第3章 第2节 第2课时 将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定(Word教参)-【精讲精练】2024-2025学年高中生物选择性必修3（人教版2019 多选）

第2课时　将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 学习目标 1.阐明将目的基因导入受体细胞的方法 科学思维 2.阐明目的基因的检测与鉴定的方法 科学思维 3.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定 科学探究 一、将目的基因导入受体细胞 1．目的基因导入植物细胞 (1)花粉管通道法 (2)农杆菌转化法 2．目的基因导入动物细胞 3．目的基因导入微生物细胞 常用原核生物，使用最广泛的是大肠杆菌 二、目的基因的检测与鉴定 三、DNA片段的扩增及电泳鉴定 1．实验原理 (1)DNA片段的扩增 PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 (2)琼脂糖凝胶电泳 ①带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。 ②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 ③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 ④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 2．实验步骤 (1)DNA片段的扩增 (2)DNA片段的电泳鉴定 常用“荧光RT­PCR技术”进行检测甲流病毒感染，方法是取检测者的mRNA逆转录出cDNA，并大量扩增，同时用荧光标记的甲流病毒核酸探针来检测PCR产物中是否含有甲流病毒的cDNA。结合所学知识判断： (1)培育转基因动物时，常选择受精卵作为受体细胞，利用显微注射法将目的基因直接注入受精卵中(√) (2)将目的基因导入原核细胞时，通常用大肠杆菌作为受体细胞，并需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态(√) (3)常使用PCR等技术，从分子水平上检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或Bt基因是否转录出mRNA(√) (4)利用PCR扩增DNA片段时，在第一轮循环的变性之前，通常要用94 ℃的高温处理反应液5 min进行预变性(√) (5)PCR中离心的目的是让反应组分在离心管中分层分布(×) 探究点一　将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，探究下列问题： (1)重组Ti质粒的构建需要哪些酶的作用？ 提示　限制酶、DNA连接酶。 (2)在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入到Ti质粒的T­DNA上的原因是什么？ 提示　原因是农杆菌中的Ti质粒上的T­DNA(可转移的DNA)可转移至被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体DNA上。 (3)将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？ 提示　基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，利于重组质粒的导入。 (4)用什么方法检测目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA上？ 提示　PCR技术和DNA分子杂交技术。 (5)用什么方法检测目的基因是否发挥作用？ 提示　用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA；用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出相应蛋白质。 如果目的基因是抗虫基因，在个体水平上怎么检测？如果目的基因是耐盐基因呢？ 提示　如果目的基因是抗虫基因，则要进行抗虫接种实验；如果目的基因是耐盐基因，则要用一定浓度的盐水浇灌。 1．将目的基因导入不同细胞的方法 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法 显微注射法 Ca2＋处理法 受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞 转化过程 目的基因插入Ti质粒的T­DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 用Ca2＋处理细胞→处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→重组的基因表达载体导入细胞中 2.目的基因的检测与鉴定 1．(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 解析　若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确； 若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 答案　D 2．(不定项)土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T­DNA片段转入植物的基因组。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述不正确的是(　　) A．目的基因应插入T­DNA片段外，以防止破坏T­DNA B．用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞 C．Ti质粒是一种环状DNA分子，属于细菌的拟核DNA D．T­DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物的染色体 解析　在农杆菌转化法中，需要将目的基因插入到T­DNA片段上，A错误；农杆菌转化法中应直接利用土壤农杆菌感染植物细胞，B错误；Ti质粒是一种环状DNA分子，是存在于细菌拟核DNA之外的DNA，C错误；T­DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上，D正确。 答案　ABC 探究点二　DNA片段的扩增及电泳鉴定 利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，扩增获得的DNA片段需要进行分离、鉴定和纯化。自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按相对分子质量大小分离DNA的凝胶电泳技术已经发展成为一种分析鉴定DNA分子的重要实验手段。探究下列问题： (1)PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行严格灭菌，为什么？ 