68 选择性必修3 第九单元 第52讲 基因工程的基本工具和基本操作程序-【名师导航】2025年高考生物一轮总复习讲义（人教版）

第52讲　基因工程的基本工具和基本操作程序 　1．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。　2．阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。　3．实验：DNA的提取和鉴定。　4．实验：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。 考点1　重组DNA技术的基本工具 一、基因工程的概念 二、重组DNA技术的基本工具 1．限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) 1．(选择性必修3 P71“旁栏思考”)存在于原核生物中的限制酶的作用是______　 _____________________________________________________________________。 2．(选择性必修3 P71“正文”)用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 2．DNA连接酶 3．载体 3．(选择性必修3 P72“旁栏思考”)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用不相同，主要区别在于_________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 4．(选择性必修3 P73“正文”)实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是_______________________　 _____________________________________________________________________。 限制酶的选择原则 (1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图可选择PstⅠ。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，防止破坏目的基因，如图不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切割位点，而且这两种限制酶切割后不会破坏标记基因)。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 (3)根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶，图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。 1．基因工程的原理是基因重组，此种变异是定向的。 (　　) 2．重组DNA技术的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。 (　　) 3．DNA连接酶“缝合”目的基因与载体之间的氢键。 (　　) 4．大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。 (　　) 5．作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 (　　) CRISPR—Cas9基因组编辑系统由向导RNA(也叫SgRNA)和Cas9蛋白组成，向导RNA识别并结合靶基因DNA，Cas9蛋白切断双链DNA形成两个末端。这两个末端通过“断裂修复”重新连接时通常会有个别碱基对的插入或缺失，从而实现基因敲除，原理如图所示。 CRISPR－Cas9基因组编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶，脱靶最可能原因是________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 基因工程工具酶的应用 1．(2023·广东佛山南海区高三摸底测试)下图1表示某DNA片段及限制酶酶切位点，用限制酶XhoⅠ和SalⅠ分别处理该DNA片段后，酶切产物电泳分离的结果如图2所示。下列叙述错误的是(　　) A．不同的限制酶切割DNA后形成的黏性末端可能相同 B．限制酶XhoⅠ与限制酶SalⅠ识别的核苷酸序列不同 C．泳道①②分别是限制酶XhoⅠ和限制酶SalⅠ处理得到的产物 D．用限制酶XhoⅠ和限制酶SalⅠ同时处理该DNA片段，可得到6种电泳产物 2．(2023·湖北选择性考试)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 基因工程载体的应用 3．(2023·深圳一模)表面展示技术是通过重组DNA技术，将外源蛋白与细胞表面的蛋白质组装成融合蛋白，从而可展示在细胞表面。回答下列问题。 (1)若要将芽孢表面蛋白基因cotB与外源的绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，下图中最适合通过绿色荧光(绿色荧光蛋白在紫外光下会产生绿色荧光)确定融合蛋白成功表达的是________。 A　　　　　　　　　　　　B C　　　　　　　　　　　　D 注：AmpR为氨苄青霉素抗性基因；→表示转录方向；UAG，UAA，UGA是终止密码子，AUG是起始密码子。 (2)芽孢表面蛋白是实现表面展示技术的关键蛋白，结合上述材料，试分析该蛋白在表面展示技术中的作用是___________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (3)导入基因表达载体后的芽孢杆菌接种在含有________的固体培养基上，以获得携带载体的单菌落，该过程被称为微生物的________培养。 (4)培养基中可能既有含基因表达载体的单菌落，也有含________的单菌落，因此还需要对DNA进行提取，常用酒精初步分离DNA和蛋白质，这里酒精的作用原理是_______________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (5)若要确定表面展示技术在芽孢杆菌上构建成功，应在紫外光环境下对其进行________水平的检测。 考点2　基因工程的基本操作程序 一、目的基因的筛选与获取 1．筛选合适的目的基因 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变______________或获得______________等的基因。主要是指____________的基因。 (2)筛选目的基因的方法：从相关的已知____________清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 2．利用PCR获取和扩增目的基因 (1)原理：DNA半保留复制。 (2)条件：DNA模板、2种引物、______________________和4种脱氧核苷酸。 (3)PCR反应过程 (4)PCR产物的鉴定：常采用________________来鉴定。 1．(选择性必修3 P78“图3-5”)PCR反应体系中需要同时加入两种引物的原因是__________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 二、基因表达载体的构建——基因工程的核心 1．构建基因表达载体的目的 (1)使目的基因在受体细胞中__________，并且可以遗传给下一代。 (2)使目的基因能够______和发挥作用。 2．基因表达载体的组成 3．基因表达载体的构建过程 三、将目的基因导入受体细胞 四、目的基因的检测与鉴定 2．(选择性必修3 P82“正文”)转基因抗虫棉培育过程中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有______________、________________________。 (1)目的基因的获取方法 ①利用PCR获取和扩增目的基因。 ②人工合成目的基因 a．逆转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA，其过程如下： b．化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下： ③从基因文库中获取目的基因 根据目的基因的有关信息，例如：根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。 (2)基因表达载体中启动子、终止子的来源 ①如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，目的基因中已含有启动子、终止子，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。 ②如果目的基因是通过逆转录或人工方法合成的，则目的基因中不含启动子和终止子。因此，构建基因表达载体时，在目的基因与质粒结合之前，需要在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。 1．目的基因主要指编码蛋白质的基因。 (　　) 2．Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。 (　　) 3．DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。 (　　) 4．PCR扩增完成后，常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 (　　) 5．随着转化方法的研究，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 (　　) 6．检测目的基因是否表达可用抗原—抗体杂交技术。 (　　) 1．设计引物是PCR技术成功的关键步骤之一。下图为某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，请判断是否合理并说明理由。 (1)第1组：____________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________； (2)第2组：____________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 2．URA3基因位于酵母菌5号染色体上，编码的酶参与酵母菌尿嘧啶核苷酸的合成。科研人员利用基因工程敲除酵母菌中的URA3基因，以获得尿嘧啶营养缺陷型酵母菌。从获得的转基因酵母菌中筛选出了多株尿嘧啶营养缺陷型酵母菌，现需验证这些菌株是因URA3基因缺失而导致的。选择实验材料写出实验设计思路。 实验材料：转基因酵母菌、完全培养基、尿嘧啶缺陷型培养基、含URA3基因的重组质粒、不含URA3基因的空质粒。 实验设计思路：______________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 PCR技术及应用 1．(2023·广东省一模)β-丙氨酸作为重要的中间体，广泛应用于医药、食品、化工等领域。L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)能够催化β-丙氨酸的生成，但天然PanD活力(酶活力是指酶催化一定化学反应的能力)较低且易失活。研究人员运用蛋白质工程对酶基因进行分子改造，在未知PanD三维结构和功能关系的情况下，通过易错PCR技术引入随机突变，再进行定向筛选，最终获得活力和稳定性均较高的PanD。回答下列问题。 (1)易错PCR与普通PCR相似，每次循环也包括了__________________________三步，但可通过改变PCR反应条件来提高碱基错配的概率。在PCR反应体系中，Mg2+可以提高已发生错配区域的稳定性，Mn2+可以降低DNA聚合酶对底物的专一性。