2025届高三生物一轮复习课件发酵工程

发 酵 工 程 课标要求 获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础 阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提 举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物 阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术 概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法 概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法 概念： 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。 种类： ①按照物理性质可分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基。 ②按照成分的来源可分为天然培养基和合成培养基。 ③按照功能用途可分为选择培养基、鉴别培养基等。 琼脂（agar）是一种从红藻中提取的多糖。琼脂在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，在常规培养条件下呈现固态。 ※培养基 营养组成： 一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。 牛肉膏和蛋白胨来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。 例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。 液体培养基：培养基液体状，没加凝固剂，常用于大规模快速繁殖某种微生物。 固体培养基：培养基固体状，加了凝固剂（一般是琼脂）。包括“平板” 和“斜面”。 “平板”（菌落） 可用于分离、鉴定、活菌计数 “斜面”常用于菌种保存 合成培养基：化学成分完全清楚的培养基，一般用于实验室进行的、要求可重复性强的各项研究工作。 天然培养基：成分还不十分清楚或成分不恒定的天然有机物制成的培养基。成本较低，除了在实验室常用外，更多被用于大规模的生物发酵工业。 如：马铃薯蔗糖培养基、麦芽汁蔗糖培养基等。 选择培养基和鉴别培养基的比较 抑制不需要微生物的生长，促进需要的微生物的生长，从而提高对该菌的筛选效率 不能抑制不需要微生物的生长。 酚红鉴定分解尿素的菌，不能筛选。 单击此处编辑母版文本样式 选择培养基的常用设计方案 加入青霉素的培养基：分离酵母菌、霉菌等真菌。 加入青霉素、卡那霉素等抗生素的培养基：分离导入了目的基因的受体细胞。 加入高浓度食盐的培养基：分离耐盐的金黄色葡萄球菌。 不加氮源的无氮培养基：分离固氮菌。 不加含碳有机物的无碳培养基：分离自养型微生物。 加入氨基蝶呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基：分离杂交瘤细胞。 提醒：使用选择培养基对微生物进行筛选时，需设置对照实验，一般选择LB全营养培养基作为对照。 获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括以下几个方面： 1．对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。 2．将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 3．为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 4．实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 ※无菌技术 消毒是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 某些细菌（芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌，少数球菌等）在其生长发育后期，在细胞内形成的一个圆形或椭圆形，厚壁，含水量低，抗逆性强的休眠体构造，称为芽孢。 真菌孢子：真菌的主要繁殖器官。分为有性孢子和无性孢子两大类，前者通过两个细胞融合和基因组交换后形成，后者无此阶段而经菌丝分裂等形成。孢子在适宜条件下发芽，形成菌丝而进行分裂繁殖； 当外界环境不适宜时可以呈休眠状态而生存很长时间。   条件 结果 常用方法 应用范围 消毒 较为温和的物理或化学方法 仅杀死物体表面或内部的部分微生物 煮沸消毒法 日常用品 巴氏消毒法 不耐高温的液体 化学药剂消毒法 用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源 紫外线消毒法 接种室、操作台等 灭菌 强烈理化因素 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌法 接种工具 干热灭菌法 玻璃器皿、金属用具 高压蒸汽灭菌法 培养基及容器 注意： 〠无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还能有效避免操作者自身被微生物感染。 微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。请你选用其中的一种方法，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上纯化大肠杆菌。 微生物的接种技术还包括斜面接种、穿刺接种等方法。虽然这些技术的操作方法各不相同，但是，其核心都是要防止杂菌的污染，保证培养物的纯度。 斜面接种 穿刺接种 ※纯化大肠杆菌 （一）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落（colony）。 （1） （2） （3） 1．将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。 2．在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞。 3．将试管口通过火焰。 （4） （5） （6） （7） 4．将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液。 5．将试管口通过火焰，并塞上棉塞。 6．左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。 7．灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。 （4） （5） （6） （7） 平板划线法纯化大肠杆菌时不同阶段均需灼烧接种环但其目的有所差异。 ①第一次操作：杀死接种环上原有的微生物。 ②每次划线之前：杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。 ③划线结束后：杀死接种环上残存的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者。 注意： 〠在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高，杀死菌种。 　〠在做第二次以及其后的划线操作时，从上一次划线的末端开始划线，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 （二）稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。 