提示　避免污染使外源性DNA大量扩增，造成假阳性反应。 (2)将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应，程序应该怎样设定？ 提示　变性(94 ℃)→复性(50 ℃左右)→延伸(72 ℃左右)循环。 (3)判断是否成功扩增出DNA片段的依据是什么？如果没有成功应该从哪些方面分析？ 提示　一次成功的DNA片段扩增应该产生与预期大小一致的DNA片段。若出现与预期不一致的结果，可尝试从以下几个方面进行分析：模板DNA的制备、引物的质量与特异性、酶的质量以及PCR循环的条件。 (4)如果没有出现扩增条带，可能的原因有哪些？ 提示　模板DNA含有蛋白耐高温的DNA聚合酶的抑制剂(如蛋白酶K、苯酚、EDTA)；耐高温的DNA聚合酶失活；引物出现质量问题，浓度不合适；Mg2＋浓度过低；变性温度低，变性时间短；目的序列变异等。 实验注意事项 1．微量移液器不能超量程使用。使用一次性屏蔽式吸液枪头有助于防止吸取的液体流入微量移液器，从而减少实验过程中的交叉污染。 2．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 3．为保证加入反应体系中的各试剂体积的准确性，要按照加入体积的大小，由大到小依次加入各试剂，即最先加入无菌水。为保护酶的活性，一般最后加入耐高温的DNA聚合酶。 4．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 3．下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是(　　) A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存 C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化 D．在微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换 解析　在冰箱中放置的缓冲液和酶，取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化。 答案　C 4．(2024·吉林卷)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(　　) A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 解析　应根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，A正确；凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示电泳的进度，而不是指示DNA分子的具体位置，B错误；在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，在同一电场作用下，DNA片段(带负电)越长，DNA向正极迁移的速率越慢，C错误；凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 答案　A [课堂小结] [课堂巩固] 1．(2024·石嘴山期末)利用农杆菌转化法将目的基因转入受体细胞后，目的基因插入的位置是(　　) A．Ti质粒上 B．受体细胞染色体DNA上 C．T­DNA上 D．农杆菌的拟核 解析　植物基因工程中，可以用土壤农杆菌作为转移目的基因表达载体的工具，土壤农杆菌细胞内含有Ti质粒。农杆菌中的Ti质粒上的T­DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T­DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上，故选B。 答案　B 2．目前将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是(　　) A．显微注射法 B．农杆菌转化法 C．Ca2＋处理 D．花粉管通道法 解析　显微注射法是迄今为止转基因动物中采用最多、最有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法。 答案　A 3．利用苏云金杆菌的抗虫基因培育出的抗虫棉是否成功，需要检测(　　) A．是否能分离到目的基因 B．是否有抗虫的性状出现 C．是否有抗生素产生 D．目的基因是否得到表达 解析　能否分离出目的基因为基因导入是否成功的检测指标，A不符合题意；抗虫棉培育成功的标志是目的基因成功表达，且表现出抗虫性状，B符合题意，D不符合题意；抗虫棉是否表现抗虫性状与抗生素产生与否无关，C不符合题意。 答案　B 4．(不定项)利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，则下列说法错误的是(　　) A．需要已知目的基因的全部序列以便设计引物 B．共需2n－2个引物参与子代DNA分子的合成 C．应向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶、缓冲液等 D．理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占7/8 解析　只需要已知目的基因两端的序列便可设计引物，A错误；扩增循环n次，需一种引物的数量为2n－1，常规PCR共需两种引物的数量为2×(2n－1)＝2n＋1－2，B错误；不需向PCR的反应体系中加入解旋酶，C错误；理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占(24－2)/16＝7/8，D正确。 答案　ABC 5．(2024·中原名校联考)农杆菌转化法是植物基因工程的常用方法，如图为这种方法的示意图，回答下列问题： (1)一般情况下农杆菌不能侵染的植物是________，利用农杆菌自然条件下侵染植物的特点，能将目的基因导入植物细胞。具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T­DNA，它具有可转移至受体细胞并整合到受体细胞________上的特点，因此只要将目的基因插入________(部位)上即可。 (2)植物基因工程中将目的基因导入受体细胞除可采用农杆菌转化法之外，还可采用________等。 解析　(1)一般情况下，农杆菌不能侵染单子叶植物，但其可侵染双子叶植物和裸子植物。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T­DNA转移至被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T­DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞的染色体DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。(2)植物基因工程中将目的基因导入受体细胞除了可采用农杆菌转化法，还可采用花粉管通道法等。 答案　(1)单子叶植物　染色体DNA　Ti质粒的T­DNA　(2)花粉管通道法 学科网（北京）股份有限公司 $$