备课素材：植物杂种细胞的筛选-2023—2024学年高二上学期生物人教版选择性必修3

植物杂种细胞的筛选 2020版高中生物学选择性必修三说，融合后得到的杂种细胞再经过诱导可形成愈伤组织，并可进一步发育成完整的杂种植株： 然而，两个不同亲本的原生质体经诱导融合后,实际得到的是各种原生质体的混合物,包括未融合的、同种细胞融合的和不同种细胞融合的原生质体。因此 ,杂种细胞的筛选是获得真正杂种的关键过程。高考题中常会考到筛选杂种细胞的方法。 那么，如何筛选杂种细胞？ 1. 物理特性筛选法 物理特性筛选法又称机械分离法,指的是利用亲本原生质体的大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率等的差异来筛选杂种细胞的方法。该方法主要包括天然颜色标志分离法和双荧光标记选择法。 ①天然颜色标志分离法指的是用不同颜色的原生质体进行融合,一个亲本通常选含有叶绿体或其他色素质体的组织细胞, 如叶片、茎、花等,另一个亲本则选用不含色素的细胞, 在异源原生质体融合后能明显识别。如非绿色原生质体与含有叶绿体的原生质体的融合,在融合初期根据杂种细胞兼有绿色和白色,可以在显微镜下用微量吸管将杂种细胞吸出来,在带有小格的 Cuprak 培养皿中进行培养。 ②双荧光标记选择法。 对于形态、颜色上都不能区分的情况,可以用不同的荧光素分别标记双亲细胞,如异硫氰酸荧光素(绿色荧光) 和碱性蕊香红荧光素(红色荧光) 。经融合处理后,杂种细胞有两种荧光标记,在荧光显微镜下,用微量吸管吸出杂种细胞,但此方法效率较低。目前还可用荧光活性细胞分类器进行自动分拣,当细胞群体通过细胞分类器时,产生的微滴中只有单个细胞,经电子扫描确定微滴的荧光特征并分类。这种技术准确高效,但仪器较贵, 目前尚难普及。 例 1、为了便于观察细胞融合的状况,通常用不同颜色的原生质体进行融合,若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体,则乙植物可用幼苗的叶片为外植体。 分析:用不同颜色的原生质体进行融合, 以便于观察和选择杂种细胞, 因为甲植物选用无叶绿体的根细胞,则乙选用有叶绿体的叶片细胞,融合初期杂种细胞为半绿半白,据此进行选择。 例 2、研究者通过体细胞杂交技术,探索利用条斑紫菜和拟线紫菜培育杂种紫菜。下列相关叙述正确的是( D ) A.从食用紫菜的动物消化道内提取蛋白酶,用于去除细胞壁 B. 原生质体需在低渗溶液中长期保存, 以防止过度失水而死亡 C. 检测原生质体活力时可用苯酚品红或甲紫溶液处理,活的原生质体被染色 D. 聚乙二醇促进原生质体融合后, 以叶绿体颜色等差异为标志可识别杂种细胞 分析:D选项中,原生质体融合后,可根据 2 种紫 菜的叶绿体颜色差异,识别选出杂种细胞。 2.低密度植板选择法 如果融合产物在失掉可鉴别的特征之前,无法分离出来单独培养,则可在融合处理之后,将原生质体以很低的密度植板在琼脂培养基上,原生质体会彼此分散开,以便追踪个别杂种细胞及其后代。采用这种选择方法,以后就无须再进行突变系的分离。 例 3、将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合 ,在凝固前倒入培养皿,融合原生质体分散固定在平板中,并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于 1 个 融合原生质体。 分析:将融合原生质体以很低的密度在平板中进行培养,1 个融合原生质体会独立分裂形成一块愈伤组织。 3.互补选择法 互补选择法是研究得最多、发展最快的一种选择方法,包括隐性突变互补选择、显性抗性互补选择和显隐性双突变体选择。 ①隐性突变互补选择指的是当两个非等位隐性基因控制的突变体细胞融合后, 由于每一个亲本贡献一个功能正常的等位基因,纠正了亲本对方的缺陷,使杂种细胞表现正常。 该方法包括叶绿素缺失互补和营养缺陷互补。其原理可分别表示为白化(aaBB)+白化(AAbb)→绿色(AAaaBBbb) 、营养缺陷(aaBB)+营养缺陷(AAbb)→ 正常(AAaaBBbb) 。 ②显性抗性互补选择。 