2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

“太空婚礼” 2002年12月30日， 两场筹备了10年的“太空婚礼”首次在神舟四号飞船上举行，植物细胞“新人”（黄花烟草和革新一号烟草叶肉细胞原生质体），动物细胞“新人”（小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞），两批新人同时在“产房”--电融合仪内孕育新生命。 这两场“太空婚礼”实质是哪两项细胞工程技术? 植物体细胞杂交 动物细胞融合 温故知新 酶解法去壁 原生质体融合 再生细胞壁 再分化 脱分化 专题2.2 动物细胞工程 2.2.2 动物细胞融合和单克隆抗体 学习目标 1、掌握动物细胞融合与植物体细胞杂交的区别和联系； 2、阐明利用动物细胞融合技术制备单克隆抗体的过程； 3、理解单克隆抗体的特点，认同单克隆抗体在临床上有重要的应用价值。 动物细胞融合技术的发展历史 时间 成果 19世纪30年代 观察到肺结核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理组织中有多核细胞 1858年 观察到正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。 1875年 第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。 1876年 在无脊椎动物中发现了细胞合并现象。 1962年 日本学者冈田发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1965年 英国科学家证实了灭活的病毒可诱发动物细胞融合 1974年 华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。 1975年 Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌稳定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 20世纪80年代 发展出了电融合技术(1985年酵母原生质体电融合) 多核细胞 多核细胞 血液细胞 融合 细胞合并 仙台病毒 灭活的病毒 聚乙二醇（PEG） 杂交瘤细胞 电融合技术 一、动物细胞融合 1.概念 也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。 融合后的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。 受精作用 实例1：自然条件 实例2：人工诱导 1970年人工条件下的人-鼠细胞融合实验 结果： 如何实现人—鼠细胞的融合，动物细胞融合后还有什么用途呢？ 阅读课本P52，并思考下列问题： 1、植物体细胞杂交技术与动物细胞融合有什么不同呢？ 2、动植物细胞在结构上有何区别？这与它们杂交或融合过程有什么影响？ 3、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同？两者的融合过程是否也一样？ 4、为什么灭活的病毒能作诱导剂？不灭活的病毒可以么？ 5、融合后的细胞，有哪几种类型？ 自主学习 A B 一、动物细胞融合 2.原理 生物膜的流动性 3.融合手段 融合后培养基上的细胞有哪些类型？ 考考你 未融合：A、B 两两融合：AA、BB、AB 如果用不灭活的病毒呢？ 细胞会被感染而死亡 了解：灭活的病毒能作诱导剂的机理： 一、动物细胞融合 4.意义 突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。 （种间、属间、科间、动植物之间） 5.应用 成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。 特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体 已成功的案例 生物种类 细胞来源 成功年代 酵母菌-鸡 原生质体—血红细胞 1975年 人-胡萝卜 腹水癌细胞—原生质体 1976年 人-鼠 纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞 1978年 比较：植物体细胞杂交与动物细胞融合 项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合 原理 生物膜的流动性,植物细胞的全能性 生物膜的流动性 杂交前处理 酶解法去壁 胰蛋白酶处理成单个细胞 融合手段 物理法（离心、振荡、电激）、化学法（聚乙二醇） 物理法（离心、振荡、电激）、化学法（聚乙二醇） 灭活的病毒 结果 形成杂种植株 形成杂种细胞 应用 培育作物新品种 主要用于制备单克隆抗体 比较：植物体细胞杂交与动物细胞融合 1.动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较中，正确的是（ ） A.诱导融合的方法完全相同 B.所用的技术手段基本相同 C.所采用的原理完全相同 D.都能形成杂种细胞 牛刀小试 2.下列细胞工程的技术手段与原理不相符合的是(　　) A.动物细胞培养——细胞增殖 B.动物体细胞核移植——细胞的全能性 C.动物细胞融合——细胞膜的流动性 D.植物组织培养——细胞的全能性 20世纪90年代初，英国科学家成功地利用含有单克隆抗体的“生物导弹”瞄准并杀死了癌细胞，使患血癌的一名67岁退休教授与一名女患者的癌细胞奇迹般消失了。 科技力量 材料1：在基因工程中,采用抗原-抗体杂交法检测基因表达产物需用到纯度很高的抗体。 材料2：传统获得抗体的方法：把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体。 用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。 思考： 1、抗体由哪种细胞产生的？ 2、抗体的传统生产方法的缺陷是什么？ 3、能否通过相应的细胞体外培养的方式大量获得抗体? 浆细胞（效应B细胞） 二、单克隆抗体 产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低 不能 合作探究 材料3：浆细胞在体内只能由B细胞或记忆细胞增殖分化而来,不再进行分裂,在体外培养的条件下，也很难分裂。 材料4：骨髓瘤细胞在体外培养条件下能大量增殖。 思考：用什么方法才能让B淋巴细胞在体外培养时既能产生抗体又能大量增殖? 二、单克隆抗体 B淋巴细胞（浆细胞）与瘤细胞融合 1.