因此，与普通PCR相比，易错PCR的反应体系中应适当____________(填“提高”或“降低”)Mg2+浓度、____________(填“提高”或“降低”)Mn2+浓度。通过多轮的易错PCR及筛选，可以获取所需的PanD基因。 (2)研究人员对比改造前后的两种PanD，发现改造后的PanD的第305位氨基酸由赖氨酸突变为丝氨酸，推测突变后酶活力升高的原因是__________________　 _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (3)为将能表达高活力PanD的大肠杆菌应用于工业发酵生产β-丙氨酸，研究人员还探究了发酵的最佳反应条件，研究中发现了随着底物浓度升高，β-丙氨酸产量下降的现象，推测其原因可能是______________________________________　 _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 因此在工业生产中，要采用________(填“一次足量添加”或“多次分批补料”)的投料策略。 基因工程的基本操作程序 2．(2023·广州市一模)为使玉米获得抗除草剂性状，科研人员进行了相关操作(如图所示)。含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，其正确表达产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列叙述错误的是(　　) A．T-DNA可将基因G转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上 B．利用物质K和抗生素进行筛选1，可获得农杆菌的蓝色菌落 C．利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株 D．愈伤组织重新分化为芽、根等器官的过程中，需要添加植物激素 3．(2023·广东广州第二中学校联考模拟预测)人血清白蛋白(HSA)在临床上的需求量大，由于其来源有限和有生物污染的风险，重组人血清白蛋白(rHSA)，成为其重要的替代品。科研人员将HSA基因转入酵母菌细胞，获得了重组人血清白蛋白。下图为酵母菌基因改造以及工业化发酵生产rHSA的过程示意图，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ是四种不同的限制酶，各自识别的酶切位点如表所示。请回答： 限制酶 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 识别序列及切割位点 (1)工业化发酵生产rHSA的过程一般包括菌种的选育，扩大培养、______________、接种、发酵罐内发酵、产品的分离、提纯等方面，其中，______________是该工程的中心环节。 (2)利用PCR技术扩增HSA基因需要引物，设计引物的原则是_____________________________________________________________________。(答出两点即可) (3)科研人员将HSA基因插入质粒中时，最好选择限制酶______________进行共同切割，原因是________________________________________(答出2点即可)。 (4)构建的基因表达载体中需要使用酵母菌蛋白基因的启动子AOX，原因是____________________________________________。将受体酵母菌置于含有_____________________的培养基中进行筛选培养，以获得能表达HSA的细胞。 4．(2023·山东等级考)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________________(答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了______________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 考点3　(探究·实践)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 一、DNA的粗提取与鉴定 1．实验原理 2．实验步骤 二、DNA片段的扩增及电泳鉴定 1．实验基础 (1)PCR原理：利用了________________原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 (2)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷______的电极移动，这个过程就是电泳。 (3)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的____________等有关。 2．实验步骤 (1)DNA片段的扩增 (2)DNA片段的电泳鉴定 ①根据待分离DNA片段的大小，用____________配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在________或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的__________混匀。 ②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 ③待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入________内。 ④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶__________为宜。 ⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用____________将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 ⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 ⑦取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 1．