第3章 第2节 第1课时 目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建(Word教参)-【精讲精练】2024-2025学年高中生物选择性必修3（人教版2019 多选）

第2节　基因工程的基本操作程序 第1课时　目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建 学习目标 1.阐明基因工程的原理和基本操作程序 科学思维 2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物 科学探究 一、目的基因的筛选与获取 1．筛选合适的目的基因 2．利用PCR获取和扩增目的基因 (1)原理：DNA半保留复制 (2)PCR反应的条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 解旋酶(体外用高温代替) 打开DNA双链 (耐高温的)DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物(长度通常为20～30个核苷酸) 分为2种，分别与两条模板链结合，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 温度 控制温度使DNA复制在体外反复进行 缓冲液(含Mg2＋) 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活 (3)PCR扩增的过程(如图) (4)PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两条链的结合。　 二、基因表达载体的构建 1．基因表达载体构建的目的 让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 2．基因表达载体的组成 3．基因表达载体的构建过程 (1)首先用一定的限制酶切割载体。 (2)然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 (3)再利用DNA连接酶将含目的基因的DNA片段拼接到载体的切口处(如图所示)。 目的基因插入位点不是随意的。基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位。若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。　 聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。结合所学知识判断： (1)DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸(×) (2)PCR除需要耐高温的DNA聚合酶、解旋酶、4种脱氧核苷酸和DNA模板之外，还需要引物等基本条件(×) (3)每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，呈指数形式扩增(√) (4)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋(√) (5)终止子相当于一盏红色信号灯，使翻译在所需要的地方停下来(×) 探究点一　利用PCR获取和扩增目的基因 聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，下图为PCR扩增中第一轮的变化，探究下列问题： (1)什么是引物？如果在某基因组定位了一个目的基因X，但是其核苷酸序列未知，现已知X邻近区域的上、下游的部分DNA序列，此时如何设计引物？ 提示　引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸；虽然目的基因X的核苷酸序列未知，但X临近区域的上、下游的部分DNA序列已知，因此可根据X临近区域的上、下游已知序列设计引物。 (2)结合下图分析PCR过程中为什么需要引物？DNA链复制的方向是怎样的？ 提示　DNA聚合酶不能从头合成子链，只能把游离的脱氧核苷酸连接到已经存在的片段上。加入引物，能够使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。DNA链复制的方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 (3)PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在GC含量高时，对复性温度的设定有什么要求？说明理由。 提示　在引物的GC含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。 (4)在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因(可用相关图解解释)? 提示　第3轮，如图所示： 请从酶的角度分析PCR技术扩增DNA与DNA体内复制的不同点。 提示　①PCR技术扩增DNA不需要解旋酶；②PCR技术需要的DNA聚合酶应具有耐高温性。 1．生物体内DNA复制与PCR反应的比较 2．PCR中与引物有关的易错点 (1)设计引物的依据通常是目的基因两端的核苷酸序列。 (2)用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。若引物长度过短，则引物与模板链结合的特异性较差。 (3)两种引物需符合以下要求，否则引物失效，得不到扩增产物。 ①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对，否则会导致自身折叠； ②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对，否则会导致引物自连。 (4)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制酶的酶切位点，且常在两种引物设计上加入不同的酶切位点，主要目的是保证目的基因与载体的正向连接。 1．(不定项)(2024·邯郸调研)关于PCR技术的说法不正确的是(　　) A．PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 B．PCR过程中只需要两个引物分子 C．PCR的主要过程包括变性、复性、延伸，其中延伸阶段需要耐高温的DNA聚合酶 D．PCR过程中子链的延伸方向是从3′端到5′端 解析　PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，用于延伸子链，A正确；PCR过程中只需要两种引物分子，每条新的子链延伸都需要一个引物，B错误；PCR的主要过程包括变性、复性、延伸，其中延伸阶段需要耐高温的DNA聚合酶，C正确；PCR过程中子链延伸的方向是从5′端到3′端，D错误。 答案　BD 2．下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是(　　) A．二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端 B．二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋 C．体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量 D．