原理 B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成既能大量增殖又能产生特定抗体的杂交瘤细胞 合作探究 材料4：每一个浆细胞（效应B细胞）只分泌一种特异性抗体 材料5：1975年, 米尔斯坦和柯勒首先将抗原注射入小鼠体内，然后从小鼠脾脏中获得能够产生抗体的B淋巴细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合，得到多种杂交细胞。在特定的选择培养基中可筛选出杂交瘤细胞。经过再次筛选和抗体检测,得到能产生特定抗体的杂交瘤细胞。但纯度达不到100%。 对单一杂交瘤细胞进行克隆培养,获得足够数量的细胞，在体外培养或注射到小鼠体内增殖。从细胞培养液或小鼠的腹水中，可提取出大量抗体。 由于产生抗体的细胞来自一个杂交瘤细胞,故产生的抗体称为单克隆抗体。 二、单克隆抗体 动手：请根据以上材料,讨论并设计单克隆抗体制备过程图。 合作探究 2.过程 2.过程 注射抗原的目的是什么？ 思考： 诱导其融合的方法有哪些？ 融合后培养液中有几种细胞？ 至少筛选几次？筛选的方法和目的分别是什么？ 如何大规模进行培养获得大量的单克隆抗体？ 获得产生相应抗体的B淋巴细胞（浆细胞） 融合后培养基中有哪几种细胞？ 未融合:B淋巴细胞、瘤细胞 两两融合:B-瘤、B-B、瘤-瘤 诱导其融合的方法有哪些？ 注射抗原的目的是什么？ 物理法：离心、振动、电激 化学法：聚乙二醇（PEG) 生物法：灭活的病毒 至少筛选几次？筛选的方法和目的分别是什么？ 第一次筛选： 选择培养基； 筛选出杂交瘤细胞 第二次筛选： 专一抗体检测； 筛选出既能无限增殖又能产生特定抗体的杂交瘤细胞 多孔细胞培养板上培养 （约每孔一个细胞） ↓ 专一抗体检测 ↓ 呈阳性反应即为所需细胞 杂交瘤细胞 如何大规模进行培养获得大量的单克隆抗体？ 既能无限增殖又能产生特定抗体的杂交瘤细胞 注射到小鼠腹腔内增殖; 体外培养 3.概念 由单一的B淋巴细胞经过无性繁殖形成的细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。 牛刀小试 单抗制备过程分哪几步？请用箭头把以下代表单克隆抗体制备过程步骤的图解的字母按正确顺序连接起来。顺序是？ 4.应用 （1）作为诊断试剂——最广泛应用 单克隆抗体最主要的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。 准确、高效、简易、快速 （2）运载药物 4.应用 导向 弹头 思维导图 1.与植物体细胞杂交相比，动物细胞融合的原理及其特有的诱导因子分别是（ ） A.细胞膜的流动性、离心 B.细胞膜的流动性、灭活的病毒 C.细胞的全能性、电激 D.细胞的全能性、灭活的病毒 2.多个基因型为Aa与基因型为Bb的动物体细胞混合，用灭活的病毒处理后，不能获得下列哪种基因型的细胞（ ） A.AAaa B.AaBb C.Aabb D.BBbb 牛刀小试 3.运用细胞工程技术获得单克隆抗体时，下列操作不必要的是（ ） A.对小动物注射抗原 B.融合并筛选杂交瘤细胞 C.培养杂交瘤细胞 D.将胰蛋白酶注入小鼠腹腔 牛刀小试 4.利用单克隆抗体研制而成的“生物导弹”由两部分组成，一是“瞄准装置”，二是杀伤性“弹头”。下列对此描述不正确的是 A.“瞄准装置”由识别癌细胞的单克隆抗体构成 B.“弹头”由放射性同位素、化学药物或细胞毒素等物质构成 C.“弹头”中的药物有选择性杀伤癌细胞的功能 D.“生物导弹”是利用细胞工程技术制备出来的 牛刀小试 5.右图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌抗体的实验方案。据图回答： （1）该方案能达到预期效果吗？__________ 原因是_______________________________________。 （2）图中②为______________过程，常用_________作为诱导剂。该细胞继承了___________________，因此不仅能分泌__________，还有________________本领。 （3）该方案的目的是________________________。 不能 没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生专一抗体的B淋巴细胞 动物细胞融合 灭活病毒 双亲细胞的遗传物质 特异性抗体 大量增殖 制备单克隆抗体 第一次筛选的原理与方法: 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷酸(T)。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径:一条途径是生物合成途径(D途径)，即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径(S途径)，它是利用次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型(HGPRT)细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 课外读 第一次筛选：HAT选择培养基中筛选（筛选出杂交瘤细胞 ) 氨基蝶呤（阻断合成DNA的D途径） 课外读 课外读 第二次筛选的原理和方法:在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞(理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞)，再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。 闻玉梅院士详解“单克隆抗体”新思路 上个月，多名新冠肺炎重症患者接受血浆抗体治疗效果显著的消息传出后，“血浆治疗”一时大热。 有人称其为抗疫“新希望”，也有人质疑血浆治疗存诸多风险，且来源是一大问题，只能算作一根“稻草”。 “不要只盯着血浆，血细胞也是个‘宝’！”2月15日，中国工程院院士、治疗型疫苗国家工程实验室主任闻玉梅在接受《中国科学报》独家专访时表示，利用最新技术，将恢复期病人产生的特异性抗体的记忆B细胞制备成单克隆抗体，不仅不愁“数量”，安全性也相对更高。 闻玉梅还表示，做单克隆抗体也很快，“我们一个半月左右就能做出来”。 安全、快速、量产，单克隆抗体会比血浆治疗更高效吗？ 课外读 在吸水材料的牵引下，待测抗原在试条上向上走，首先与金标抗体结合成抗原抗体复合物，抗原抗体复合物上行到检测线时，被测抗原的另一结合位点与包被在此处的单抗结合，形成两个抗体结合一个抗原(双抗体夹心)的金标复合物，因有金颗粒在此沉积，故检测线显红色。未结合抗原的金标抗体上行到对照线时，与"抗金标抗体"结合，所以对照线也显红色。 胶体金法新冠病毒检测 课外读 $$