DNA粗提取中的注意事项 (1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。 (2)加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。 (3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。 (4)提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。 (5)在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。 2．DNA片段的扩增及电泳鉴定的注意事项 (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 (2)缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 (3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 (4)在进行操作时，一定戴好一次性手套。 1．(2023·广东梅州二模)不同生物的DNA的提取方法有所不同，DNA提取的原理和实验流程大致相同(如图所示)。下列说法错误的是(　　) A．破碎细胞在冷冻条件下进行，可将组织材料冻裂和降低DNA酶的活性 B．溶于酒精中的可能有某些盐类、蛋白质、糖类或其他大分子物质 C．DNA粗提取时离心需使用塑料离心管，用二苯胺试剂对离心结果进行鉴定 D．鉴定絮状物中DNA时，需用2 mol·L-1 NaCl溶液溶解DNA后加入二苯胺试剂直接观察 2．(2022·山东等级考)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　　) A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 3．(2023·湖北武汉二模)由于某目的基因酶切后的末端为平末端，载体E只有产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。据图分析，下列叙述正确的是(　　) A．通过PCR扩增获取目的基因是基因工程的核心工作 B．为了便于该目的基因接入载体E，可用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P C．载体P只能作为中间载体，是因为其没有表达该目的基因的启动子与终止子 D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体成功导入受体细胞 1．核心概念 (1)(选择性必修3 P67)基因工程：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 (2)(选择性必修3 P72)质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 (3)(选择性必修3 P76)目的基因：指在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 (4)(选择性必修3 P81)转化：指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 (5)(选择性必修3 P84)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 2．结论语句 (1)(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 (2)(选择性必修3 P72)在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。这些质粒上常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 (3)(选择性必修3 P74)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。 (4)(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。 (5)(选择性必修3 P80)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，它还必须有启动子、终止子等。 (6)(选择性必修3 P84)在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 1．(2020·北京等级考)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是(　　) A．①＋③　　　　 B．①＋② C．③＋② D．③＋④ 2．(2023·广东选择性考试)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。 回答下列问题： (1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与________植株的种子大小相近。 (2)用PCR反应扩增DA1基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备__________________。 (3)转化后，T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(图1)，用于后续验证突变基因与表型的关系。 ①农杆菌转化T0植株并自交，将T1种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了____________________________________。 ②T1阳性植株自交所得的T2种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约________%的培养基中幼苗继续培养。 ③将②中选出的T2阳性植株________(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。 为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见图2，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。 【研读教材】 自主诊断 考点1　一、DNA分子　转基因　遗传特性　生物类型　基因重组 二、1．原核生物　某种特定核苷酸序列　磷酸二酯键　黏性末端　2．磷酸二酯键　大肠杆菌　黏性末端　黏性末端和平末端　3．噬菌体　一个至多个　自我复制　受体DNA　标记 考点2　一、1．(1)受体细胞性状　预期表达产物　编码蛋白质　(2)结构和功能　2．(2)耐高温的DNA聚合酶　(3)50 ℃　72 ℃　(4)琼脂糖凝胶电泳 二、1．(1)稳定存在　(2)表达　2．RNA聚合酶　转录 三、花粉管通道　TDNA　染色体DNA　显微注射　受精卵　Ca2+ 四、染色体DNA　目的基因　mRNA　抗原—抗体 【实验基础】 自主诊断 考点3　一、1．酒精　2 mol/L　蓝色　2．白色丝状物　二苯胺 二、1．(1)DNA的热变性　(2)相反　(3)大小和构象　2．(1)微量移液器　微量离心管　使反应液集中在管的底部　(2)电泳缓冲液　沸水浴　核酸染料　电泳槽　1 mm　微量移液器 20 / 20 学科网（北京）股份有限公司 第52讲　基因工程的基本 工具和基本操作程序 考点1 研读教材·夯实必备知识 教材隐性知识 1．提示：切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害 2．提示：防止质粒和目的基因的自我环化及质粒和目的基因的反向连接 3．提示：DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是将单个的脱氧核苷酸连接到脱氧核苷酸链上 4．提示：对靶细胞具有较高的转化效率；不能增殖，对细胞无害 澄清概念 1．√　 2．×　提示：载体是DNA重组技术所需的工具，不是工具酶。 3．×　提示：DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。 4．√　5．√　 思考探究·达成学科素养 提示：其他DNA序列也含有与向导RNA(SgRNA)互补配对的序列 ，造成向导RNA(SgRNA)错误结合DNA序列而脱靶，而且SgRNA的序列越短，脱靶率会越高 考向演练·提升关键能力 1．C　2．D　 3．(1)C　(2)芽孢表面蛋白是可以定位在细胞表面的，在与外源蛋白形成融合蛋白后，可将外源蛋白展示(定位在芽孢杆菌表面)　(3)氨苄青霉素(Amp)　选择　(4)空载体　DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精　(5)个体(细胞) 考点2 研读教材·夯实必备知识 教材隐性知识 1．提示：DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，且DNA两条单链的序列不同，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增 2．提示：抗原—抗体杂交　采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫 澄清概念 1．√　2．√　 3．×　提示：DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 4．√　5．√　6．√ 思考探究·达成学科素养 1．提示：不合理，引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效　不合理，引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 2．提示：将转基因酵母菌随机分为两组，一组导入含有URA3基因的重组质粒，一组导入不含URA3基因的空质粒，再将两组酵母菌接种到尿嘧啶缺陷型培养基，观察生长状况 考向演练·提升关键能力 1．(1)变性、复性、延伸　提高　提高 (2)组成PanD的氨基酸种类改变，导致酶的空间结构发生改变，进而使酶活力升高　(3)随着底物浓度升高，发酵液浓度增加，进而使大肠杆菌失水较多，甚至死亡，不能高效地表达高活力PanD　多次分批补料 2．B　 3．(1)培养基的配制、灭菌　发酵罐内发酵 (2)与模板链碱基互补配对，引物之间或引物内部不能互补配对，引物长度通常为20～30个核苷酸　(3)Ⅱ、Ⅳ　质粒上没有限制酶Ⅲ的识别位点；使用限制酶Ⅰ会使质粒的启动子丢失或标记基因被破坏；使用两种不同的限制酶可以避免目的基因和质粒反向连接　(4)AOX有利于HAS基因在酵母菌细胞内的表达　四环素 4．(1)RNA聚合酶　限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等　 (2)F2和R1(或F1和R2)　a链　(3)J-V5融合蛋白　不是 考点3 对应练习 1．D　[破碎细胞在冷冻条件下进行，可将组织材料冻裂，方便研磨，低温可以降低DNA酶的活性，防止DNA被降解，A正确；DNA不溶于酒精，但细胞中的某些物质却可以溶于酒精，据此推测，溶于酒精中的可能有某些盐类、蛋白质、糖类或其他大分子物质，B正确；DNA容易吸附在玻璃表面，使用塑料离心管可减少提取过程中DNA的损失，用二苯胺试剂对离心结果进行鉴定，C正确；鉴定絮状物中DNA时，需用2 mol·L-1 NaCl溶液溶解DNA，向溶液中加入二苯胺试剂后，需要置于沸水中加热，D错误。] 2．B　[低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一起析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。] 3．