1.2 纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得（第2课时）教学课件-2023-2024学年高二下学期生物学浙科版（2019）选择性必修三

第一章 发酵工程 第二节 纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得（第2课时） 素养目标 开展稀释涂布平板法的操作和土壤中分解 尿素的细菌的分离与计数实验。 科学探究 教学重难点 能说明利用选择培养基筛选微生物的原理，并掌握能分解尿素的微生物的分离与计数实验原理和操作。 课程导入 课程导入 以上精美图画是如何得到的呢？如何从众多微生物中筛选出我们需要的微生物类型？ 1.不同自然环境中生活着的微生物代谢类型不尽相同。 2.许多微生物的代谢方式并不唯一。 3.培养基中营养物质的浓度及比例都会影响微生物的生长。 在培养基中添加（或减去）某种化学成分，使得只有某些特定的微生物能够生长，其它微生物均不能生长，这样的培养基称为选择培养基。 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 蓝细菌 微生物的代谢类型不尽相同 能利用光能或化学能合成有机物----自养型。如蓝细菌 有些微生物以现成的有机物为食----异养型。 大多数细菌、真菌和原生动物 有些微生物为需氧型、有些为厌氧型 有些微生物能固氮，而大多数不能以N2作为氮源 有些菌株由于突变或人工诱变后丧失合成某种特定化合物的能力 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 培养基中营养物质的浓度及比例都会影响微生物的生长 蔗糖浓度 过高——抑制微生物的生长 过低——不能满足微生物生长的需要 培养基的C/N 为4:1时——菌体大量繁殖 为3:1时——菌体繁殖减缓 培养基的N/P 微囊藻在氮磷比为4.5时生长最好 颤藻在氮磷比为0.45时生长最好 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 微生物的代谢方式不唯一 有些不以CO2为唯一（或主要的）碳源；自养型微生物也并非不能利用有机物生长 利用有机物生长 可将CO2转变为有机物 利用光生长 依靠有机物生长 没有有机物 黑暗和有氧条件 有光照和无氧条件 有有机物 紫 色 非 硫 细 菌 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 选择培养基 在培养基中添加（或减去）某种化学成分，使得只有某些特定的微生物能够生长，其他微生物均不能生长，这样的培养基称为选择培养基。 在培养基中添加青霉素后，只有对青霉素有抗性的细菌才能生长 01 在不添加任何氮源的培养基上，只有能固氮的微生物才能生长 02 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 能分解尿素的微生物的分离与计数 实验原理 当培养基中只有尿素作为氮源时，只有能分泌脲酶的微生物才能在该培养基中生长 1 2 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 能分解尿素的微生物的分离与计数 实验原理 根据菌落（固体培养基周围是否出现红色区域进一步鉴定尿素分解菌在相同培养条件下，圆形红色区域愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 能分解尿素的微生物的分离与计数 目的要求 1.利用选择培养基分离能产生脲酶的微生物。 2.观察微生物代谢改变环境pH的现象。 3.利用稀释涂布平板法对微生物进行计数。 尿素培养基(以尿素为唯一氮源的培养基) 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 能分解尿素的微生物的分离与计数 实验材料用具 土壤样品，蛋白胨，酵母提取物，NaCl，琼脂，琼脂糖，葡萄糖，K2HPO4，酚红，蒸馏水，尿素溶液，三角瓶，烧杯，培养皿，有塞试管，试管架，移液器，G6玻璃砂漏斗，装有75%酒精的广口瓶，涂布器，酒精灯，火柴，高压灭菌锅，恒温培养箱等。 琼脂为混合物，含氮，琼脂糖为纯净物，不含氮 从有哺乳动物排泄物的地方取得土样 对尿素进行过滤灭菌 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 能分解尿素的微生物的分离与计数 琼脂是一种未被纯化的混合物，主要成分为琼脂糖和琼脂果胶，还含有少量的含氮化合物，及其它有机杂质和不溶性杂质。