分离、计数微生物——稀释涂布平板法 注意： 1.分离得到单菌落一般以培养皿中有20个以内菌落为宜。 2.计算微生物数量一般以培养皿中有30~300个菌落为宜。 l．将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 2．取少量菌液（不超过0.1mL），滴加到培养基表面。 3．将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8~10s。 4．用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。 1．显微镜直接计数 利用血球计数板（血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度个体小的细菌在显微镜下难以观察。 2．活菌计数法---稀释涂布法 使用稀释涂布法接种，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 每克样品中的菌株数 = （C÷V）×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。 实验室中微生物的筛选原理： 人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长要分离一种微生物。 方法： （1）抑制大多数微生物的生长（2）促进目的菌株的生长 结果： 培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。 （一）土壤取样 “微生物的天然培养基” 数量最大、种类最多 大约70％——90％是细菌 从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 1．取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2．应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。 3．在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 （二）配制土壤溶液和制备培养基 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基和牛肉膏蛋白胨琼脂培养基作对照。 （三）系列稀释 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。 分离不同的微生物采用不同的稀释度。 原因：不同微生物在土壤中含量不同。 目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。 （四）涂布平板 实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度培养物等。 如果得到了2个或2个以上菌落数目在30~300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。 （五）微生物的培养、观察及菌落计数 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。 细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d； 放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7d； 霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d。 在本实验中，我们可以每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 （五）微生物的培养、观察及菌落计数 菌落的特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。 （六）鉴定 1．酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌， 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红→脲酶阳性 2．伊红一美蓝培养基：鉴定大肠杆茵 原理：代谢产物与伊红—美蓝结合→菌落呈深黑色。 碳源、氮源、水、无机盐 PH、O2等 营养 条件 微生物的培养 分解尿素的细菌 微生物的分离 微生物的计数 显微镜直接计数 活菌计数法 选择培养基 实例 应用 平板划线法 稀释涂布平板法 接种 化学药物 紫外线 灼烧灭菌 干热灭菌 高压蒸汽灭菌 无菌技术 消毒 灭菌   果酒制作 果醋制作 泡菜制作 菌种 酵母菌 醋酸菌 乳酸菌 原理 无氧呼吸产生酒精 （1）O2、糖源充足：糖→醋酸 （2）有O2、无糖：乙醇→乙醛→醋酸 在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸。 发酵过程 有氧条件下，酵母菌通过有氧呼吸大量繁殖；C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O；无氧条件下，酵母菌通过无氧呼吸产生酒精。C6H12O6→2C2H5OH+6CO2 氧气、糖源充足时，产生醋酸和二氧化碳；C6H12O6+2O2→2CH3COOH+2CO2+2H2O；缺少糖源、氧气充足时，酒精转化为醋酸2C2H5OH+O2→2CH3COOH+H2O。 无氧条件下，将葡萄糖分解成乳酸。C6H12O6→2C3H6O3。 条 件 温度 酒精发酵18～25 ℃； 繁殖20 ℃左右 30～35 ℃ 26～36 ℃ 空气 前期：需氧后期：不需氧 需充足的氧气 无氧条件 时间 10～12 d 7～8 d 2d以内；或者10d以上 酵母菌 酵母菌——单细胞真菌 兼性厌氧菌 温度：20 ℃ 环境：生活在含糖较多的偏酸环境中 ※果酒的制作 发酵技术的应用 酵母菌 酵母菌发酵原理： 有氧条件下，酵母菌通过有氧呼吸大量繁殖；C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O； 无氧条件下，酵母菌通过无氧呼吸产生酒精。C6H12O6→2C2H5OH+6CO2 酵母菌 醋酸菌——细菌 好氧细菌 温度：30～35 ℃ 温度：充足的氧气下，才能进行旺盛的生理活动。 ※果醋的制作 酵母菌 醋酸菌果醋发酵原理： 氧气、糖源充足时，产生醋酸和二氧化碳； C6H12O6+2O2→2CH3COOH+2CO2+2H2O； 缺少糖源、氧气充足时，酒精转化为醋酸。 2C2H5OH+O2→2CH3COOH+H2O。 酵母菌 挑选葡萄 冲洗 榨汁 酒精发酵 果酒 醋酸发酵 果醋 无氧 18~25℃ 有氧 30~35℃ 7~8d 10~12d 酵母菌 乳酸菌——细菌 厌氧细菌 温度：26～36 ℃ 乳酸菌发酵原理： 无氧条件下，将葡萄糖分解成乳酸。 C6H12O6→2C3H6O3 ※泡菜的制作 酵母菌 泡菜的制作过程： （1）各种菜洗净并切成3～4cm长的小块。 （2）将泡菜坛洗净，并用热水洗坛内壁两次。 （3）将各种蔬菜、盐水、糖及调味品放入坛，混合均匀。如果希望发酵快些，可将蔬菜在开水中浸1分钟后入坛，再加上一些白酒。 （4）将坛口用水封好，防止外界空气进入。 （5）泡菜发酵如果加入一些已经腌制过的泡菜汁更好，这相当于接种已经扩增的发酵菌，可减少腌制时间。 酵母菌 注意：腌制过程中，要注意控制制的时间、温度和食盐的用量。温度过高、食盐用量不足10％腌制时间过短，容易造成细菌大量殖，亚硝酸盐含量增加。一般在腌制10天后，亚硝酸盐的含量开始下降。 $$