C　[基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，不是通过PCR扩增获取目的基因，A错误；由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，据图可知，中间载体P和载体E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶识别序列，故可选用XhoⅠ和PstⅠ酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcoRV识别位点，并且其切割的为平末端，可以用于连接目的基因，SmaⅠ酶虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于XhoⅠ和PstⅠ酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割，B错误；由图可知，载体P是中间载体，不含有表达目的基因的启动子和终止子，C正确；受体细胞表现出抗性基因的相应性状，可能是导入了重组质粒，也可能只导入了空质粒(不含目的基因的质粒)，D错误。] 真题感悟·明确考向 1．B　 2．(1)野生型　(2)载体(Ti质粒)　启动子和终止子　(3)①DA1基因和卡那霉素抗性基因　②75　③自交　100　 $$ 课时分层作业(五十二) 1．B　[对质粒进行改造是让它增加一种限制酶的酶切位点，其他酶切位点又不能被破坏，故只能用EcoRⅠ切割质粒后增加一部分含有MseⅠ酶切位点的片段，这样保证了在基因工程中目的基因和抗性基因结构的完整性。因此，应先用限制酶EcoRⅠ切割，然后用DNA聚合酶合成MseⅠ酶的识别序列，最后利用DNA连接酶形成环状质粒，B正确。] 2．B　[基因的启动子方向有不同，说明转录时不是都以DNA的同一条单链为模板，A正确；这些基因在叶绿体外合成蛋白质，由叶绿体转运肽引导合成的蛋白质进入叶绿体，B错误；卡那霉素抗性基因不在T-DNA上，应选用潮霉素培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞，C正确；用抗原—抗体杂交技术检测是否有相应的蛋白质产生，从而检测四种酶在转基因水稻中的表达情况，D正确。] 3．C　[细菌溶源化过程中发生了噬菌体基因和细菌基因的重组，A正确；温和噬菌体可以将遗传物质注入细菌，并且将遗传物质整合到细菌细胞内，所以可以作为基因工程的载体，B正确；分离定律适用于进行有性生殖的真核生物的细胞核遗传，子代细菌中噬菌体基因的遗传不遵循分离定律，C错误；发生溶源化的细菌细胞内含有噬菌体和细菌的遗传物质，所以通过检测子代细菌DNA可以证明是否发生溶源化现象，D正确。] 4．B　[该图表示PCR循环中的复性环节，A错误；引物的长度、引物中碱基的比例以及反应体系中引物的浓度都与扩增产物的特异性相关，B正确；脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到3′端，C错误；用图中引物扩增至少三个循环后可获得目的产物，D错误。] 5．C　[过程①是以RNA为模板合成DNA的过程，为逆转录，需要逆转录酶，A正确；质粒为环状DNA分子，用限制酶BamHⅠ在Ti质粒切开一个切口将暴露出两个游离的磷酸基团，B正确；过程③将重组质粒转入农杆菌之前，需先用Ca2+(不是Ca2+载体)处理农杆菌，使其容易吸收周围的DNA分子，C错误；由于导入的目的基因不一定表达，因此过程⑤产生的木瓜植株即使有抗PRSV基因也不一定具有抗PRSV的性状，D正确。] 6．C　[由题干可知，CTAB-核酸复合物溶于2 mol/L NaCl溶液即高盐溶液中，DNA不溶于乙醇，因此可通过加乙醇使核酸沉淀并去除CTAB，A正确。由题干“上清液中加入氯仿、异戊醇混合液” 可知，氯仿和异戊醇抽提可除去蛋白质、多糖等杂质；由题干“充分混匀，离心取上清液，加入异丙醇于－20 ℃沉淀，再用RNA酶、95%的乙醇沉淀DNA”可知，异丙醇或乙醇可将DNA沉淀分离，B正确。叶绿体DNA和质粒DNA不与核蛋白结合，因此CTAB不能通过加速解聚核蛋白来提取这两种DNA，C错误。DNA在一定温度水浴条件下，与二苯胺反应呈蓝色，因此可利用二苯胺溶液鉴定，D正确。] 7．C　[过程①是FPP合成酶基因转录形成mRNA，需要RNA聚合酶，A错误；由图可知，酵母细胞能合成FPP合成酶，但不能合成ADS酶和CYP71AV1酶，即酵母细胞缺乏ADS酶基因和CYP71AV1酶基因。因此，要培育能产生青蒿素的酵母细胞，需要向酵母细胞中导入ADS酶基因、CYP71AV1酶基因，B错误；由图示可知，FPP转化成固醇需要ERG9酶催化，故由于ERG9酶等的影响，培育的产青蒿素酵母菌合成的青蒿素仍可能很少，C正确；在野生植物中提取青蒿素治疗疟疾，体现了生物多样性的直接价值，D错误。] 8．(1)②③　耐高温的DNA聚合　琼脂糖凝胶电泳　(2)终止子和终止密码子　MZF1-AS1可以与PARP1蛋白质BRCT功能区结合　(3)过量表达MZF1-AS1能促进PARP1和E2F1两种蛋白质的结合，敲除MZF1-AS1或者给予RNA酶处理后两蛋白质相互作用减弱　(4)通过促进PARP1和E2F1两种蛋白质的结合，促进肿瘤细胞的增殖 2 / 2 学科网（北京）股份有限公司 $$ 课时分层作业(五十二)　基因工程的基本工具和基本操作程序 1．(2023·湖北武汉高三统考)三种限制酶MseⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是GAAT↓TAATTC、C↓TGCAG、G↓AATTC，图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。若要用如图质粒和外源DNA构建重组质粒，需要对质粒进行改造，构建新的限制酶酶切位点。在构建新的限制酶酶切位点的过程中需要使用的酶是(　　) A．限制酶PstⅠ、DNA聚合酶、DNA连接酶 B．限制酶EcoRⅠ、DNA聚合酶、DNA连接酶 C．限制酶EcoRⅠ、限制酶PstⅠ、DNA聚合酶 D．限制酶PstⅠ、限制酶EcoRⅠ、DNA连接酶 2．