所示质粒1导入 处理的大肠杆菌，改造后的大肠杆菌可合成GA． (2)为实现对工程菌合成GA的实时监测，科研人员设计了质粒2。并进行下表所示两种检测方案。 方案一 质粒1和2共同导入大肠杆菌菌株E中 在液体培养基中培养一段时间 菌液分为5组 每组上清液加入适量GA，检测荧光强度。 方案二 质粒1和2分别导入大肠杆菌菌株E和菌株S中 将E菌液与S菌液混合，混合菌液培养一段时间后分为5组 ①据图1分析检测方案的原理为 。 ②检测结果如图2，据图对比两种方案，并结合两种质粒适用范围，选择其中一种更优方案并说明理由： 。 (3)进一步发现由于产物GA呈酸性影响了大肠杆菌合成GA的能力，因而科研人员尝试以酵母菌为受体细胞导入质粒1，改造后的酵母菌以葡萄糖为原料合成并分泌GA的途径如图3。但M酶的活性远小于U酶，限制了GA产量。为改进M酶的催化效率，将含不同突变的M酶基因分别导入酵母菌，利用上述所选方案菌株监测不同酵母菌的GA产量，操作为 ，取等量培养液，测定其荧光值和吸光度（反应菌体浑浊程度），挑选 高的菌株即为GA高产菌株。 (4)据图3分析还可以通过 等方法改造酵母菌以提高GA的产量。 【答案】(1)Ca2+ (2) 菌株E可产生 GA，GA 与C蛋白结合激活 GFP 基因转录，通过荧光强度反映 GA 含量 方案二更优。理由:与方案一相比，方案二单位菌体密度的荧光强度更高，检测 GA 更灵敏，且还可检测真核生物合成GA的量 (3) 将不同酵母菌培养液上清分别与S菌液混合并培养 荧光值与吸光度比值 (4)提高I酶和N酶的表达量(合理即可) 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）为了增大细胞膜的通透性，通常用CaCl2处理大肠杆菌，以增大转化的成功率。 （2）①结合图1可知，菌株E可产生 GA，GA 与C蛋白结合激活 GFP 基因转录，通过荧光强度反映 GA 含量，因此不管是方案1将质粒1和2共同导入大肠杆菌菌株E中，还是方案2将质粒1和2分别导入大肠杆菌菌株E和菌株S中，都可以通过荧光强度反映 GA 含量。 ②与方案一相比，方案二单位菌体密度的荧光强度更高，检测 GA 更灵敏，且还可检测真核生物合成GA的量，因此方案二更优。 （3）参考方案2，应将不同酵母菌培养液上清分别与S菌液混合并培养，取等量培养液，测定其荧光值和吸光度；挑选荧光值（反映GA的合成）与吸光度（反映菌体密度）比值高的菌株即为GA高产菌株。 （4）结合图3可知，I酶可促进葡萄糖-6-P转化为肌醇-3-P，N酶可以促进NADH转化为NAD+和H+，因此提高I酶和N酶的表达量可以提高GA的产量。 21．（2024·北京西城·二模）科研人员获得了携带两种抗稻瘟病的抗性基因Pib和Pikm的水稻品系——川抗30，以及携带螟虫抗性基因CrylC的水稻品系——昌恢。为获得同时携带抗螟虫基因和两种抗稻瘟病基因的改良株系，开展了相关研究。 (1)水稻的稻瘟病抗性与敏感为一对 。利用川抗30品系与野生型稻瘟病敏感水稻杂交，F1表现为稻瘟病抗性，F1与野生型杂交，子代性状及分离比为 ，证明Pib和Pikm位于非同源染色体上。 (2)昌恢品系水稻在品质和产量上明显优于川抗30，科研人员结合分子标记技术筛选目标基因进行杂交育种，以获得改良优质水稻。请写出制备优质、高产的纯合双抗（抗螟虫和抗稻瘟病）水稻的杂交育种技术路线（总体思路） 。 (3)研究者利用PCR技术检测改良优质水稻中是否含有Pib基因。 ①下表为利用PCR进行检测的反应体系的配方，请将表格补充完整。 PCR反应体系 组分 总体积/10μL 10倍浓缩的扩增缓冲液 1μL i 1.5μL 4种脱氧核苷酸等量混合液（2.5mmol·L-1） 0.5μL 引物I/II（5.0μmol·L-1） 1/1μL Taq DNA聚合酶 0．20μL H2O ii ②图为Pib基因的部分序列。 5'—…AATGCCC…ATGTGGA…—3' 3'—…TTACGGG…TACACCT…—5' 根据图，选择 作为引物对Pib基因进行扩增。 