很多情况下,植物对抗生素、除草剂或其他有毒药物的抗性为显性。当两个亲本各有1 个显性基因控制的单抗性状时,单抗的双亲细胞融合后产生双抗的杂种细胞,可用选择培养基将其选出来。 例如,以抗 5 甲基色氨酸的胡萝卜原生质体和抗 S 氨乙基半胱氨酸的烟草原生质体作亲本,融合处理后通过对双抗融合体的选择, 目前已获得了这两个亲本的体细胞杂种。 ③显-隐性双突变体是指通过有性杂交的方法,将硝酸盐还原酶缺陷的突变体( 隐性) 与链霉素抗性突变体( 显性) 综合在一个突变系中建立同时具有显、隐性突变的双突变体。它可以与任何一 种无选择标记的原生质体融合 ,根据亲本对方对链霉素敏感以及双突变体特殊的营养需要( 还原氮) ,用加有链霉素但不含还原态氮的培养基可将杂种细胞选择出来。 构成双突变体的隐性性状目前都是用硝酸盐还原酶缺陷,显性性状除链霉素抗性外,还有抗 5-甲基色氨酸、卡那霉素抗性、抗铃兰氨酸等。由于与双突变体融合的亲本无需具有选择标记,这类双突变体可以作为通用的杂交亲本,扩大了研究范围。 例 4、现有甲、乙两个烟草品种,其基因型分别为aaBB和 AAbb ,在光强大于800 勒克斯时都不能生长,这是 aa 或 bb 作用的结果。取甲、乙的花粉分别培养成植株,将其叶肉细胞制成原生质体,并将两者相混,使之融合,诱导产生细胞团。然后放到大于 800 勒克斯光照下培养,结果有的细胞团不能分化,有的能分化发育成植株。 能分化的细胞团是由甲、乙两品种的原生质体融合来的。 分析:甲、乙单倍体植株的原生质体的基因型分别为 aB和 Ab ,两者融合后的杂种细胞基因型为AaBb,两者隐性突变互补, 因此杂种细胞能在光强大于 800 勒克斯时正常生长分化。 4. 双失活筛选法 将一个亲本的原生质体用 50—300 Gy 的 X射线 或 γ 射线辐射处理 ,使细胞核部分或全部失活 ,作为细 胞质供体 ,这项处理可以使未融合的胞质供体细胞不能分裂。另一个亲本用碘乙酸或碘乙酰胺处理 ,这两种物质能抑制糖酵解中的磷酸甘油醛脱氢酶的活性, 使细胞质暂时失活, 因此未融合的受体细胞也不能分裂。融合处理后得到的杂种细胞只有一方亲本的细胞核,形成不对称杂种。 在筛选时,亲本无论是细胞核失活还是细胞质失活,均无法分裂,只有杂种细胞发生互 补作用可以分裂形成愈伤组织, 因此这种筛选方法称为双失活筛选法 。 此方法由于不需要双亲具有选择标志,杂种细胞即可被筛选出来,所以应用较广泛。据统计,现在90%以上的体细胞杂交为不对称融合。 例 5、甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应, 乙植物细胞质基因具有高产效应。 在原生质体融合前,需对原生质体进行处理, 分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞质、细胞核失活。两种原生质体1:1混合后,通过添加适宜浓度的PEG进行融合。 将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合, 在凝固前倒入培养皿,融合原生质体分散固定在平板中,并独立生长、分裂形成愈伤组织。 下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自杂种细胞的理由是(ABD) A. 甲、乙原生质体经处理后失活 ,无法正常生长、分裂 B. 同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活 而不能生长、分裂 C. 培养基含有抑制物质,只有杂种细胞才能正常生长、分裂 D. 杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂 分析：因为甲植物的耐盐碱效应由细胞核基因控制 ,乙植物的高产效应由细胞质基因控制,所以通过处理使甲原生质体的细胞质和乙的细胞核失活。这样甲、乙原生质体的融合为不对称融合,便于杂种细胞的筛选。甲、乙原生质体和同种融合的原生质体因细胞结构不完整,故不能生长、分裂,而杂种细胞由于细胞结构完整可以生长、分裂。 学科网（北京）股份有限公司 $$