(2023·湖南师大附中三模)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接，构建多基因表达载体(载体中部分序列如下图所示)，利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述错误的是(　　) A．四个基因转录时不是都以DNA的同一条单链为模板 B．四个基因都在水稻叶绿体内进行转录翻译 C．应选用含潮霉素的培养基可筛选被农杆菌转化的水稻细胞 D．可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达情况 3．(2023·山东泰安二模)温和噬菌体侵染细菌后，将其基因组整合到细菌的基因组中，当细菌分裂产生子代细菌时，其子代DNA中都带有整合的噬菌体基因组，这会使细菌不会因噬菌体感染而裂解，此现象称为细菌的溶源化。下列说法错误的是(　　) A．细菌溶源化过程中发生了基因重组 B．温和噬菌体可以用作基因工程的载体 C．子代细菌中噬菌体基因的遗传遵循分离定律 D．可通过检测子代细菌的DNA探究是否发生溶源化现象 4．(2023·江苏省百校联考)PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正确的是(　　) A．该图表示PCR循环中的变性环节 B．引物的长度、引物中碱基的比例以及反应体系中引物的浓度都与扩增产物的特异性相关 C．脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到5′端 D．用图中引物扩增两个循环后可获得目的产物 5．(2023·湖南郴州一中校模拟预测)《诗经》中有“投我以木瓜，报之以琼瑶”的诗句。番木瓜易感染番木瓜环斑病毒(英文缩写为PRSV)而获病。我国华南农业大学的科研人员利用农杆菌转化法，成功培育出转基因番木瓜“华农一号”，大致流程如图所示。下列分析错误的是(　　) A．过程①称为逆转录，此过程中用到的酶有逆转录酶等 B．过程②用限制酶BamHⅠ在Ti质粒切开一个切口暴露出两个游离的磷酸基团 C．过程③将重组质粒转入农杆菌之前，需先用Ca2+载体处理农杆菌 D．过程⑤产生的木瓜植株即使有抗PRSV基因也不一定具有抗PRSV的性状 6．(2023·广东高三统考)采用CTAB法可获得高纯度的DNA，CTAB是阳离子去污剂，可溶解细胞膜，与核酸形成复合物，溶于乙醇。具体步骤：将植物叶片研磨成粉末，加入CTAB提取液(含CTAB、2 mol/L NaCl)，离心后，取上清液；上清液中加入氯仿、异戊醇混合液，充分混匀，离心取上清液，加入异丙醇于－20 ℃沉淀，再用RNA酶、95%的乙醇沉淀DNA；自然干燥后，加缓冲液溶解DNA后备用。下列说法错误的是(　　) A．CTAB-核酸复合物溶于高盐溶液中，可通过加乙醇使核酸沉淀并去除CTAB B．推测氯仿和异戊醇抽提可除去蛋白质、多糖等杂质，异丙醇或乙醇可将DNA沉淀分离 C．CTAB可通过加速解聚核蛋白用于提取叶绿体DNA和质粒DNA D．提取的DNA可在一定温度下利用二苯胺溶液鉴定 7．(2020·广东揭阳模拟)我国科学家屠呦呦因发现青蒿素而获得诺贝尔奖。青蒿细胞中青蒿素的合成途径如下图实线方框内所示，酵母细胞也能够产生合成青蒿酸的中间产物FPP(如虚线方框内所示)。科学家向酵母菌导入相关基因培育产青蒿素酵母菌。下列叙述正确的是(　　) A．过程①需要逆转录酶催化 B．培育产青蒿素酵母菌，必须导入FPP合成酶基因和ADS酶基因 C．由于ERG9酶等的影响，培育的产青蒿素酵母菌合成的青蒿素仍可能很少 D．在野生植物中提取青蒿素治疗疟疾，体现了生物多样性的间接价值 8．(2023·济南市三模)研究发现，MZF1-AS1是一种长链非编码RNA，可以和核蛋白PARP1结合参与基因的调控，从而促进肿瘤细胞的增殖。科研人员通过PCR技术得到PARP1基因全长序列(图1)，其编码的蛋白质含1 014个氨基酸，三个功能区(图2)，图中数字代表氨基酸对应的位置；构建含GST标签的重组载体以获得不同长度的融合蛋白。 (1)欲PCR扩增PARP1基因的编码区，需设计一对引物F1和R1，在图1中选出两引物与模板结合的位置________(填图中序号)，PCR反应体系中需要加__________酶，PCR产物一般通过__________法鉴定。 (2)为了得到GST-PARP1融合蛋白，需构建不同长度的带有GST标签序列的PARP1基因表达载体，GST序列尾端不能含有______________________的序列(不考虑移码突变)；纯化得到6种融合蛋白，分别与体外转录得到的生物素标记的MZF1-AS1进行体外结合实验，形成RNA—蛋白质复合物，该复合物可通过一定技术分离出来，将分离纯化获得的结合在复合物上的RNA，经RT-PCR后鉴定结果如图3所示，据图可知_________________________________________　 _____________________________________________________________________。 (3)研究发现，MZF1-AS1能促进转录因子E2F1与靶基因启动子结合，从而促进肿瘤细胞的增殖，MZF1-AS1和E2F1无直接相互作用，PARP1和E2F1有相互作用；将PARP1载体和E2F1载体共同转染5组细胞，细胞内E2F1含量相同。第1、4组不进行处理，第2、5组MZF1-AS1基因过量表达，第3组MZF1-AS1基因敲除处理。将5组细胞裂解，在第4、5组细胞裂解液中加入RNA酶，处理一段时间，然后分别在5组细胞裂解液中加入PARP1抗体得到沉淀，再分别利用E2F1抗体对上述沉淀中的蛋白质进行检测，结果如图所示，据图可知_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (4)综上所述，MZF1-AS1对肿瘤细胞的作用机理是_________________________ _____________________________________________________________________。 1 / 5 学科网（北京）股份有限公司 $$