A．5'—…AATGCCC…—3'    B．5'—…TCCACAT…—3' C．5'—…TTACGGG…—3'    D．5'—…ATGTGGA…—3' 研究者最终确定改良优质水稻具备了相关抗性基因，成功培育出优质、高产的双抗水稻。 (4)检测发现本研究获得的优质双抗水稻的部分性状与昌恢品系相比出现株高上升、千粒重下降的现象，但是利用基因定点编辑技术获得的纯合抗性突变株系，其他性状未发生改变，原因可能是 。请从育种的角度对这两种技术进行评价。 【答案】(1) 相对性状 稻瘟病抗性：敏感=3：1 (2)川抗30与昌恢杂交获得F1，F1与昌恢回交获得F2，利用分子标记技术筛选含有Pib和Pikm基因的植株继续回交昌恢，重复筛选和回交步骤，将Fn所得植株自交，筛选Pib和Pikm纯合的植株。 (3) 改良优质水稻的DNA 4.8μL A和B (4)与稻瘟病抗性基因在同一条染色体上的基因也被保留下来 杂交育种技术简单，但育种周期长；基因编辑技术育种周期短，可定向改变生物的性状，但是技术难度高，存在“脱靶”等潜在风险 【分析】基因工程的基本操作程序： 第一步：目的基因的获取； 第二步：基因表达载体的构建（核心） 1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。2、组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞 1、转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2、常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术，方法的受体细胞多是受精卵。 第四步：目的基因的检测和表达将目的基因导入细菌：感受态细胞法：用Ca2+处理细胞使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。1、首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因。2、其次还要检测目的基因是否转录出mRNA。3、最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术。 【详解】（1）水稻的稻瘟病抗性与敏感为一对相对性状，同一性状的不同表现形式。假设两种抗性基因Pib和Pikm，分别用A，a和B、b表示，位于非同源染色体上，符合自由组合定律。利用川抗30品系与野生型稻瘟病敏感水稻杂交，F1表现为稻瘟病抗性，说明抗性基因是由显性基因控制A、B控制的，F1的基因型为AaBb，与野生型的基因型为aabb杂交，后代的基因型为AaBb，aaBb，Aabb，aabb，性状及分离比为稻瘟病抗性：敏感=3：1。 （2）制备优质、高产的纯合双抗（抗螟虫和抗稻瘟病），杂交育种的总体思路为：川抗30与昌恢杂交获得F1，F1与昌恢回交获得F2，利用分子标记技术筛选含有Pib和Pikm基因的植株继续回交昌恢，重复筛选和回交步骤，将Fn所得植株自交，筛选Pib和Pikm纯合的植株。 （3）①PCR进行检测的反应体系的配方缺少目的基因，因此i改良优质水稻的DNA，反应体系总体积10μL-1-1.5-0.5-1-1-0.2=4.8μL，因此水ii为4.84.8μL。 ②根据已知Pib基因的部分序列以及双链DNA分子的结构特点（反向平行），再结合DNA复制（PCR中）的特点，即子链合成的方向是从5′到3′，应选择引A和B物进行PCR扩增，故选A和B。 （4）基因定点编辑技术获得的纯合抗性突变株系与稻瘟病抗性基因在同一条染色体上的基因也被保留下来,因此其他性状未发生改变。杂交育种和基因编辑技术育种都有优缺点，杂交育种技术简单，但育种周期长；基因编辑技术育种周期短，可定向改变生物的性状，但是技术难度高，存在“脱靶”等潜在风险。 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