琼脂作为微生物固体培养基不可缺少的组成成分，其优点是： ①其主要成分不能被微生物利用； ②可使培养基固化； 实验是用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固化剂，其目的是：尽可能使培养基中只含尿素一种含氮化合物，以防止琼脂中的含氮化合物被以非尿素为氮源的细菌利用，有利于对这类细菌的筛选。 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 能分解尿素的微生物的分离与计数 实验方法步骤 （1）制备培养基 置于250mL三角瓶，加水至100 mL，三角瓶加上封口膜待灭菌 尿素培养基 葡萄糖： 0.1g NaCl： 0.48g K2HPO4： 0.48g 琼脂糖： 2g 酚红： 1mg 尿素： 40mL 实验组 LB全营养培养基 蛋白胨：1g 酵母提取液0.48g NaCl：1g 琼脂：2g 对照组 尿素在制备培养基阶段先不加 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 能分解尿素的微生物的分离与计数 实验方法步骤 （2）灭菌 将盛有9 mL蒸馏水的5支有塞试管、盛有99 mL蒸馏水的250 mL三角瓶以及盛有未灭菌培养基的三角瓶，在121 ℃下灭菌15 min后待用。 尿素溶液由教师用无菌的G6玻璃砂漏斗进行过滤除菌处理后待用。 尿素在高温下分解，不能进行高压蒸汽灭菌,需用无菌的G6玻璃砂漏斗进行过滤除菌 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 能分解尿素的微生物的分离与计数 实验方法步骤 （3）倒平板 培养基冷却至60 ℃，超净工作台内向尿素固体培养基中加入已灭菌的尿素溶液，摇匀后分装至4个培养皿，冷却至凝固。 灭菌结束待培养基冷却至60 ℃时，在超净工作台内将100 mL LB固体培养基分装至4个培养皿中，冷却至凝固，备用。 酒精灯旁 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 能分解尿素的微生物的分离与计数 实验方法步骤 （4）制备土壤细菌悬液 将1g土样加入99m的无菌水中充分振荡后，依次稀释，制备出10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释液。 取样时，尽量只取悬液 取土样1g 10-2土壤稀释液 10-3土壤稀释液 10-4土壤稀释液 10-5土壤稀释液 ＋99ml 无菌水 震荡10 min 取0.5ml 取0.5ml 取0.5ml ＋4.5ml无菌水 ＋4.5ml无菌水 ＋4.5ml无菌水 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 能分解尿素的微生物的分离与计数 实验方法步骤 （5）接种 用移液器分别取0.1mL不同稀释度的土壤稀释液，加入对应标记的培养皿中； 用涂布器在平板上进行涂布，使稀释液均匀地分布在培养基表面 不按照稀释度由大到小的顺序依次操作会影响实验结果。如果先取用稀释度小的溶液，微生物浓度大，再用同一移液器吸取稀释度大的菌液，就会提高后者的细菌数目，从而导致较大的统计误差。 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 微量移液器的使用 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 能分解尿素的微生物的分离与计数 实验方法步骤 （6）培养 将培养皿倒置，置于37°C的恒温培养箱中培养24~48h。 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 能分解尿素的微生物的分离与计数 实验结果 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 能分解尿素的微生物的分离与计数 1.在接种过程中，若用同一移液器吸取菌液，且不按照稀释度由大到小的顺序依次操作，是否会影响实验结果?为什么? 2.根据图1-20所示的培养结果，在估算土壤中能分泌脲酶的微生物的数量时，应统计哪个稀释度的培养皿?为什么? 不按照稀释度由大到小的顺序依次操作会影响实验结果。如果先取用稀释度小的溶液，微生物浓度大，再用同一移液器吸取稀释度大的菌液，就会提高后者的细菌数目，从而导致较大的统计误差。 应统计稀释度为10-3的3个培养皿中的菌落数后取平均值。因为这个浓度的培养皿中菌落数比较适中，计数的结果误差较小。 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 能分解尿素的微生物的分离与计数 3.在图1-20中，培养皿E中许多菌落周围颜色发生明显改变。这种现象说明了什么? 4.在图1-20中，培养皿F中还有许多菌落周围颜色未发生明显改变。