二者遵循的碱基互补配对原则相同 解析　DNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA时，子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端，A正确；PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，在高温条件下氢键断裂，B错误；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量，但两者所需能量来源不同，C正确；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互补配对原则相同，D正确。 答案　B　　　　　　　　　　 探究点二　基因表达载体的构建 目的基因导入受体细胞之前，需构建基因表达载体，图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段，图中箭头表示相关限制酶的切割位点。探究下列问题： (1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为限制酶和DNA连接酶。 (2)用图中质粒和DNA构建基因表达载体时，不能使用SmaⅠ切割，原因是SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因。 (3)构建基因表达载体时，可用EcoRⅠ同时切割质粒和DNA，但会导致目的基因和质粒的自身环化、目的基因不能定向连接等问题，为避免以上问题出现，应使用BamHⅠ和Hind_Ⅲ(或EcoRⅠ和Hind_Ⅲ)两种限制酶。 (4)构建好的基因表达载体在目的基因前要加上启动子，其是RNA聚合酶识别和结合的部位。 (5)请简要描述基因表达载体的构建过程。 提示　用相同的限制酶分别切割载体和含目的基因的DNA片段，产生末端相同的切口，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。 限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 3．(2023·新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 解析　只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D错误。 答案　C 4．(不定项)如图是利用基因工程技术构建重组表达载体的过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶。下列相关叙述正确的是(　　) A．需要用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ来切割质粒 B．表达载体中的抗青霉素基因在受体细胞中能复制 C．表达载体中抗原基因的终止子位于抗青霉素基因的下游 D．表达载体中目的基因的上游有启动子 解析　限制酶SmaⅠ的识别序列位于目的基因中，因此表达载体构建时不能用限制酶SmaⅠ，应用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，A正确；表达载体中的抗青霉素基因在受体细胞中能稳定存在且能遗传给下一代，B正确；表达载体中抗原基因的终止子位于抗青霉素基因的上游，C错误；表达载体中目的基因的上游有启动子，是RNA聚合酶识别和结合的部位，D正确。 答案　ABD [课堂小结] [课堂巩固] 1．基因工程主要操作步骤的顺序是(　　) ①基因表达载体的构建　②将目的基因导入受体细胞　③目的基因的检测与鉴定　④目的基因的筛选与获取 A．③②④① B．②④①③ C．④①②③ D．③④①② 解析　基因工程的主要操作步骤顺序是：④目的基因的筛选与获取→①基因表达载体的构建→②将目的基因导入受体细胞→③目的基因的检测与鉴定。 答案　C 2．下列关于PCR反应体系中所加物质作用的叙述，错误的是(　　) A．耐高温的DNA聚合酶用于催化DNA子链的合成 B．引物使Taq DNA聚合酶能从引物的5′端延伸DNA链 C．目标DNA的双链用作合成DNA复制的模板 D．四种脱氧核苷酸为PCR提供原料 解析　在复制时，引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，因此DNA合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，B错误。 答案　B 3．肿瘤坏死因子(TNF)在体内和体外均能杀死某些肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞的增殖，科研人员欲大量生产TNF，用于临床上疾病的治疗。已知HindⅢ、BamHⅠ、BglⅡ和Pst Ⅰ为限制酶，且识别的序列均不相同。关于基因工程中重组质粒构建的说法，正确的是(　　) A．可选用Pst Ⅰ、BglⅡ和HindⅢ、BglⅡ两种组合切割质粒和目的基因 B．可用DNA连接酶或DNA聚合酶连接TNF基因和切割开的质粒 C．启动子指的就是起始密码子，可驱动TNF基因的转录过程 D．四环素抗性基因属于标记基因，便于鉴别受体细胞中是否含有目的基因 解析　据图可知，限制酶Pst Ⅰ 切割质粒时，会将质粒切成两段，而且会破坏标记基因，因此不能选用Pst Ⅰ、Bgl Ⅱ这一组合，A错误；不能使用DNA聚合酶连接目的基因和切割开的质粒，应使用DNA连接酶，B错误；起始密码子位于mRNA上，启动子是一段具有特殊序列的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的位点，可驱动TNF基因的转录过程，C错误；四环素抗性基因属于标记基因，便于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，D正确。 答案　D 4．右图是基因工程主要技术环节的一个基本步骤，这一步需用到的工具是(　　) A．DNA连接酶和解旋酶 B．DNA聚合酶和RNA聚合酶 C．DNA聚合酶和限制性内切核酸酶 D．限制性内切核酸酶和DNA连接酶 解析　题图表示基因表达载体的构建过程，该过程首先需要用限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和质粒，其次还需要用DNA连接酶将目的基因和质粒连接形成重组质粒。综上分析，D正确。 答案　D 5．(不定项)(2024·太原五中调研)下列有关基因表达载体的叙述，正确的是(　　) A．具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增 B．具有启动子，使DNA聚合酶识别并开始转录 C．具有标记基因，有利于鉴别受体细胞中是否含有目的基因 D．具有目的基因，以产生特定的基因产物 解析　基因表达载体中具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增，A正确；基因表达载体中具有启动子，使RNA聚合酶识别并开始转录，B错误；标记基因的作用是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，所以基因表达载体中具有标记基因，有利于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，C正确；基因表达载体中应具有目的基因，以产生特定的基因产物，D正确。 答案　ACD 学科网（北京）股份有限公司 $$