针对此现象，有人认为“这些未变色的菌落有可能是能自生固氮的微生物，而不是能产脲酶的微生物”。你认为这个解释合理吗?请说明理由。 这些微生物能够合成脲酶而将尿素分解成氨。氨可使培养基的碱性增强，培养基pH升高，含酚红指示剂的培养基变成红色。而且，红色环带与菌落面积之比越大，说明该菌落分解尿素的作用越强。 意见①：合理，因为自生固氮微生物能在固氮酶的作用下，将N2转化为可利用的氮源，故可在没有氮源的培养基上生长。 意见②：不合理，因为F培养皿中微生物总数相对少于E培养皿，所以如果延长培养时间，培养基仍有可能改变颜色。 意见③：不合理，这些可能是能直接吸收尿素并作为氮源的微生物。可以挑取培养基未变色区域的菌落，清洗除去细胞表面的培养基后接种在无氮源的培养基上，观察其生长情况，从而证明其是否为能固氮的微生物。 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 注意事项 尿素遇高温会分解，所以需进行过滤除菌，然后加入经高压蒸汽灭菌的培养基中 每次稀释前，试管需进行充分振荡处理，目的是使菌体分布均匀 尿素固体培养基既是选择培养基也是鉴别培养基 土样必须用无菌水进行稀释，否则无法判断最后菌种来源于未灭菌的水还是土壤 设置LB固体培养基的目的是说明土壤中存在大量微生物，但能分解尿素的微生物比例低 能分解尿素的微生物的分离与计数 调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物 能分解尿素的微生物的分离与计数 课堂练习 1.在做分离分解尿素的细菌实验时，甲同学从稀释倍数为106对应的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。下列有关叙述存在科学性错误的是（ ） A.甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同，也可能是操作过程出了问题 B.将甲配制的培养基不加土样进行培养作为空白对照，以检验培养基是否受到污染 C.让其他同学用与甲一样的土样进行实验，如果结果与甲一致，则可以证明甲同学无误 D.B、C选项的实验思路都遵循了实验的对照原则 D 解析：甲同学获得的菌落数量远大于其他同学，可能是由于所取的土样不同，也可能操作过程中培养基被污染了，A正确；污染的原因可能是培养基灭菌不彻底，或操作过程没有保证无菌操作，将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，以检验培养基是否受到污染，B正确；让其他同学用与甲同学一样的土样进行实验，如果结果与甲同学一致，则可以证明甲同学操作正确，C正确；B项的实验思路遵循了实验的对照原则，C项的实验思路遵循了实验的重复性原则，D错误。 D 课堂练习 2.为了调查湖水中细菌的污染情况，某小组同学进行了相关实验，其中包括制备培养基、灭菌、接种、培养及菌落观察、计数。下列叙述错误的是（ ） A.牛肉膏蛋白胨培养基中的蛋白胨主要为细菌提供碳源、氮源等 B.配制好的培养基，分装到锥形瓶，放入高压蒸汽灭菌锅灭菌 C.培养接种无菌水的平板作为对照，可检验培养基的灭菌是否合格 D.若实验组平板上出现形态和颜色不同的菌落，说明湖水遭受严重污染 D 解析：牛肉膏蛋白胨培养基中的牛肉膏和蛋白胨含有糖、维生素和有机氮，主要为微生物提供碳源、氮源和维生素等，A正确；配制好的培养基，分装到锥形瓶，加上棉塞，包上牛皮纸，用皮筋勒紧，放入高压蒸汽灭菌锅灭菌，B正确；要使该实验所得结果可靠，可将接种无菌水的平板作为对照，和接种的平板一起培养，若有菌落产生，则说明灭菌不合格，C正确；若实验组平板上出现形态和颜色不同的菌落，说明湖水中存在不同种类的微生物，但不能据此判断湖水遭受严重污染，D错误。 D 课堂练习 2.为了调查湖水中细菌的污染情况，某小组同学进行了相关实验，其中包括制备培养基、灭菌、接种、培养及菌落观察、计数。下列叙述错误的是（ ） A.牛肉膏蛋白胨培养基中的蛋白胨主要为细菌提供碳源、氮源等 B.配制好的培养基，分装到锥形瓶，放入高压蒸汽灭菌锅灭菌 C.培养接种无菌水的平板作为对照，可检验培养基的灭菌是否合格 D.若实验组平板上出现形态和颜色不同的菌落，说明湖水遭受严重污染 B 解析：为了判断培养基是否被杂菌污染，需要设置的对照组是未接种的培养基，即将未接种的培养基与接种的培养基同时培养，若未接种的培养基上出现菌落，说明其被污染，否则没有被污染；用接种了的普通培养基和选择培养基进行对照，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，说明选择培养基具有选择的功能，B正确。故选B。 D Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $$